方 法分离获得单个核细胞（PBMCs)。
[0066] (2)PBMCs洗三次后，采用含有0. 6体积％的人自体血清的NKT细胞培养基 GT-T551调整细胞终浓度为2X IO6个细胞/mL ;将细胞接种于预先经过终浓度为10 μ g/mL 的retronectin包被的75cm2细胞培养瓶中。然后在培养基里加入终浓度为500U/mL的重 组人白介素2、50ng/ml⑶3单克隆抗体和50ng/mL的重组人白介素-15,在37°C、饱和湿度 为5%的0) 2培养箱中培养。
[0067] (3)培养第4天，将细胞转移至未包被的培养瓶中，每2天按照细胞生长数量加入 NKT细胞培养基GT-T551，控制细胞浓度为I X IO8个细胞/mL，并加入终浓度为500U/ml的 重组人白介素2 ;培养至第12天，得到NKT细胞，流式细胞术对NKT细胞表型进行分析。结 果见图 1，其中 CD3+:95. 04% ;CD3 +CD8+:90. 99% ;CD3 +CD56+:24. 12% ;CD8 +CD56+:24. 63%。
[0068] 实施例2慢病毒表达载体pWPT-CD33ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ的构建
[0069] (I) NKT 细胞 cDNA 的制备
[0070] 离心沉淀实施例1培养得到的NKT细胞，用总RNA提取试剂盒RNAiso Reagent提 取细胞的总RNA，-80°C保存备用。提取的总RNA用逆转录试剂盒RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录得NKT细胞cDNA，-20°C保存备用。
[0071] (2)慢病毒质粒 pWPT-CD8-CD137-CD3 ζ 的制备
[0072] 设计并合成如下引物序列（其中，下划线标记为保护碱基，方框为酶切位点）：
[0074] 以步骤⑴中NKT细胞cDNA为模板，用引物Pl和Ρ2进行PCR扩增，得到长287bp 的⑶8的hinge区和跨膜区，核苷酸序列如SEQID NO. 3所示，两端分别含有MluI和Bgl II 酶切位点和保护碱基；用引物P3和P4进行PCR扩增，得到长146bp的CD137胞内信号结构 域，核苷酸序列如SEQID NO. 4所示，两端分别含有Bgl II和EcoRI酶切位点及保护碱基；用 引物P5和P6进行PCR扩增，得到长359bp的⑶3 ζ的胞内信号结构域，核苷酸序列如SEQID NO. 5所示，两端分别含有EcoRI和Sail酶切位点及保护碱基。各步PCR扩增反应体系相 同，以扩增⑶137胞内信号结构域为例，进行PCR扩增，PCR反应条件参照Pri.meSTAR'K> HS DNA Polymerase的说明书，反应体系（50 μ L)如下：
[0075] 双蒸水：32. 5 yL
[0076] 5 X 反应 buffer : 10 μ L
[0077] dNTP 混合物（每种 2. 5mM) :4 μ L
[0078] Ρ3 (IOmM) :1 yL
[0079] P4(IOmM) :1 yL
[0080] NKT 细胞 cDNA (200ng/ul) : 1 μ L
[0081] PrimeSTAR li HS DNA Polymerase ：0. 5 μ L
[0082] 将上述PCR产物用I %的琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进 行DNA片段回收。得到片段后分别进行双酶切反应，酶切产物用普通DNA产物纯化试剂盒 回收备用。
[0083] 慢病毒表达载体pWPT-GFP用Mlul/SalI双酶切，酶切产物经1 %的琼脂糖凝 胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收大的载体片段，然后与之前回收的CD8、 CD137、CD3 ζ片段通过T4DNA连接酶连接，连接产物转化Transl-TlPhage Resistant化 学感受态细胞，37°C培养16h后挑取单克隆，37°C，250rpm培养12h后用质粒小提试剂盒 提取质粒。提取的质粒经限制性内切酶MluI和Sail双酶切鉴定，鉴定电泳图见图2,其 中，1泳道：DNA分子量标记D2000 ;2泳道：质粒pWPT-GFP的酶切片段（835bp) ;3泳道： 质粒pWPT-⑶8-⑶137-⑶3 ζ的酶切片段（756bp)。将鉴定正确的质粒送北京天一辉远 生物科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确的重组质粒命名为 PWPT-CD8-CD137-CD3 ζ 〇
[0084] (3)慢病毒质粒 pWPT-CD33ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 的制备
[0085] 全基因合成编码大鼠生长激素信号肽和⑶33ScFv融合基因的核苷酸序列，序列 如SEQID NO. 8所示，由北京天一辉远生物科技有限公司合成，其5'端含有BamHI、kozak序 列，3'端含有MluI酶切位点，将前述融合基因克隆在质粒pGSI中，命名为pGSI-CD33ScFv。 质粒经BamHI/MluI双酶切，酶切产物经1 %琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试 剂盒回收目的片段备用。
[0086] pWPT-⑶8-⑶137-⑶3 ζ质粒经限制性内切酶BamHI/MluI酶切，酶切产物经1 % 琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体片段备用。然后与回收 的含有大鼠生长激素信号肽和CD33ScFv的DNA片段通过T4DNA连接酶进行连接，具体 方法见说明书。将连接产物转化Transl-TlPhage Resistant化学感受态细胞，37 °C培 养16h后挑取单克隆，37°C，250rpm培养12h后，用质粒小提试剂盒提取质粒。提取的 质粒经限制性内切酶BamHI/Sall双酶切鉴定，鉴定结果如图3所示，其中，Ml :DNA分 子量标记 D2000 ;1 泳道：质粒 pWPT-CD33ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ 的酶切片段（1572bp); 2泳道：质粒pWPT-CD8-CD137-CD3 ζ的酶切片段（774bp) ;3泳道：质粒pWPT-GFP的 酶切片段（853bp) ;M2:DNA分子量标记D15000。将鉴定正确的质粒送北京天一辉远生 物科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确的重组质粒命名为 pWPT-⑶33ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ，其结构示意图如图4所示，其中包括大鼠生长激素信号 肽（核苷酸序列如SEQID NO. 6所示）、抗⑶33单链抗体（核苷酸序列如SEQID NO. 7所 示）、CD8的hinge区和跨膜区及CD137的胞内信号结构域和CD3 ζ的胞内信号结构域，其 中，该嵌合抗原受体以基因 CD8的hinge区和跨膜区及CD137和CD3 ζ的胞内信号结构域 串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQID NO. 9所示，对应的基因编码序 列如SEQID NO. 10所示。
[0087] 实施例3嵌合抗原受体CD33ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ修饰的NKT细胞的制备
[0088] (1)慢病毒的包装和浓缩
[0089] 用分光光度计分别测定慢病毒表达质粒pWPT-CD33ScFv-CD8-CD137-CD3 ζ和 辅助质粒psPAX2、pMD2.G的浓度，三种质粒以4:2:1的质量比用Lipofectamine?2000 Transfection Reagent转染试剂共转染293T包装细胞。分别在转染48h、72h时收集病毒 上清于50mL EP管中，4°C，2000g离心10min，转移两次得到的上清至新EP管中，用4. 5 μπι 滤器过滤病毒上清；过滤的病毒上清与5XPEG6000-NaCl按照4:1的体积比混匀，4°C静置 2h，然后4°C，1000 Og离心20min，弃上清，沉淀用ImL的4°C预冷的无菌PBS溶解，即得嵌合 抗原受体的病毒浓缩液，按每管100 μ L进行分装，-80°C保存备用。
[0090] 按照上述方法，利用慢病毒表达质粒pWPT-GFP和辅助质粒psPAX2、pMD2. G共转染 293T包装细胞，收集病毒上清，浓缩，获得表达GFP绿色荧光蛋白的慢病毒浓缩液。
[0091] (2)慢病毒感染NKT细胞及感染后细胞的扩增培养
[0092] 取实施例1的在75cm2培养瓶中培养的I X 10 7个NKT细胞，弃掉旧的培养液，加入 2mL新鲜NKT细胞培养基GT-T551、200 μ L步骤（1)得到的病毒浓缩液、2 μ L I X 10 6mg/mL 鱼精