专利名称：分离的纯合干细胞,由其衍生的分化细胞,以及制备和使用上述细胞的材料和方法
I.发明领域本发明公开了多能纯合干(HS)细胞及制备所述细胞的材料和方法。本发明还提供用于使HS细胞分化成祖细胞或其他所需细胞、细胞群或组织的方法。此外，在此公开的HS细胞可用于诊断和治疗多种疾病，例如，遗传疾病，神经变性疾病，内分泌相关的紊乱和癌症，创伤，并可用于美容和治疗性移植，以及基因治疗和细胞替代治疗。
II.发明背景及现有技术的描述1981年，Evans和Kaufman描述了从小鼠胚泡分离胚胎干(ES)细胞系的技术。“Establishmentin Culture of pluripotent CEllsfror Mouse Embryos，″Nature 292154-6(1981)。在这一过程中，使用内细胞团(ICM)产生保持未分化和多能的细胞系，即能发育成任意细胞类型的细胞。随后在其他动物模型包括鸡(Pain等，Development1222339-48(1996))，仓鼠(Doetschmann等，Dev.Biol.127224-7(1988))，猪(Wheeler等，Reprod.Fertil.Dev.6563-8(1994))，狨猴(Thompson等，Biol.Reprod.55254-9(1996))，及恒河猴(Thompson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844-8(1995))中生产出了ES细胞系。
Saito等，Roux′s Arch.Dev.Biol.，201134-141(1992)报道了牛胚胎干细胞样细胞系，其可存活三代，但在第四代后失去。另外，Handyside等，Roux′s Arch.Dev.Biol.，196185-190(1987)公开了在允许分离由小鼠内细胞团(″ICM″)衍生的小鼠ES细胞系的条件下，对免疫外科分离的绵羊胚胎内细胞团的培养。其进一步报道，在这种条件下绵羊ICM附着、扩散并发育成ES细胞样和内胚层样细胞区域，但延长培养后仅内胚层样细胞可见。同前。
早先已确证，在体内将ES细胞注射到小鼠胚泡中后，其掺入受体胚胎的ICM中并发育成多种不同的组织类型，包括生殖细胞系。Stewart等，″Stem Cells from Prifaordial Germ Cells Can Reenterthe Germ Line，″Dev.Biol.161626-8(1984)。还可参见Bradley等，Nature 309255-256(1984)。
最近，Cherny等，Theriogenology，41175(1994)报道了在长期培养下保持的多能牛原始生殖细胞衍生的细胞系。在培养了约7天后，所述细胞产生出碱性磷酸酶(AP)染色阳性的ES样集落，表现出形成胚胎体的能力，并自发地分化为至少两种不同的细胞类型。还有报道称这些细胞表达转录因子OCT4，OCT6和HES 1的mRNA。
Campbell等，Theriogenology，43181(1995)(摘要)报道了从经培养的来自第9天的绵羊胚胎的胚盘(ED)细胞通过核转移产生活的小羊，其是在促进小鼠ES细胞系分离的条件下培养的。基于上述结果，作者得出了下述结论，即由第9天的绵羊胚胎分离的ED细胞经核转移后是全能的，且这种全能性可在培养过程中保持多达3代。Campbell等，Nature，38064-68(1996)进一步报道了由经培养的细胞系通过核转移进行的绵羊克隆。
Van Stekelenburg-Hamers等，Mol.Reprod.Dev.，40444-454(1995)，报道了对来自牛胚泡ICM细胞的所谓永久细胞系的分离和表征。作者在不同条件下分离并培养了来自8或9天的牛胚泡的ICM以确定哪种饲养细胞和培养基对支持牛ICM细胞的附着和生长最有效。他们认定，基于他们所获得的结果，培养的ICM细胞的附着和生长可通过使用STO(小鼠成纤维细胞)饲养细胞(而非牛子宫上皮细胞)和炭萃取的血清(而非正常血清)添加到培养基中得以有效地增强。Van Stekelenburg等报道，与多能ICM细胞相比他们的细胞系更类似于上皮细胞，同前。
Smith等，1994年10月27日公开的WO 94/24274，Evans等1990年4月5日公开的WO 90/03432和Wheeler等1994年11月24日公开的WO 94/26889报道了据称可能在获得转基因动物中使用的动物干细胞的分离、筛选和繁殖。此外，Evans等，1990年4月5日公开的WO 90/03432，报道了来自猪和牛的所谓多能胚胎干细胞衍生以产生转基因动物。而且，Wheeler等，1994年11月24日公开的WO 94/26884公开用于产生嵌合转基因有蹄动物的胚胎干细胞。
也有有关使用有蹄动物ICM细胞进行核移植的报道。例如，Collas等，Mol.Rep rod.Dev.，38264-267(1994)公开了一种将裂解的供体细胞微注射到去核成熟卵母细胞中的牛ICM核移植技术。该文献公开了，将胚胎在体外培养7天以产生15个胚泡，将其转入牛受体中导致4例受孕2例分娩。另外，Keefer等，Biol.Reprod.，50935-939(1994)，公开了用牛ICM作为核转移过程中的供体核以产生胚泡，将其移植到牛受体中后产生了多例活的子代。再有，Sims等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，906143-6147(1993)公开了将短期体外培养的牛ICM细胞的核转移到去核成熟卵母细胞来产生小牛。
也有关于通过短期培养的胚盘细胞(多达三代)的核转移产生活的小羊的报道。(Campbell等，Theriogenology，43181(1995))。另外也有报道将牛多能胚胎细胞用于核转移并产生嵌合胎(Stice等，Theriogenology，41301(1994))。
最近，Cibelli等，转让于Advanced Cell Technology的2001年4月26日公开的WO 01/29206，公开了使分离自胚泡内细胞团的哺乳动物，包括人的ES细胞分化以产生同基因的、异基因的和/或异种移植细胞或器官的方法。但是，其所公开的由受精胚胎建立的干细胞不同于本发明。而且ACT的研究人员由未受精胚胎建立干细胞系的努力失败了，参见2001年11月26日出版的华盛顿邮报，″First HumanEmbryos Are Cloned in US″。
基于上文，显然许多研究组都已试图制造ES细胞系。ES细胞受到关注主要是由于ES细胞是多能的，并能产生成熟的、分化的和功能性的细胞。ES细胞除有希望的治疗前景和预防应用外，对ES细胞的使用也引发了许多有关伦理的问题。如前所述ES细胞来自卵母细胞受精后产生的胚泡。因此，ES细胞天然地来源于或收获于可能存活的胚胎，而所建立的胚胎将被特意破坏。
而且还存在与ES细胞的使用或发育相关的技术问题。例如，来自其他个体的ES细胞，如，当前存在的细胞系，移植到不相容的受体中将引起免疫反应，由体细胞核转移衍生的ES细胞系作为治疗用途不甚理想，这是由于在核供体一生中所需的遗传突变将带入到所述多能细胞系中。
但是，由于包括ES细胞的多能细胞具有治疗性用途，可用以治疗遗传疾病，神经变性疾病和癌症，例如修复或复原受损神经功能，或作为替代组织或器官的来源，因此非常有用。鉴于多能细胞具有产生种系嵌合体或将其基因组传递到下一世代的能力，还可将其用于发育生物学和移植疗法研究。
本领域需要开发其他来源的多能细胞。本发明即提供了一种这样的来源。在一个实施方案中，本发明提供了由通过下述步骤产生的胚泡样团分离的纯合干(HS)细胞(a)将两个卵母细胞或两个精子细胞融合；(b)在卵子发生过程中阻止第二极体挤出；(c)在适当的条件下允许第二极体挤出和自发的基因组自我复制；或，(d)将两个单倍体卵或精子核转入去核卵母细胞。或者，使用方法(a)或(d)时利用基因型分析筛选纯合干细胞。
本发明的HS细胞是多能的，并且由于它们是从未受精的且不能发育成存活胚胎的细胞团分离的，所以不涉及伦理问题。此外，当杂合ES细胞系应用于组织或细胞移植治疗、或者在文库和/或保藏中心中保存时很难实现免疫组织相容性匹配。这是因为所述的ES细胞系，包括由Advanced Cell Technology或其他组织开发的细胞系都是来自于受精的胚胎或通过核转移技术利用成人的已分化细胞获得的，都是基因组杂合的。由于本发明的多能干细胞是纯合的(极低的杂合性或均一的纯合性)，这种细胞可用于克服目前应用ES细胞系的移植、细胞替换，和基因治疗技术，或维持ES细胞系和/或保藏物中所遇到的免疫组织相容性问题。
在配子形成过程中，杂合的生殖细胞，即带有父本和母本染色体的生殖细胞进行减数分裂。在第一次减数分裂(减数分裂I)中，同源染色体分离，形成两个含有父本或母本的染色体的杂合子细胞，由于交换现象的存在向子细胞中引入了一定程度的杂合性。并且，在卵子发生过程中，观察到一个子细胞(第一极体)的挤出。另一个子细胞在中期II停顿。这种中期II二倍体卵母细胞可用于衍生带有极低杂合性的纯合干细胞。
适当的激活后，中期II卵母细胞可通过挤出染色单体(即所谓第二极体)之一而继续完成减数分裂，并产生单倍体细胞。这种减数分裂完成后的单倍体卵母细胞可在无胞质分裂下自我复制形成二倍体并且均一地纯合。因此，这些完成了减数分裂的单倍体卵母细胞可用于构建本发明的无杂合性的纯合干细胞。参见Kaufman M.H.，RobertsonE.J.，Handyside A.H.，Evans M.J.，″Establishment ofpiuripotential cell lines from haploid mouse embryos，″J.Embryol.Exp.Morphol.，73249-61(1983)。
带有极低杂合性的及均一纯合的HS细胞均优于杂合ES细胞(如来源于受精胚胎胚，治疗性克隆胚胎和成人干细胞的)，其中纯合干细胞可包含两套相同的主要组织相容性复合体(MHC)单倍型。因此，易于利用ES细胞实现供体和需要移植治疗的个体间的免疫组织相容性匹配。这种对于一个MHC单倍型纯合的干细胞不仅可被带有相同单倍型的受体所耐受，也可被任一亲本单倍型带有相同MHC成分的受体所耐受。
而且，人MHC基因座在6号染色体上4Mb内，并且MHC等位基因通常全部一起遗传。一些MHC等位基因组合在人群中以相当高的频率共有，例如21.3％白种美国人共有15种最常见的HLA-A，-B，-DR单倍型，在其他的种族背景下也观察到类似的单倍型频率Mori，M.，等，″HLA gene and haplotype frequeizcies in the North Americanpopulationthe National Marrow Donor Program DonorRegistry，″Transplantation，64(7)1017-27(1997)。考虑到这种现象支持这种连锁不均衡，利用未受精的减数分裂I后的二倍体配子衍生的HS细胞可减少需要在干细胞库或组织或细胞移植物保藏库中维持的免疫差异细胞系的数量。
因此，可能仅几百个对于不同单倍型为纯合的干细胞系即足以与所述人群中的大部分相匹配。这一数量与维持由胚胎干细胞，成人干细胞，或治疗性克隆干细胞衍生的干细胞库或保藏库所需的单倍型数量相比要少得多。例如，每200个单倍型即存在20,000多种杂合的可能性。
由此，在本发明的一个实施方案中提供了对于MHC基因座和一个野生型(正常的)基因为纯合的干细胞，其可由与受体相关的雌性供体的未受精的卵母细胞衍生而来，该干细胞用以治疗遗传性疾病，如血友病，糖尿病，亨廷顿氏舞蹈病等。从本发明的HS细胞中排除异常(引起疾病的)等位基因的优越性并不能由目前可得的ES细胞系实现。
畸胎瘤属良性肿瘤，由多种组织元件组成，提示是三个胚层中的任意一层的正常衍生物。天然发现的畸胎瘤来源于二倍体全能细胞，典型的是未受精的生殖细胞，这种生殖细胞具有分化成代表三个胚层一外胚层，中胚层，和内胚层中任意一层的元件的能力。有关畸胎瘤起源的科学理论包括不完全对裂(twinning)，隐蔽的全能裂球或原生殖细胞的瘤形成性增殖，体细胞核中的全能种属信息脱抑制和生殖细胞的孤雌生殖发育。
天然存在的自发畸胎瘤是二倍体，偶尔呈多倍体(Surti等，Am.J.Hum.Gene.47635-643(1990))。据认为，二倍体畸胎瘤组织出现在减数分裂I后，或由于第二极体与卵融合而发生(Eppig和Eicher，Genetics，103797-812(1983)；Eppig和Eicher，J.Hered.，79425-429(1988))。另外，已证明畸胎瘤在杂合宿主中通常是纯合的(Linder，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，63699-704(1969)；Linder和Power，Ann.Hum.Genet.3421-30，(1970)；Linder等，Nature，254597-598(1975)；Kaiser-McCaw等，Cytogenet.Cell.Genet.，16391-395(1975))。但后续研究中未能持续再现所述结果(Surti等，Am.J.Hum.Gene.，47635-643(1990)；Carritt等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，797400-7404(1982)；Parrington等，J.Med.Genet.，211-12(1984)；Deka等，Am.J.Hum.Genet.，47644-655(1990)；Dahl等，Cancer Genet.Cytogenet.，46115-123(1990))。
与其他肿瘤相比，畸胎瘤表现出独特的组织学特征。它们由多种分化组织组成，包括如表皮，中枢神经组织或成熟的软骨等组织。它们也包含非特异的组织类型，如淋巴组织或纤维基质。″干质(干质)″是新派生出的术语，用以描述HS细胞移植到宿主时发育成的团。与畸胎瘤不同，尽管干质包含来自三个胚层的细胞，但表现为受控生长。由此，可将其用作本发明的HS细胞在体内分化的工具。
显然本领域需要能定向分化的干细胞的可靠来源。本发明通过提供无需受精过程的纯合干细胞来满足这一要求。本发明公开了由未受精减数分裂I后的二倍体生殖细胞衍生的纯合干(HS)细胞。利用本领域常用的体外受精技术，从个体供体中收获的供体细胞可以被诱导形成胚泡样团，由此可衍生出本发明的HS细胞，这种HS可分化成任何细胞类型，细胞群或组织类型。进而，接下来用HS-衍生的分化细胞和/或组织可进行诊断和治疗，特别是细胞替代治疗和基因治疗，以及用于美容和/或治疗性移植。而且，所述的用途仅是示例性的并非穷举。
III发明简述本发明涉及制备分离的纯合干(HS)细胞，并发现这些细胞具有以定向和可预测的方式进行分化的独特的性质。以此方式，HS模拟ES细胞，但无需受精过程或获取胚胎组织。
本发明的一个目的在于提供新的改进的制备分离纯合干细胞的方法，所得的干细胞可用作细胞治疗和产生移植用细胞，细胞团，组织和器官的来源。
本发明的一个目的在于提供分离的纯合干(HS)细胞。本发明进一步的目的是提供由动物供体物质衍生的HS细胞，所述的动物包括下述种哺乳动物，鸟，鱼，两栖动物和爬行动物。在一个优选的实施方案中所述的动物是哺乳动物，更优选人。由从供体回收的未受精减数分裂I后的二倍体生殖细胞衍生HS细胞，其中可利用现有的或未来开发的体外受精技术获得供体细胞。
本发明的另一个目的在于提供由通过下述步骤产生的胚泡样团分离的纯合干(HS)细胞(a)将两个卵母细胞或两个精子细胞融合；(b)在卵子发生过程中阻止第二极体挤出；(c)在适当的条件下允许第二极体挤出和自发的基因组自我复制；或，(d)将两个单倍体卵或精子核转入去核卵母细胞。或者，使用方法(a)或(d)时利用基因型分析筛选纯合干细胞。
本发明的又一目的在于提供由未受精的减数分裂I后的二倍体生殖细胞衍生纯合干细胞的方法。优选地，通过下述方法衍生HS细胞，即在卵子发生过程中阻止第二极体挤出，或在适当的条件下允许第二极体挤出和所述单倍体卵母细胞的自发基因组自我复制，从而产生胚泡样团，再从所述胚泡样团中提取HS细胞。
通过激活未受精减数分裂I后的二倍体生殖细胞构建的HS细胞在移植到活的动物后形成干质。本发明的另一个目的是从所述的干质中在不同发育阶段分离HS细胞。本发明的又一目的在于提供由所述的干质中筛选待分离的细胞的方法。
本发明的又一目的在于提供一种构建所需细胞、细胞群或组织的方法，该方法包括在适当的条件下指导上述分离的HS细胞分化以便形成所需的细胞、细胞群或组织。本发明进一步的目的在于提供由HS细胞分化的细胞，并利用所述细胞进行治疗和/或诊断。举例来说，所述的组织包括但不限于上皮组织，结缔组织，肌肉组织或神经组织。
举例来说上皮细胞的类型包括但不限于角质化上皮细胞；湿复层屏障上皮细胞；内衬上皮细胞；外分泌上皮细胞；内分泌上皮细胞；胞外基质分泌上皮细胞；吸收性上皮细胞，例如肠，外分泌腺和泌尿生殖道的上皮细胞；和收缩性上皮细胞。举例来说，结缔组织细胞包括但不限于胞外基质分泌细胞；为代谢和贮存特化的细胞；及血液和免疫系统循环的细胞。举例来说，肌细胞包括但不限于收缩细胞和具有推进功能的纤毛细胞。举例来说，神经或感觉细胞包括但不限于a)感觉传导器；b)自主神经元；c)感觉器官的支持细胞；和d)周围神经元，及中枢神经系统的神经元和神经胶质细胞。举例来说，生殖细胞类型包括但不限于生殖细胞和抚育细胞。
本发明更具体的目的在于提供诱导由HS细胞衍生的细胞分化成多能祖细胞的新方法，所述的祖细胞可用作诊断、治疗，例如细胞治疗、基因治疗的细胞来源，以及产生用于移植的细胞、细胞团、组织和器官的细胞。这些用途仅是示例性的，并非穷例。
本发明的一个目的在于提供改进的方法以产生由HS细胞衍生的遗传工程化的祖细胞，所述的祖细胞可用作诊断、治疗，例如细胞治疗、基因治疗的细胞来源，以及产生用于移植的细胞、细胞团、组织和器官的细胞。这些用途仅是示例性的，并非穷例。在一个优选的实施方案中，在被导致进一步分化成祖细胞的HS细胞中可将所需基因插入、去除或修饰。在进一步的实施方案中，可使祖细胞自身发生遗传改变并进一步培养以产生遗传改变的祖细胞集落。
本发明的又一目的在于提供由HS细胞衍生的祖细胞，优选人祖细胞。在一个实施方案中，这些祖细胞被诱导分化成细胞、细胞群、组织和/或器官。另外，本发明的目的还在于利用这些祖细胞培养治疗和/或诊断用的分化细胞和/或组织。
本发明的一个特定的目的在于提供治疗或诊断疾病的祖细胞，优选人祖细胞，在所述疾病中，细胞、组织或器官移植，基因治疗和/或细胞治疗对治疗或诊断有益。本发明的HS细胞、祖细胞和/或分化细胞可在种内应用也可在种间应用。
本发明的HS和祖细胞，以及进一步分化的HS和祖细胞可由相同、相关或不相关的哺乳动物，优选人的卵细胞或精子构建。
本发明的另一特定的目的在于将依照本发明在体内或体外产生的分化细胞用于细胞分化研究和试验目的，例如用于药物研究。
本发明的又一目的在于提供疾病状态模型，用于利用由分离的HS细胞产生的经遗传修饰的HS细胞、细胞群、组织或器官研究或诊断疾病。
本发明的另一目的在于通过原位或体外制备适当的来自于分离的HS细胞的替代细胞、细胞群或组织或器官来治疗失调或疾病的方法。举例来说，所述的失调或疾病包括但不限于创伤(如，创伤后修复和重建，肢体替换，脊髓损伤，烧伤等)和先天缺陷；细胞、组织和器官的病理和恶性状况(如癌症)；以及下列细胞和组织的退化或先天疾病，即肌肉(如肌肉萎缩，心脏病)，神经(阿尔茨海默病，帕金森氏病和多发性硬化等)，上皮(如失明，肌病，动脉粥样硬化和其他血管狭窄疾病，酶缺陷症，如克隆氏病，和激素缺乏症，如糖尿病)和结缔组织(如免疫疾病和贫血症)。HS衍生的细胞和组织可转移或移植到所需受试者，优选利用受试者自身的供体材料。
本发明的又一目的在于提供一种改进的诊断和移植、基因和/或细胞替代治疗的方法，该方法包括使用本发明制备的分化细胞产生的同基因的或同源的细胞，组织或器官的步骤。举例来说，所述的治疗包括对下述疾病和损伤的治疗，即帕金森氏病，亨廷顿氏舞蹈病，阿尔茨海默病，ALS，脊髓损伤，多发性硬化，肌肉萎缩，糖尿病，肝病，心脏病，软骨置换，烧伤，血管疾病，泌尿道疾病，以及免疫缺陷症，癌症的治疗和骨髓移植。
这些以及进一步的目的在下述的发明详述，实施例和权利要求部分予以充分描述。
IV.附图简述
图1卵母细胞孤雌生殖激活产物。
图2精子发生和卵子发生示意图。
图3卵母细胞的融合以及卵母细胞融合产物的发育。
图4卵母细胞孤雌生殖激活产物详述。
图5A由小鼠HS细胞衍生的集落形成单位(CFU)形态照片。
图5B由小鼠HS细胞衍生的红细胞形态照片。
图5C由小鼠HS细胞衍生的单核细胞形态照片。
图5D由小鼠HS细胞衍生的淋巴细胞形态照片。
图5E由小鼠HS细胞衍生的带有颗粒的造血细胞形态照片。
图5F由小鼠HS细胞衍生的带有颗粒的及单核造血细胞形态照片。
图6由小鼠HS细胞衍生的搏动肌细胞形态照片。
图7A由小鼠HS细胞衍生的胰腺细胞簇形态照片。
图7B由小鼠HS细胞衍生的胰岛素和高血糖素染色的胰腺细胞形态照片，其中胰岛素染色的呈褐色而高血糖素染色的呈红色。
图8A描述由人纯合减数分裂I后的二倍体卵母细胞衍生的桑椹胚样团的发育的照片。
图8B由人纯合减数分裂I后的二倍体卵母细胞衍生的早期胚泡样团照片。
图8C显示由人纯合减数分裂I后的二倍体卵母细胞衍生的内细胞团的胚泡样团的照片。
图8D在由人纯合减数分裂I后的二倍体卵母细胞衍生的饲养细胞层(D)上生长的分离的内细胞团照片。
图9A由小鼠HS细胞衍生的Nestin-阳性神经元前体细胞形态照片。
图9B由小鼠HS细胞衍生的酪氨酸羟化酶-阳性神经元细胞形态照片。
V.优选实施方案的详细描述此处引述的所有参考文献均全文引入作为参考。此处的任何内容均不应解释为对下述内容的承认，即本发明不能通过在先的发明先于所述公开内容，或现有技术提供了充分或足够的公开。在所有描述中，所述的优选实施方案均是示例性的，并非是对本发明的限定。
本发明提供了分离的纯合干(HS)细胞，生产HS细胞的方法，以及制备用于诊断，细胞治疗，基因治疗或作为为美容和治疗性移植提供组织和器官的细胞来源的分化细胞的方法。而且，上述的用途仅是示例性的而并非穷举。更具体地说，HS细胞是从由未受精减数分裂I后的二倍体生殖细胞衍生的胚泡样团分离得到的。
在过去，是通过长期培养受精胚泡的内细胞团衍生的细胞来获得胚胎干(ES)细胞。接下来对ES细胞进行培养和遗传修饰，并诱导分化以产生细胞，从而制备用于治疗的转基因动物或细胞。
本发明不同于现有技术中获得具有分化能力的多能细胞的方法，因为本发明提供了纯合的干细胞，并且所述干细胞是从未受精减数分裂I后的二倍体生殖细胞的有丝分裂激活所产生的胚泡样团中分离的。而且，可诱导由胚泡样团中分离的HS细胞分化，以获得分化的细胞或组织，多能祖细胞或作为永久性细胞系维持下来。需要时，可向本发明的HS细胞或祖细胞中引入遗传修饰。
因此，本发明提供多能HS细胞，多能祖细胞，和/或最终分化的细胞及其制造方法，其中，所述的细胞可用于多种治疗和诊断目的。
A.定义在本发明的上下文中应用下述定义。
″分化″是一种高度调控的过程，即细胞成熟为正常功能细胞所经历的过程。分化细胞具有显著的特性，其执行特定的功能并且进行分裂的可能性很小。与此相反，未分化的细胞是迅速分裂的未成熟的、胚胎或原始细胞，其没有特定的形状且具有多种非特异的活性和功能。
此处所用到的术语″干细胞″指相对未分化的细胞，其活跃地分裂和循环，对成熟的、分化的和功能细胞系产生适当的刺激。对所述干细胞所定义的性质包括(a)自身不是最终分化的；(b)可在动物一生中无限分裂；和(c)在其分裂时，每个子细胞可选择继续维持为干细胞或进入不可逆导致最终分化的过程。那些起初能力没有限定的(即能形成多种分化细胞类型)干细胞的称为″多能″。多能细胞的来源包括胚胎干(ES)细胞，胚胎癌(EC)细胞，由体细胞克隆产生的细胞，畸胎瘤和畸胎癌。
能够由三个胚层，即内胚层、中胚层和外胚层之一产生细胞的祖细胞系在本申请中称作“多能”。每一祖细胞系并非最终分化，而是可在动物的一生中继续分裂，认为其可仅由一种类型的胚层形成不同的组织或细胞。因此特定的祖细胞系可分化成骨，软骨，平滑肌，横纹肌和造血细胞(中胚层)；肝，原肠，和呼吸上皮(内胚层)；或神经元，神经胶质细胞，毛囊和齿芽(外胚层)。此处术语″祖细胞″与“多能干细胞”或“前体细胞”在使用中具有相同的意义。这种由HS细胞在体内或体外定向分化形成的祖细胞系可在培养物中作为永久细胞系维持(其中的术语“体内”包括通过下述方式诱导的分化，即在同基因的或异基因动物中将所述HS细胞装入胶囊，以由这些装入胶囊的的细胞产生干质)。
″畸胎瘤″通常出现在自发的异常细胞团中，包含多种类型的分化组织，由三个胚层衍生的组织，如骨、肌肉、软骨、神经、齿芽和腺上皮等，其与未分化的干细胞混合在一起，其中的干细胞可继续分裂产生更多的这些分化组织。
畸胎瘤可自发地形成在生殖系统中常见的包含来自全部三个胚层的细胞的肿瘤。此外，其以非调控生长为特征。″干质″是新近派生的术语，用以描述HS细胞移植到宿主中衍生出的物质。与畸胎瘤不同，干质虽然也包含来自三个胚层的细胞但表现为受控生长。因此，可将其用作在体内分化本发明的HS细胞的工具。
″畸胎癌″是继发于畸胎瘤。畸胎瘤大部分是良性的；但如果其变为恶性的，可发展为畸胎癌并使宿主致死。
″纯合干细胞″，先前称为″畸胎瘤干细胞″或″TS细胞″，是来自未受精减数分裂I后的二倍体生殖细胞的未分化干细胞。优选地，其是在卵子发生(或″激活″)的过程中阻止第二极体挤出，或在适当的条件下允许第二极体挤出和单倍体卵母细胞自发的染色体自我复制而形成的。纯合干细胞(HS)是通过由″有丝分裂激活″未受精减数分裂I后的二倍体生殖细胞发育的胚泡样团的内细胞团产生的分离细胞，其可通过下述步骤完成(a)将两个卵母细胞或两个精子细胞融合；(b)在卵子发生过程中阻止第二极体挤出；(c)在适当的条件下允许第二极体挤出和自发的基因组自我复制；或，(d)将两个单倍体卵或精子核转入去核卵母细胞。或者，使用方法(a)或(d)时利用基因型分析筛选纯合干细胞。
在哺乳动物发育过程中，卵裂产生一种薄壁的中空球，即“胚泡”，而胚通常适当表示为一端的细胞团，又称作″内细胞团″。所述的胚泡是在植入前形成的，相当于″囊胚″。薄壁的中空球的壁是指″滋养层″，是在哺乳动物胚泡周围形成的上皮组织的胚外层，将胚胎附着于子宫壁。所述的滋养层形成绒毛膜的外层，与母体组织一起形成胎盘。
在本发明中″胚泡样团″不同于″胚泡″(本领域中所用的)之处在于它是有丝分裂激活的未受精减数分裂I后的生殖细胞的产物。
此处所用的术语“有丝分裂激活的”指需要进行正常细胞有丝分裂的能力，包括卵母细胞孤雌生殖激活和精子细胞单雄生殖激活。依本申请的目的，有丝分裂激活的与孤雌生殖激活或单雄生殖激活同义。
此处所用的术语″纯合的减数分裂I后的二倍体生殖细胞″是指处于配子形成阶段的生殖细胞，在此阶段该细胞包含两个拷贝的父本或母本同源染色体。
B.本发明的分离干细胞如上文所述，本发明的纯合干(HS)细胞来自于激活的未受精减数分裂I后的二倍体生殖细胞。例如，使两个成熟的卵母细胞或精子融合形成胚泡样团，由此衍生出HS细胞。由这种胚泡样团衍生的干细胞具有减数分裂后的基因型，表现为纯合、多能及生物学良性。
而且，在优选的实施方案中，本发明的HS细胞可由任意个体产生，并应用于相同的个体或者相关或不相关的免疫组织相容性个体，所述不相关的免疫组织相容性个体在受体和HS细胞，祖细胞，或者由HS细胞或祖细胞衍生的分化细胞和/或组织间之间具有高度免疫相容性。
可在体内或在体外诱导HS细胞分化成起源于三个胚层的多种类型的组织。在优选的实施方案中，在同基因的或异基因动物中将所述HS细胞装入胶囊，以产生干质，在其中所述的细胞分化成起源于内胚层、中胚层和外胚层的多种类型的组织，其包括但不限于皮肤，毛发，神经组织，胰岛细胞，骨，骨髓，垂体，肝，膀胱，及其他在动物，包括人中有诊断或治疗用途的组织。而且，分化技术领域的技术人员，特别是那些开发ES细胞和胚胎癌(畸胎癌)细胞分化的人员可在不花费过多劳动的前提下诱导多能细胞分化成所需的细胞类型。
例如，Hole，Cells Tissues Organs，165181-189(1999)(该文献在此引入作为参考)中描述了在体外使胚胎干细胞定向分化成造血细胞的方法。此外，Doetsehman等，Embryol.Exp.Morphol.，8727-45(1985)(该文献在此引入作为参考)提示由在悬浮培养物中生长的ES细胞中去除白血病抑制因子(LIF)导致囊状胚状体的形成，所述的囊状胚状体包含由红细胞和巨嗜细胞组成的血岛。也描述了来自干细胞的其他造血细胞，包括中性粒细胞，肥大细胞，巨噬细胞，和红细胞(参见，如Wiles和Keller，Development，111259-267(1991)；Keller等，Mol.Cell.Biol.13473-486(1993a)；及Lieschke和Dunn，Exp.Hematol.，23328-334(1995)，上述文献均在此全文引入作为参考)。这些方法适用于本发明的HS细胞。
Cho等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，969797-9802(1999)所述的使ES细胞有效分化为成熟的Ig-分泌B淋巴细胞的技术也适用于本发明的HS细胞，相关文献在此引入作为参考。类似地，Dani，CellsTissues Organs，165173-180(1999)中描述的用于细胞使ES细胞分化成脂肪细胞的方法，可作为一种有应用前景的模型应用于本发明，相关文献在此引入作为参考。例如用视黄酸(RA)对分化早期的胚状体处理一段时间可能与脂肪形成相联系。
Okabe等Mech.Dev.，5989-102(1996)中描述了使干细胞分化为多种神经元细胞的方法，相关文献在此引入作为参考。类似地，McDonald等，Nature Medicine，51410-1412(1999)中描述了由干细胞衍生的少突神经胶质细胞和神经元，其对治疗脊髓损伤具有特定的用途，相关文献在此引入作为参考。这些技术均可应用于本发明的HS细胞。
应用辅助细胞系，如OP9，衍生特定的细胞系也有描述，参见，例如Nakano等，Science，2651098-1101(1994)和Nakayama等，Blood，91228 3-2295(1998)涉及红细胞，髓细胞和淋巴细胞系，上述文献均在此引入作为参考。
使本发明的HS细胞分化成滤泡细胞及上皮细胞的方法也有描述。例如Taylor等，Cell，102451-361(2000)中描述了ES细胞衍生的滤泡和上皮细胞可用于毛发的替换和皮肤移植治疗，可对这些技术进行修饰以应用于本发明的HS细胞，在此引入作为参考。特定调节基因的表达也可用于指导分化。参见，例如Hole等，Blood，901266-1276(1996a)和Battieres.Clin.Hematol.，3467-483(1997)涉及造血基因，相关文献在此引入作为参考。同样的，初步证据表明核调节因子与脂代谢相关，其包括但不限于PPARs(PPARδ和PPARγ)和C/EBPS(C/EBPβ，C/EBPδ和C/EBPα)，可能引发前脂肪细胞到脂肪细胞的最终分化。这种因子也可在本发明的分化方法中发挥作用。
依所需功能，可通过检测分化特异的基因的表达、检测组织特异性抗原、或检测细胞或组织的形态、检测功能表达，如离子通道功能或任何适合于检测HS细胞分化的方法对分化作出评估。
通过体外或体内定向分化技术由本发明的HS细胞衍生的多能祖细胞能够产生来自全部三个胚层，即内胚层、中胚层和外胚层的细胞。例如祖细胞可分化成骨，软骨，平滑肌，横纹肌和造血细胞(中胚层)；肝，原肠，和呼吸道上皮(内胚层)；或神经元，神经胶质细胞，毛囊和齿芽(外胚层)。尽管本发明的祖细胞不必是永生化的，但其可作为永生化细胞系维持下来。形态上，祖细胞不表达ES细胞表面的标记，如灵长类动物ES细胞系特征性表面标记，对于SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81，碱性磷酸酶活性为阳性，对SSEA-1为阴性。
优选地，在不存在其他多能HS细胞时培养HS细胞来生产本发明的祖细胞。而且通过阻止衍生所述祖细胞的多能HS细胞的生长和增殖辅助所述祖细胞增殖。可利用本领域已知的技术产生祖细胞，例如，可在分化诱导剂存在下培养由胚泡样团分离的HS细胞，在没有其他HS细胞存在下生产多能祖细胞并阻止未分化的HS细胞进一步增殖。
另外，本发明中分离的HS细胞由于基因组印记而不能发育成足月胚胎；但如后面的实施例所述HS保持其分化成功能性分化细胞，和/或组织的能力。基因组印记的机理目前仍知之甚少，但已清楚表明孤雌生殖胚胎由于印迹不能发育成足月(Surani等，DevelopmentSupplement，89-98(1990))。鉴于印记基因的表达是由其亲本来源决定的，印记包括种系特异的渐成标记过程(Allen等，Development，1201473-1482(1994))。可应用于印迹机制的可遗传渐成修饰包括等位基因特异的DNA甲基化作用和染色质结构修饰，如可由DNA酶过敏性试验检测的那些。同上。对于某些基因(例如，Igf2r和H19)，父本基因是经印记的，而对于其他的基因(如，Igf2和Snrpn)母本的等位基因总是经印记的，同上(还可参见Mann等，Cell，62251-260(1990)，和Devel.Biol.，377-85(1992)，在此引入作为参考以讨论单雄生殖和孤雌生殖胚胎的多能性，以及遗传印记的含义)。
C.制备本发明的纯合干细胞如上所述，由经有丝分裂激活或未受精减数分裂I后的二倍体生殖细胞建立而发育的胚泡样团分离HS。图1是由未受精减数分裂I后的二倍体生殖细胞发育HS细胞的优选方法流程图。
生殖细胞发育成未受精减数分裂I后的二倍体生殖细胞，其在受到激活后产生衍生出本发明的HS细胞的胚泡样团。本发明的HS细胞和/或分化细胞可应用于疾病的诊断和/或治疗，例如通过向需要这种治疗的个体植入或移植。
尽管由相同的个体或免疫相容性个体均可获得纯合的减数分裂I后的二倍体生殖细胞，但在某些情况下优选自身供体。但是当选择治疗患有遗传疾病(即，以由于突变或不适当的表达而缺失关键基因为特征的疾病)的个体时，优选使用非自身供体。换言之，选择程序领域的技术人员会选择那些表现所需基因型的自体生殖细胞(如，没有缺陷或突变基因的细胞)，这些细胞可以表达上述的缺陷基因。这种选择技术可用于避免对组织移植而言免疫不相容的基因型或表型。
可通过常规的技术，特别是那些在体外受精领域中常用的技术从供体收获纯合的减数分裂I后的二倍体生殖细胞。参见，例如Jones HWJr.等，Fertil.Steril.，37(1)26-29(1982)，该文献描述由人卵巢滤泡中抽吸卵母细胞的技术；Lisek等，Tech.Urol.，3(2)81-85(1997)，该文献描述从附睾和睾丸中收集精子的技术；和Stice等，Mol.Reprod.Dev.，38(1)61-8(1994)，及Takeuchi等，Hum.Reprod.，14(5)1312-7(1999)，该文献描述将一个供体的核物质移植到另一个去核卵母细胞中的技术。所有这些文献均在此全文引入作为参考。
HS细胞是通过(a)将两个卵母细胞或两个精子细胞融合，然后通过基因型分析筛选纯合干细胞；(b)在卵子发生过程中阻止第二极体挤出；(c)在适当的条件下允许第二极体挤出和自发的基因组自我复制；或，(d)将两个单倍体卵或精子核转入去核卵母细胞，然后利用基因型分析筛选纯合干细胞。图2是精子发生和卵子发生的示意图，表示在雄性和雌性中有丝分裂和减数分裂阶段的不同。
本发明中所用到的卵母细胞可通过任何本领域中已知和尚待开发的适宜方法获得。典型地，可从供体的卵巢滤泡中获得人卵母细胞，由周围或粘附的细胞分离。可单独或结合克罗米酚柠檬酸盐施用适当的促性腺素或促性腺素类似物诱导超数排卵(Barriere等，Rev.Prat.，40(29)2689-93(1990)，在此引入作为参考)。在小鼠中，示例性的方法包括施用孕马血清(PMS)模拟促滤泡激素(FSH)，和人绒毛膜促性腺素(hCG)模拟促黄体激素(LH)(参见Hogan等，Manipulating the mouse embryoA Laboratory Manual，2ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press，1994)。有效的超数排卵诱导依赖于多种不同的因素，其包括但不限于雌性的年龄、体重，促性腺素剂量、施用时间和所用的株。
排卵超诱导和卵母细胞收获是本领域已知的。举例来说，对小鼠而言，详细的方法参见Hogan等，同上，P130-132，该文献的全部内容在此引入作为参考。例如Hogan描述了腹膜内施用由冷冻的干粉重悬于无菌的0.9％NaCl中的PMS和hCG以诱导超数排卵。PMS和hCG应在内源LH释放之前施用。Hogan方法针对从小鼠中收获卵母细胞，按照惯例也可在不进行过多实验的情况下适用于人。
聚乙二醇也表现出诱导排卵的卵母细胞融合的作用(参见如，GGSekirina，Ontogenez，16(6)583-8(1985)，和Gulyas BJ，Dev.Biol.101(1)246-50(1984)，在此引入作为参考)。另外Nogues等，Zygote，2(1)15-28(1994)，(在此引入作为参考)中描述了通过灭活的仙台病毒诱导卵母细胞融合，产生可进行胚胎发育第一阶段的″受精卵″或″卵母细胞融合产物(OFP)″。有关卵母细胞融合技术的综述，参见Gulyas BJ，Dev.Biol.，457-80(1986)，在此引入作为参考。有关小鼠卵母细胞融合技术的细节，参见Hogan等，同上，P148-150，其中所获得的带有卵丘细胞的卵在溶于Dulbecco′s PBS的7％乙醇中维持5min，用培养基洗涤，然后于37℃下温育5h。接下来用透明酯酸酶处理去除卵丘细胞。图3描述的是卵母细胞的融合及卵母细胞融合产物的发育。
另外，阻止第二极体从卵母细胞挤出可产生HS细胞。事实上，在第一次减数分裂和第一极体分离后即出现第二次减数分裂。在第二极体挤出前将卵母细胞暴露于下述试剂，包括但不限于，Ca++离子载体(A23187)，或乙醇，接下来暴露于下述试剂，包括6-二甲基氨基喋呤(6-DMAP)，嘌呤霉素，或细胞松弛素D，由此激活所述的二倍体卵母细胞形成胚泡样团。图4描述了可能的激活产物。
在另一个实施方案中，允许第二极体挤出，并且自发的基因组自我复制可以用于衍生HS细胞。在孤雌生殖激活时，卵母细胞挤出第二极体形成单倍体。在合适的条件下温育这种单倍体卵母细胞使其分裂并形成胚泡样团。参见Taylor，A.S.，等，″The early developmentand DNA content of activated human oocytes and parthenogenetichuman embryos，″Hum.Reprod.，9(12)2389-97(1994)；Kaufman，M.H.等，″Establishment of pluripotential cell lines fromhaploid mouse embryos，″J.Embryol.Exp.Morphol，73249-61(1983)。
本发明中所用的精子细胞可利用任何本领域中已知的或尚待开发的方法获得，特别是那些体外受精领域中的常规方法。收获精子细胞(减数分裂II完成的)，而后诱导融合以产生用于雄性的HS细胞。可利用已知的标准技术实现精子细胞融合，例如Asakura S，等，Exp.Cell.Res.，181(2)566-73(1989)，该文献教导利用低渗培养基诱导一对精子细胞融合，最终形成单一的顶体，该文献在此引入作为参考。另外，可用本领域已知的方法激活第二精母细胞(减数分裂I完成)。
最后，如上所述可由去核卵母细胞构建HS细胞。特定地，可将两个精子或单倍体卵核转移到去核卵母细胞中，构建在卵母细胞胞浆中带有雄性或雌性供体核遗传信息的未受精的二倍体卵母细胞。在雄性中，这一方法有利于亲代的基因表达，这是由于它模拟精子对卵子受精的过程，其引发受精卵中的基因表达。可利用本领域的标准技术收获和/或分离供体核物质。类似地，也可以利用体外受精领域的常规技术来实施转移步骤(参见美国专利5,945,577，WO98/07841以及上述的S.L.Stice和T.Takeuchi，和Wobus等，Cells Tissues Organs，1661-5(2000)，这些文献在此引入作为参考)。
也可以通过多核苷酸转染技术对HS细胞进行遗传修饰，所述转染技术包括但不限于病毒载体转移，细菌载体转移及合成载体转移(如通过质粒、脂质体和胶体复合物)。
由受精胚泡的内细胞团中分离ES细胞的方法是本领域已知的。这种方法也适于由胚泡样团的内细胞团分离HS细胞。例如，参见Gardner等，″Culture and Transfer of Human Blastocysts″，CurrentOpinions in Obstetrics and Gynecology，11307-311(1999)，美国专利No.5,843,780(Thomson等)和美国专利No.5,905,042(Stice等)所述文献的内容在此引入作为参考。
D.由本发明的分离的HS细胞衍生祖细胞、分化细胞、细胞团和组织类型在存在或不存在细胞因子，生长因子，胞外基质成分和其他因子的条件下通过任意合适的方法诱导分离的HS细胞分化。例如在平面的粘附环境(液体)下或在三维的粘附环境下(如1％胶原凝胶)诱导HS细胞分化。也可利用微重力环境诱导HS细胞分化，参见Ingram等，In vitro Cell Dev.Biol.Anim.，33(6)459-466(1997)。另一种诱导分化的方法是通过在免疫缺陷的小鼠(Thompson等，Science，282(5391)1145-47(1998))，或其他动物中生成干质来进行。将HS细胞装入胶囊使其在适当的宿主中形成干质，由此诱导分化。例如可将人HS细胞装入胶囊，将其放入用于衍生上述细胞的同一患者(同基因的)，或不同患者(异基因的)体内。类似地，可将完整的胚泡样团植入到受体动物体内，使其形成干质。
目前，有许多利用合成的，选择性透过膜从机体免疫系统中分离细胞的技术。可利用这种技术通过在体内生成干质而分化HS细胞。例如，一旦将装入胶囊的HS细胞植入以生成干质，即可利用膜使养料、氧气和生物治疗性物质在血液或血浆与装入胶囊的细胞之间自由交换。这种系统可在膜和基质载体的化学特性的基础上调节抗原、细胞因子和其他免疫成分的双向扩散。参见Lanza等，Nat.Biotechnol.，14(9)1107-11(1996)。对于参与在动物中植入胚泡样团的系统，可将单个或多个细胞团植入一种动物中。
可由任意动物供体物质生产HS细胞，将其用于任意动物系统。本发明包含人和非人HS细胞。适当的兽医用途包括由哺乳动物、鱼类、爬行动物、鸟类和两栖动物生产HS细胞并应用于所述动物中。
本发明中分离的多能HS细胞可分化成选择的组织并应用于多种治疗用途，其包括为用于研究、诊断或植入到个体中的目的在体外培养分化的组织。优选地，将HS细胞以治疗性目的应用于为形成HS细胞提供供体物质的个体。
用于分化多能细胞的现有技术是本领域的技术人员已知的，其包括使胚胎癌(EC)细胞分化成多种胚胎和胚胎外细胞的方法(参见Andrews，APMIS，106158168(1998)，引入此处作为参考)。这些技术也可用于诱导HS细胞分化。用于EC细胞定向分化的体外方法包括使EC细胞暴露于多种已知的、可引发细胞定型和分化成所需细胞类型或组织的多种因子。另外，所应用的体外分化方案可包括去除有利于干细胞维持的生长因子。一旦由培养基中去除了这些因子，干细胞即形成簇，即已知的胚状体，在其中可以找到全部三个胚层的后代。然后通过在培养基中添加额外的生长因子和化学物质可以增强胚状体中特定细胞系的存在。然后所得的细胞群将含有比例增加的所需的细胞类型，即可将其选择性的分离出来。另参见Edwards等，ModernTrend，74(1)1-7(2000)，其中讨论了多能干细胞及其在医药中的用途，该文在此引入作为参考。
举例来说分化控制因子包括但不限于细胞因子、激素和细胞调节因子如LIF、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，IL-3，甲状腺激素(T3)，干细胞因子(SCF)，成纤维细胞生长因子(FGF-2)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，睫状神经营养因子。尽管已知刺激性细胞因子，如GM-CSF，SCF，和IL-3可促进分化(参见Keil等，Ann.Hematol.，79(5)243-8(2000)，在此引入作为参考)，抑制因子，如LIF，可使小鼠胚胎干(ES)细胞维持在未分化的多能状态(Zandstra等，Blood，96(4)1215-22(2000)，在此引入作为参考)。另外，已表明SCF可刺激小鸡的推定祖细胞分化成破骨细胞(van′t Hof等，FASEB J.，11(4)287-93(1997)，在此引入作为参考)，FGF-2在引发永生化GHFT细胞中垂体催乳素细胞分化和维持催乳激素表达均起作用，由此证明控制干细胞分化成不同前垂体细胞的机制(Lopez-Femandez等，J.Biol.Chem.275(28)21653 60(2000)，在此引入作为参考)。此外，血小板衍生的生长因子(PDGF-AA，-AB，和-BB)支持神经元分化，而睫状神经营养因子和甲状腺激素T3产生星形胶质细胞和少突神经胶质细胞克隆(Johe等，Genes.Dev.，10(24)3129-40(1996)，在此引入作为参考)。
此外，2001年4月26日公开的WO 01/29206(Cibelli等)描述了多种分化因子，如分化剂，生长因子，激素和激素拮抗剂，胞外基质成分，多种因子的抗体和可用于诱导ES分化的技术。这种技术和试剂/因子可用于本发明，在此引入上述文献作为参考。另可参见Schuldiner等，″Effects of Eight Growth Factors On TheDifferentiation of Cells Derived From Human胚胎StemCell″PNAS 97(21)11307-12(2000)，也在此引入作为参考。
也可通过体内移植诱导HS细胞分化，优选原位方式，其中，所述细胞进行组织和功能分化并与宿主细胞建立适当的联系。定位于移植位点的内源调节因子可指导干细胞分化成特定类型的分化细胞或组织。或者，由干细胞产生的趋异分化细胞群和/或组织移植到皮下组织，腹膜和肾囊。参见Hogan，同上，第183-184页，其详细描述了肾囊植入过程。
1.人畸胎瘤中分化细胞的组织学特征和基因型畸胎瘤可以由成熟和/或未成熟的组织组成。在附着于玻片上的畸胎瘤切片中，对包含几种类型的分化组织的细胞组形态学分析进行了鉴定，并用常规技术对这些畸胎瘤切片进行了组织形态分析(Zhuang等，J Pathol，146620(1995)，和Vortmeyer等，Am.J.Pathol.，154987-991(1999)，在此引入作为参考)。进行畸胎瘤显微解剖以选择性地采集个体组织成分，其包括成熟的鳞状上皮，成熟的肠道上皮，成熟的软骨和呼吸道上皮，未成熟的软骨，成熟的神经胶质组织，未成熟的神经组织，和成熟的呼吸道上皮(参见Nicolas等，CancerResearch，364224-4231(1976)，在此引入作为参考，其中详细讨论了由体外可移植畸胎癌及与此相关的技术分离的多种细胞系)。
提取DNA，利用几条人染色体上的多个遗传标记进行等位接合性分析。在对有限的成熟肿瘤进行的初步研究中，始终检测到的是相同等位基因的纯合性(Vortmeyer等，Am.J.Pathol.，154987-991(1999)，该文献的全部内容在此引入作为参考)。但对大量的畸胎瘤进行分析表明有一小部分肿瘤带有杂合等位基因座。
为检验杂合畸胎瘤组织来源于减数分裂前细胞的假说，用相同的实验方法解剖含有成熟的(已分化的)和未成熟的(未分化的)组织元件的卵巢和睾丸畸胎瘤以获得多种成熟的和未成熟的组织元件样品。(参见在后实施例)。在包括未成熟的鳞状上皮，未成熟的神经组织和未成熟的软骨的未分化组织元件中检测杂合等位基因。对于相同的遗传标记而言，来源于这些肿瘤的分化组织是纯合的。检测的分化组织元件包括成熟的皮脂腺组织和成熟的鳞状上皮，包括来自同一肿瘤相同成熟元件的不同区域的两份样品。
该检测结果表明遗传上的纯合性与分化成为可识别的成熟组织类型相关，而遗传杂合性与未分化的组织相关。因此在畸胎瘤中未分化的组织区域由减数分裂前的生殖细胞的致畸胎瘤事件引发，而畸胎瘤内的分化组织来自减数分裂后的生殖细胞。
减数分裂前的细胞包含每条染色体的两个拷贝，因此，减数分裂前的细胞增殖产生遗传上的杂合细胞群。相反，减数分裂后的细胞仅具有每条染色体的一个拷贝并且是遗传上纯合的。减数分裂后的祖细胞增殖产生成熟的畸胎瘤，或畸胎瘤内的成熟分化组织区的事实表明减数分裂并不仅是一种染色体重排和遗传物质重组的机制，也是特异基因激活导致组织分化发育的先决条件。
因此，没有进行减数分裂的增殖肿瘤细胞保留未分化的，杂合特性，并发育成未分化的畸胎瘤组织。分化的畸胎瘤组织可衍生自增殖的已完成减数分裂的畸胎瘤或衍生自进行致畸胎瘤事件的减数分裂后细胞。
因此，减数分裂是畸胎瘤中组织分化所需的。畸胎瘤中的组织元件遗传分析表明纯合性与组织学上成熟分化的组织相关，遗传杂合性与组织学上未成熟、未分化的组织相关。这一结果支持下述结论，即减数分裂必须在畸胎瘤细胞能进行后续的组织分化前完成。由此，本发明教导了阻断生殖细胞减数分裂可构建本发明中的分离的、未分化的多能纯合干细胞。
2.HS细胞向特异的组织或细胞分化如上所述，本领域中已知的任何诱导分化的方法均可用于本发明。例如，可在组织培养孔中培养细胞，每孔包含一种特有的分化因子组合。编码这种因子的核酸或cDNAs可作为裸DNA取出，作为制备用于通过转染或病毒运送所述核酸的构建体。通过下述方式鉴定分化细胞a)分化特异的抗体；2)形态；3)用分化特异的引物进行PCR；或4)任何其他可用于鉴定分化细胞特异类型的技术。
一旦实施了所述的分化方案，即可通过常规的技术从分化的HS细胞中分离来自特定细胞系的原始细胞。需要时可通过细胞培养或其他适合的方法扩增所分离的分化祖细胞。
可在任意合适的分化阶段转染祖细胞。例如在胚泡样团形成前，可转染HS细胞，由此所述细胞可用作去核卵母细胞的核供体。在另一实施方案中可在分离后直接转染祖细胞，例如用造血系统的CD34+，或CD38细胞。
任何已知的插入、缺失或修饰所需基因的方法均可用于产生遗传改变的祖细胞或HS细胞。
一旦将装入胶囊的HS细胞或胚泡样团植入动物中，即可产生畸胎瘤甚至畸胎癌。为防止HS细胞在移植受体中形成良性的或恶性肿瘤，可向所述细胞中引入或使之缺失某些基因以阻止未分化的细胞生长。例如可将诱导型启动子，如MMTV引入细胞，然后通过地塞米松诱导而驱动阻断未分化的细胞生长并诱导分化的基因表达。或者引入种系特异的基因的启动子以驱动细胞周期阻断物或凋亡基因表达。
制备分化祖细胞的优选方法包括用钙离子载体激活未受精的减数分裂I后的二倍体卵母细胞，在培养基中培养所述激活的卵母细胞至胚泡样团形成的阶段。用链霉蛋白酶从细胞团中去除透明带，然后通过免疫外科方法去除滋养层细胞。诱导余下的细胞团，即HS细胞聚集物在存在或不存在细胞因子的条件下，在平面的粘附环境(液体)，或在三维的粘附环境，即微重力环境中分化，在免疫缺陷的动物中或同基因的，或异基因动物中产生干质。然后可将分化的祖细胞从分化的细胞团衍生物中去除。
下面讨论可由多能细胞分化的特异类型的细胞/组织。但这些讨论仅是示例性的而非穷举。本发明可通过任何本领域已知的分化方法实施，包括那些在本说明书中未提及或尚未开发出来的方法。
分化成内胚层细胞类型多能细胞分化成多种内胚层细胞类型具有重要的治疗意义，这包括用于移植目的，增强养料的摄入和加工或指导模式形成。可通过高剂量的RA或转化生长因子β超家族成员，包括骨形态发生蛋白(BMP)-2(Pera和Herzfeld，Reprod.Fert.Dev.，80551-555(1998))处理HS细胞可诱导其分化成内胚层祖细胞。也可利用六亚甲基双乙酰胺(HMBA)诱导一些HS细胞系向独特的，显著的非神经元方向分化(Andrews，APM1S，106158-168(1998))。BMP-2可用于特异性地引发向腔壁，或内脏内胚层分化(Rogers等，Mol.Bio.Cell，3189-196(1992))。BMPs是能在体内诱导软骨和骨生长的分子，但BMP信号也在许多非骨组织，包括发育中的心脏，毛囊和中枢神经系统中表达，表明其在细胞定型和分化中起关键作用。
向上皮组织分化上皮组织由紧密聚集的多面体细胞组成，具有极少的细胞间物质。上皮细胞的形状和大小各式各样，从高圆柱形到立方体形，到低鳞片状。上皮细胞核具有独特的外形，在球形到长椭圆形的范围变化。这些细胞间的粘附非常紧密。因而形成细胞薄片覆盖在机体的表面并被覆空腔。这些薄片可以是由一种类型的上皮细胞组成的单层，或是由不同类型的上皮细胞组成的多层。
上皮细胞的功能原理包括覆盖或衬垫(如，皮肤)，吸收(如，肠)，分泌(腺体上皮细胞)，感觉(神经上皮)，和收缩(如，肌上皮细胞)。下面举例讨论不同类型的上皮细胞和由HS细胞分化成不同类型上皮细胞的方法。
(a)角质化上皮细胞角质化上皮细胞主要与机体的表皮和真皮层(如，毛发，皮肤，指甲等)相关。实例包括但不限于表皮角质细胞和甲床(分化中的上皮细胞)；表皮基底细胞和甲床(表皮干细胞)；和毛干(如，髓的，皮层的，和表皮的)，根鞘(如，表皮的，Huxley′s和Henley′s层及外层)和基质细胞(毛发干细胞)。
基底细胞是上皮薄片中相对未分化的细胞，其类似于干细胞可形成更为特化的细胞。皮肤鳞状上皮的基底细胞可形成表皮和甲床的角质细胞。类似地，附睾上皮基底细胞(吸收性上皮细胞，在后面讨论)形成附睾的主要细胞。嗅觉粘膜基底细胞可形成嗅觉和支持细胞。因此，基底细胞可作为更特化上皮细胞的前体。
本发明的分离的HS细胞可分化成为成熟的角质上皮细胞，或直接分化或是通过合适的前体细胞或基底细胞利用本领域已知的分化ES细胞、EC细胞、其他多能或干细胞和/或畸胎癌细胞的技术进行。参见，如Taylor等，Cell，102451-461(2000)(所述文献的内容引入作为参考)中描述的方案，其描述了由滤泡和表皮干细胞，特别是双能滤泡突起干细胞形成滤泡和上皮细胞。
(b)屏障上皮细胞所述的屏障上皮细胞可分成两类-湿的复层屏障上皮和衬垫上皮。湿的复层屏障上皮包括，例如泌尿上皮细胞(衬垫膀胱和泌尿管)，角膜，舌，口腔，食管，肛管，远端尿道，和阴道(即，粘膜组织细胞)复层鳞状上皮表面和基底上皮细胞。衬垫上皮包括，例如，衬垫肺，肠，外分泌腺和尿道的细胞和衬垫闭合的内部体腔的细胞。
衬垫脉管，管道和开放的腔的上皮细胞包括但不限于I型肺细胞(衬垫肺的气腔)；胰腺导管细胞(泡心细胞)；汗腺，唾液腺和乳腺的无横纹导管细胞；肾小球壁细胞和足细胞；亨氏袢薄段细胞(肾)；和肾，精囊腺，前列腺，和其他腺体的导管细胞。
衬垫闭合内部体腔的上皮细胞包括但不限于血管和淋巴管的血管上皮细胞(有孔的，连续的和脾脏的)；衬垫关节腔的滑膜细胞；衬垫腹膜、胸膜和心包腔的浆膜细胞；衬垫耳淋巴腔隙的鳞状细胞；衬垫耳鳞状细胞的内淋巴腔隙的细胞；脉络丛细胞(分泌脑脊髓液)；软脑膜-蛛网膜的鳞状细胞；眼纤毛上皮细胞；和角膜上皮细胞。
本发明的分离的HS细胞可分化成为成熟的屏障上皮细胞，或直接分化或是通过合适的前体细胞如基底细胞利用本领域已知的分化ES细胞、EC细胞、其他多能或干细胞和/或畸胎癌细胞的技术进行。例如，参见Wolosin等，Progress in Retinal and Eye Research，19(2)223-255(2000)，在引入作为参考，其提供了干细胞和角膜周围上皮分化阶段的综述。
(c)外分泌，内分泌和基质分泌上皮细胞外分泌腺的产物通过导管或管道分泌到皮肤或开放体腔的游离表面，如消化道，呼吸道和生殖道。它们的产物不分泌到血流中。外分泌产物的实例包括粘液多糖和碳水化合物，消化酶，乳汁，眼泪，蜡，皮脂，汗液，精液和阴道分泌物。特化用于外分泌的上皮细胞的实例包括但不限于唾液腺细胞(粘液和浆液)；舌von Ebner腺细胞；乳腺细胞；泪腺细胞；耳耵聍腺细胞；外分泌和顶分泌汗腺细胞；眼睑Moll腺细胞，皮脂腺细胞；鼻嗅腺细胞；十二指肠腺细胞；精囊腺细胞；前列腺细胞；利特雷氏腺细胞；子宫内膜细胞；隔离的呼吸和消化道杯状细胞；胃衬垫粘液细胞；胃腺酶原和泌酸细胞；胰腺腺泡细胞；小肠潘纳斯细胞，II型肺细胞和肺克立拉细胞。
本发明的分离的HS细胞可分化成为外分泌上皮细胞，或直接分化或是通过合适的前体细胞利用本领域已知的分化ES细胞、EC细胞、其他多能或干细胞和/或畸胎癌细胞的技术进行。这些技术在此引入作为参考。
内分泌腺的分泌物称作激素，其直接分泌到血流中。激素在整个机体内循环并送至靶区域，作为化学信使调节特定的机体功能。多数内分泌腺也是上皮衍生物它们通过上皮薄层内陷形成，最初具有将它们与上皮薄层游离表面相连的导管。在胚胎发育过程中，它们失去导管因而称作无导管腺体。它们的分泌产物释放到细胞之间的空腔并扩散到临近的毛细血管的血液中。在显微镜下，内分泌腺类似于任意的复层上皮组织但有一个很大的区别它们没有游离表面，直接被其他组织所包围。
内分泌物的例子包括催产素，加压素，5-羟色胺，内啡肽，somastatin，分泌素，胆囊收缩素，胰岛素，胰高血糖素，铃蟾肽，降血钙素，肾上腺素，去甲肾上腺素，类固醇，及其他激素。特化用于内分泌的上皮细胞的例子包括但不限于垂体前、后叶细胞；肠和呼吸道细胞；甲状腺和甲状旁腺细胞；肾上腺细胞；生殖腺细胞；和肾小球旁器细胞。
本发明的分离的HS细胞可分化成为内分泌上皮细胞，或直接分化或是通过合适的前体细胞利用本领域已知的分化ES细胞、EC细胞、其他干细胞和/或畸胎癌细胞的技术进行。这些技术在此引入作为参考。例如Ramiya等，Nature Medicine，6(3)278-282(2000)，该文献全文引入作为参考，其描述了在体外由胰腺干细胞产生胰岛细胞，其中产生胰岛的干细胞(IPSC)培养物是通过消化由糖尿病前小鼠移植的胰腺组织得来的。胰岛祖细胞从在含有正常小鼠血清的Earle′s高氨基酸培养基中培养的单层上皮样IPSCs出芽。同上。发现VEGF，肝细胞生长因子，再生基因-1，转化生长因子α和胰岛新生相关蛋白也致导管上皮细胞有丝分裂形成胰岛内分泌细胞。同上。另外，已表明肝细胞生长因子，β-动物纤维素和活化素A使腺泡细胞分化成胰岛素分泌细胞。(还可参见Serup等，Nature Genetics，25134-135(2000)，Assady等，Diabetes，501691-7(2001)，和Lumelsky等，Scienee，2921389-93(2001)，所述文献内容在此引入作为参考)。
结缔组织的主要组分是胞外基质，其由蛋白纤维，无定型粉末状物和组织液组成。胞外基质组分是由上皮组织或结缔组织或这两种组织分泌的。特化用于胞外基质分泌的上皮细胞实例包括但不限于成釉细胞(分泌釉质)；耳前庭器官的平面半规管细胞；和柯蒂氏器的齿间细胞。
本发明的分离的HS细胞可分化成为胞外基质分泌上皮细胞，或直接分化或是通过合适的前体细胞利用本领域已知的分化ES细胞、EC细胞、其他多能或干细胞和/或畸胎癌细胞的技术进行。
(d)上皮吸收细胞在肠、外分泌腺和泌尿生殖道中发现了与吸收相关的上皮细胞。这种上皮细胞的例子包括但不限于肠刷状缘细胞；外分泌腺条纹导管细胞；胆囊上皮细胞；肾近端小管刷状缘细胞；肾末梢的小管细胞；输精小管无纤毛细胞；和附睾的基础和基底细胞。
本发明的分离的HS细胞可分化成为吸收上皮细胞，或直接分化或是通过合适的前体细胞利用本领域已知的分化ES细胞、EC细胞、其他多能或干细胞和/或畸胎癌细胞的技术进行。
(e)收缩上皮细胞肌上皮细胞是星形或梭形细胞，位于分泌或导管细胞的基板和基极之间。肌上皮细胞的功能是在腺体的分泌或运送部分周围收缩，促使分泌产物向外分泌。在虹膜和外分泌腺中有肌上皮细胞的实例。
本发明的分离的HS细胞可分化成为肌上皮细胞，或直接分化或是通过合适的前体细胞利用本领域已知的分化ES细胞、EC细胞、其他多能或干细胞和/或畸胎癌细胞的技术进行。
(f)杂类上皮细胞某些上皮细胞特别特化用于一种功能或环境，其本身不能归于上述任何一类。例如，晶状体细胞包括前晶状体和晶状体纤维上皮细胞。类似地，色素细胞包括视网膜色素沉着上皮细胞和黑素细胞。
本发明的分离的HS细胞可分化成为特定的上皮细胞，或直接分化或是通过合适的前体细胞利用本领域已知的分化ES细胞、EC细胞、其他多能或干细胞和/或畸胎癌细胞的技术进行。
分化成结缔组织结缔组织的特征是它的细胞产生大量的细胞间物质。结缔组织提供和维持机体形状。起机械作用，它们提供联系和约束细胞和器官的基质，并给机体以支持。
某些结缔组织细胞，如骨细胞，成纤维细胞和脂肪组织在局部产生并维持。其他的细胞来自于其他的区域但循环并瞬时栖息于所述结缔组织。结缔组织的细胞成分可分成下述的几类胞外基质分泌细胞；特化用于代谢和贮存的细胞；以及血液和免疫系统循环细胞。
下面对上述类型的结缔组织细胞进行举例说明。
(a)胞外基质分泌细胞结缔组织胞外基质分泌的实例包括但不限于成纤维细胞；毛细血管的外膜细胞；椎间盘髓细胞；成牙骨质细胞和牙骨质细胞(分泌牙根的骨样牙骨质)；成牙质细胞和牙细胞(分泌牙质)；软骨细胞(分泌软骨)；成骨细胞和骨细胞；骨祖细胞(成骨细胞干细胞)；眼玻璃体透明细胞；和耳淋巴周隙星形细胞。
本发明的分离的HS细胞可分化成为特化的胞外基质分泌细胞，或直接分化或是通过合适的前体细胞，如骨祖细胞利用本领域已知的分化ES细胞、EC细胞、其他多能或干细胞和/或畸胎癌细胞的技术进行。
(b)特化用于代谢和贮存的细胞特化用于代谢和贮存的细胞的例子包括但不限于肝细胞和脂肪细胞。
本发明的分离的HS细胞可分化成为特化用于代谢和贮存的细胞，或直接分化或是通过合适的前体细胞利用本领域已知的分化ES细胞、EC细胞、其他多能或干细胞和/或畸胎癌细胞的技术进行。
在一个实施方案中，例如利用Dani，Cells Tissues Organs，165173-180(1999)中描述的方法诱导HS细胞分化成脂肪细胞。HS细胞在体外能分化成脂肪细胞的能力，为研究脂肪形成中的早期分化事件以及鉴定参与间质干细胞定型为成脂肪细胞系的调节基因提供了一个有应用前景的模型。
HS细胞定型为脂肪细胞的先决条件是在分化的早期阶段用视黄酸(RA)短期处理HS细胞衍生的胚状体。由ES细胞形成脂肪的发育可分为两阶段第一阶段是胚状体(EB)形成后的第2到第5天，相应于HS细胞定型的许可期，所述HS细胞受全反式RA的影响。第二阶段相应于最终分化许可期，如前所述需要脂肪形成激素使所述细胞由前脂肪无性系进行分化。上述处理使产物中含有50-70％的脂肪细胞，相比之下未经RA处理时只含有2-5％的脂肪细胞。
RA不能用其他已知用于最终分化的激素或化合物所替代。单独或联合应用胰岛素，三碘甲状腺氨酸，地塞米松或强效的PPAR激活剂，如噻唑烷二酮BRL49653，和不可代谢脂肪酸2-溴棕榈酸处理早期的EB细胞，导致低水平的脂肪形成(5％)。在先前已报道的调节最终脂肪细胞分化的因子中，RA可能是唯一天然存在的、可引发由HS细胞发育成脂肪细胞的化合物。
作为能量来源的脂肪细胞的主要功能是在激素环境下储存甘油三酯(脂肪生成活性)并释放游离脂肪酸(脂肪分解活性)。可证明EB-衍生的脂肪细胞分别反应于胰岛素和β-肾上腺素能的激动剂而表现出脂肪生成和脂肪分解活性，这表明在体外成熟的和功能性的脂肪细胞确实是由HS细胞形成的。
PPARs(PPARδ和PPARγ)及C/EBPδ(C/EBPβ，C/EBPδ和C/EBPα)是调节参与脂肪代谢的基因的核因子。C/EBPα对维持脂肪细胞分化表型而言是重要的，而一些证据表明，PPARγ、C/EBPβ和C/EBPδ引发前脂肪细胞最终分化成脂肪细胞。这些因子在使干细胞定型为脂肪细胞系在作用是通过研究其在HS细胞决定和分化期的表达而提出的。PPARγ和C/EBPβ在决定期的表达量低，且脂肪细胞-脂肪酸结合蛋白(a-F ABP)平行表达，a-F ABP是最终分化的标记。这一结果表明PPARγ和C/EBPβ不是HS细胞定型为脂肪细胞系的调节基因。先前已有报道，在大鼠胚胎发育早期检测到PPARδ基因表达，且在PPARγ表达之前。在发育中的EB中表达的相同时间模式是保守的。与PPARγ相反，PPARδ在HS细胞决定期强烈表达，这表明这一因子可以成为参与间质前体定型为脂肪细胞系过程的主要基因的良好侯选对象。但PPARδ基因的表达并非限制在脂肪组织，并且诱导HS细胞脂肪形成所需的处理也不对其表达起修饰作用。用PPARδ的强效激活剂，如脂肪酸2-溴棕榈酸酯或carbocyclin刺激早期EB并不能引发EB沿脂肪形成途径分化。
产生缺失PPARδ和/或PPARγ的HS细胞有助于阐明这些转录因子在脂肪形成的不同阶段所起的作用。通过两轮同源重组的基因靶定产生了这些突变的HS细胞。分化培养系统与对未分化HS细胞的遗传操作，如基因捕获，功能的获得和丧失相结合，将提供鉴定参与在脂肪形成过程中的早期决定事件的新调节基因的工具。
而且，白血病抑制因子(LIF)和LIF受体(LIF-R)基因在由前脂肪细胞分化为脂肪细胞的过程中是发育调节的。LIF和LIF-R均在脂肪细胞分化的第一步中表达的事实使人们推测这一途径在脂肪形成中起调节作用。LIF的功能是在研究是否LIFR/HS细胞能进行脂肪细胞分化时提出的。已知LIF无效ES细胞以类似于野生型细胞的效率进行脂肪形成，其与对LIP突变小鼠的研究结果相一致，这表明LIF表达的缺失并不阻止脂肪组织的发育。LIF属于IL-6细胞因子家族，这一家族成员的一个特点在于生物功能冗余。
因此，可以推测LIF-相关的细胞因子能补偿体内和体外的LIF缺失。由此可研究出LIF-R在脂肪形成过程中的作用。然而，一旦生成LIFR/HS细胞，无LIF-R HS细胞进行脂肪细胞分化的能力急剧下降。突变细胞衍生的产物中仅5-7％含有脂肪细胞集落，相比之下，由野生型的HS细胞衍生的产物中有55-70％的脂肪细胞集落。经遗传修饰的HS细胞与培养条件结合使用使干细胞定型到脂肪形成途径促进了确定LIP-R在脂肪细胞发育中的作用。
在另一个实施方案中，利用Hamazaki等，FEBS Letters，49715-19(2001)中所述的方法可使本发明的HS细胞分化为肝细胞，该文献引入此处作为参考。
(c)血液和免疫系统的循环细胞血液和免疫系统的循环细胞包括但不限于红细胞(红血球)；巨核细胞；巨噬细胞(如，单核细胞，破骨细胞，郎格罕氏细胞，树突细胞，和微胶质细胞)；中性粒细胞；嗜酸性细胞；嗜碱性细胞；肥大细胞；杀伤细胞；T淋巴细胞(如，辅助性T细胞，抑制T细胞，杀伤细胞)；和B淋巴细胞(如，IgM，IgG，IgA，IgE，杀伤细胞)。
本发明的分离的HS细胞可分化成为血液和免疫系统的循环细胞，或直接分化或是通过合适的祖细胞，如造血干细胞利用本领域已知的分化ES细胞、EC细胞、其他多能或干细胞和/或畸胎癌细胞的技术进行。此种技术，包括在Suzuki等，Int′l J.of Hematology，731-5(2001)和Cho等，PNAS，969797-9802(1999)描述的技术，在此引入该文献作为参考。
在一个实施方案中，诱导HS细胞形成造血细胞系。即便不是全部，大部分造血细胞系可在体外ES细胞分化后产生(Hole，Cells TissuesOrgans，165181-189(1999))。尽管在去除白血病抑制因子(LIF)后HS细胞将类似地起始分化，可以看出在分化过程中这些多能细胞的培养条件对接下来产生的细胞系所具有的性质起着关键的作用。至少可用三种方法(1)使HS细胞聚集并在悬浮培养物中分化；(2)将HS细胞接种到半固体培养物中使其原位分化和(3)使HS细胞在辅助细胞存在下分化。
一些有关ES细胞体外分化的早期报道中使用的是悬浮培养物。Doetschman等，Embryol Exp Morphol.，8727-45(1985)报道在去除LIF后于悬浮培养物中生长，使ES细胞形成囊性胚状体。这些胚状体含血岛(卵黄囊造血的残余物)，其是由红细胞和巨嗜细胞组成。基于对中性粒细胞，肥大细胞，巨噬细胞和红细胞系的几组产物的证明而使用在半固体培养基上的分化(Wiles and Keller，Development，111259-267(1991)；Keller等，Mol.Cell Biol.13473-486(1993a)；Lieschke和Dunn，Exp.Hema tol.，23328-334(1995)。也可以考虑利用辅助细胞系，如OP9，其后证明了红细胞，髓细胞和淋巴细胞系的存在(Nakano等，Science，2651098-1101(1994))后者包括天然杀伤细胞类型(Nakayama等，Blood，912283-2295(1998))。
尽管HS细胞的确可在体外分化过程中形成大多数(即便不是全部)造血细胞系，但并不清楚它们是否可自发地进行上述过程。关于ES细胞，有几个研究组报道其需要添加造血生长因子。Nakano等人(Nakano等，Science，2651098-1101(1994))的工作表明，巨噬细胞集落刺激因子缺陷细胞系OP9的使用对促进全面的造血细胞分化十分关键。在研究者利用RP010基质细胞系进行的研究工作中也显示出对基质细胞的需要；在这一实例中还使用了外源生长因子。相反，其他研究组报道定型到髓细胞，红细胞或淋巴细胞系似乎并不需要外源细胞系或生长因子(Hole等，Blood 901266-1276(1996a))。
对于ES细胞，造血细胞分化的显著差异可能是由于这些研究组所用的几种方法的不同造成的。一些研究组使用了外源细胞因子，其可扩增低水平的特异细胞系定型。事实上，显然分化中的ES细胞本身包含广泛的造血细胞因子转录物(Hole等，Blood，901266-1276(1996a)；Hole等，Gene Technology，Berlin，Springer，pp3-10(1996b))和可影响定型过程的因子(Keller等，Mol.Cell.Biol.，13473-486(1993b))。
在HS细胞体外分化后可产生并分离淋巴祖细胞。过继转移到小鼠中，所述小鼠的淋巴样区室由遗传病变受到损害，导致ES细胞衍生的淋巴细胞长期或短期再增殖(Potocnik等，Immunol.Lett.，57131-137(1997))。早期的报道显示ES细胞衍生的造血祖细胞的再增殖能力可能限制在淋巴系统，但进一步的研究表明ES细胞衍生的细胞可显示出长期的，多细胞系的造血增殖潜能(Palacios等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，927530-7534(1995)；Hole等，Blood，901266-1276，(1996a))。
ES细胞在体外分化后可对长期再增殖的造血干细胞进行鉴定。通过表征这一分化的时间过程，ES细胞可用于检测基因在造血干细胞第一次作为区别细胞表型出现的阶段的差别表达。造血干细胞在相对短暂的分化时期存在；多细胞系增殖活性出现在分化的第4天，在第3天或第5天均未发现(Hole等，Blood，901266-1276(1996a))。已知造血基因的表达增强了在造血细胞分化中这一阶段的重要性；表达在此阶段显著上调(Hole等，Blood，901266-1276(1996a)；Hole和Graham，Battieres Clin.Hematol.，3467-483(1997))。利用扣除杂交法，Hole和Graham，Battieres Clin.Hematol.，3467-483(1997)，证明这一体外分化模型是造血基因的丰富来源；至少已鉴定了两个在胚胎发生和造血细胞系中以与早期造血细胞定型一致的方式表达的新基因。
也可利用基因捕获鉴定可能参与早期造血细胞定型的基因。在这一方案中，通过将报道构建体插入到HS细胞基因组中随机诱变基因，通常与带有药物抗性的表达构建体相偶联。典型地，在嵌合动物产物产生后观察被“捕获”基因的表达模式；然后通过测序鉴定侯选基因。一种替代方法是利用体外TS细胞分化作为预筛选。利用OP9-依赖的体外ES细胞造血分化模型，证明了造血和内皮细胞的表达捕获(Stanford等，Blood 924622-4631(1998))。
在又一实施方案中，诱导HS细胞分化成淋巴细胞。示例性的方案利用Cho等描述的方法，他们建立了有效的系统使ES细胞分化成为成熟的Ig-分泌B淋巴细胞(Cho等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，969797-9802(1999))。
在添加了2.2g/l碳酸氢钠和20％FCS(ES级并且批量检测；Cyclone，Logan，UT)的αMEM中培养单层BM基质细胞系，OP9细胞。OP9培养基也用于TS/OP9共培养。HS细胞在用丝裂霉素C-处理的铺满的单层胚胎成纤维细胞上用1ng/ml白血病抑制因子(R&DSystems，Minneapolis，MN)培养。HS和胚胎成纤维细胞在添加了15％PCS，2mM谷氨酰胺，110μg/ml丙酮酸钠，50μM 2-巯基乙醇，和10mMHepes(pH7.4)的DMEM中维持。所有的共培养物均是在37℃、含5％CO2的潮湿的培养箱中进行温育的。定期检测表明所有的细胞系均作为无支原体培养物维持。
为诱导造血细胞生成，将HS细胞的单细胞悬液接种到6-孔板中铺满的OP9单层细胞中。在第3天更换培养基；到第5天有近100％的TS集落分化成为中胚层样集落。在第5天用胰蛋白酶(0.25％；GIBCO/BRL)处理共培养物；所述的单细胞悬液预铺板30min；将非粘附细胞(1-2×106)再接种到10-cm培养皿中新铺满的OP9细胞层中。在第6或7天开始出现小的造血细胞样平滑圆润的细胞簇。在第8天将松散的粘附细胞轻轻洗下，置于新的OP9细胞层(无胰蛋白酶)。这种处理富集了具有造血潜能的细胞，弃去了分化的中胚层和未分化的HS集落。
这种传代后，造血集落在第10到12天及以后显著迅速地增殖扩展。到第19天，由HS/OP9共培养物回收的CD45+细胞总数达约105。所用的Flt-3L终浓度5-20ng/ml(R&D Systems)。从第5天起在外源Flt-3L存在下培养细胞。在第5天添加Flt-3L似乎代表B淋巴细胞生成增强的时间窗，因为当在其后(在第8天或以后)添加Flt-3L时观察到增强，在第8天到第15天更换培养基和/或在无胰蛋白酶条件下进行细胞传代[即，将它们制成单细胞悬液并过滤(70μm)]。
为产生slgM-B细胞，在第15天收获淋巴-造血细胞，并重新铺于新鲜的OP9单层细胞上，在第28天用10μg/ml的脂多糖(LPS)刺激细胞4天。然后收集细胞和培养物上清液分别进行流式细胞术和ELISA分析。在独立的实验中用LPS(100μg/ml)刺激细胞48小时，然后分析CD80(B7-1)的上调。
为生成转化细胞系，在第8天向含Flt-3L的TS/OP9共培养物中添加IL-7(5ng/ml)(R&D Systems)以维持未成熟的前-B细胞。添加由生产细胞系4天铺满的平板中获得的未稀释病毒原液感染共培养物。用含4μg/ml聚凝胺(Sigma)和IL-7的3ml病毒原液替换培养基以感染10-cm培养皿中的共培养物。所述培养皿在37℃下周期性地摇动2-4小时。然后向所述培养皿中添加含IL-7的5ml新鲜OP9培养基。5天后更换成含IL-7但不含Flt-3L的培养基。其后更换的培养基不含IL-7。流式细胞术分析显示，所有的转化细胞系均表现出相同的表型。每次实验中都有显著的CD45R+CD24+IgMe未成熟前-B细胞群存在。感染细胞大量生长，然后通过有限稀释克隆。通过Southern印迹分析确定了病毒基因组的整合拷贝。
在开始HS/OP9共培养后的不同时间进行流式细胞术分析，结果显示在共培养的第5天首先观察到CD45+细胞。到第8天在CD45+细胞表面还表达CD117和Sca-1，由此呈现出类似早期造血干细胞的表型。在共培养系统中出现的早期造血中相当一部分典型地产生出红细胞系的细胞，这是由大部分CD24+细胞为TER-119染色阳性所证明的(第8和12天)。尽管共培养第12天的大多数细胞属于红细胞系(CD24hiCD45-TER-119-)，CD45+细胞表达低到高水平的CD45R。这一表型暗示B细胞系在第8到12天出现在共培养物中。尽管这种B细胞系表型在第12天已经表现得非常明显，但长期培养(＞20天)也很少获得CD19+IgMB细胞生成。
首次观察到造血细胞后，在TS/OP9共培养的第5天添加Flt-3L。分析第19天的共培养物显示，添加Flt-3L急剧增加了HS/OP9共培养物中B淋巴细胞的生成(60～/o vs.6％CD45R+细胞，分别为含有和Flt-3L不含有Flt-3L)。因此，在第5天向HS/OP9共培养物中添加Flt-3L使其后回收的B细胞系细胞提高了约10倍。显然，在Flt-3L处理的培养物中，髓细胞，CD11b+(Mac-1)和红细胞，TER-119细胞的频率减少了。在这些培养物中没有观察到T淋巴细胞分化的证据。在第19天HS/OP9共培养细胞的表型清楚地表明，添加Flt-3L导致CD19.CD45R-AA4.1-CD24+IgM-细胞世代中的特异增长，尽管细胞总数仅观察到少量增长(约30％)。在第5天添加Flt-3L，在HS/OP9共培养系统中高效地呈现B淋巴生成细胞。
分析其后收获的带有Flt-3L的HS/OP9共培养物表明，B细胞系标记阳性的细胞百分比大幅增长。培养4周后，共培养物中几乎所有的(＞90％)细胞都是B细胞系CD45R+CD19+淋巴细胞。这些HS-衍生的B淋巴细胞表现出CD11b+表型和CD5+B细胞小(2-3％)亚组，这表明在HS/OP9共培养物中不易生成CD5+B细胞。
为进一步证明体外产生的B细胞的功能，用LPS处理第28天的共培养物，其后成熟的表面IgM～CD19+B细胞变大并大量增殖。促细胞分裂素激活后，一个显示出表达CD80(B7-1)，即激活后在成熟B细胞上正常上调的共刺激分子。而且，表明来自LPS-刺激细胞的培养物上清液119～检测为阳性(ELISA分析)，表明这些细胞能加强Ig分泌的水平。这些发现为HS细胞在体外分化为成熟的促细胞分裂素反应性Ig-分泌B细胞提供了证据。
发现向HS/OP9共培养系统添加外源Flt-3L是用于在体外由HS细胞生成成熟的、功能性B淋巴细胞的有效实用模型系统发育的关键因素。许多发现支持Flt-3L是体外早期B淋巴细胞生成的重要因子的观点。而且，多种结果说明向HS/OP9共培养系统中添加Flt-3L的方式使B淋巴细胞易于产生。对体内B细胞分化过程中出现的情况进行流式细胞分析。HS-衍生的B细胞遵循正常的发育途径，其功能类似与在体内的祖细胞和成熟B细胞，由此得出结论这一系统可有效地应用于B细胞分化。
完全在体外由经遗传修饰的HS细胞获得转化的、分化的稳定细胞系的能力可产生附加的用途。因为可简单地产生并维持转化体并具有迅速加倍的时间，所述的细胞系衍生可添加到研究细胞系特异基因靶定突变的方法库中。例如可评估V(D)J重组中涉及的特定基因中的无效突变。
本发明包括在体外直接由HS细胞产生人B细胞祖细胞和/或B淋巴细胞的系统。这一系统为遗传定义的HS细胞-衍生的B细胞提供无限的来源，所述的B细胞对患有无丙种球蛋白血症和特定B细胞功能障碍的患者具有治疗性用途。
分化成肌肉组织肌肉组织由具有特化的收缩或推进功能的伸长细胞(如，纤毛细胞)。
收缩细胞的例子包括但不限于骨骼肌细胞(红、白、中间、纺锤和卫星细胞)、心肌(普通的，结节和浦肯野纤维)；及平滑肌。
卫星细胞是参与骨骼肌再生的肌干细胞。这些细胞是单核纺锤形细胞，位于基板内围绕每一成熟的肌纤维。它们被认为是在肌肉分化后保留下来的无活性的成肌细胞。但经适当刺激后这些正常状况下静止的细胞被激活，增殖形成新的骨骼肌纤维。
成肌细胞是能融合在一起产生肌管的有丝分裂后细胞，所述的肌管最终发育成骨骼肌纤维。因此，成肌细胞被认为是骨骼肌纤维的直接前体细胞。
本发明的分离的HS细胞可分化成收缩肌细胞，或直接分化或是通过合适的前体细胞如卫星细胞或成肌细胞，利用本领域已知的分化ES细胞、EC细胞、其他多能或干细胞和/或畸胎癌细胞的技术进行。这些技术包括如McKarney等，Int J.Dev.Biol.41(3)385-90(1997)，和Gussoni等，Nature 401(6751)390-4(1999)中所述的方案，上述文献引入作为参考。McKarney等描述了生肌调节因子(myf5，肌细胞生成素，MyoDl和myf6)对胚胎干细胞分化的影响。Gussoni等描述了将正常的造血干细胞递送到辐射过的动物体内，导致移植受体造血腔室重构。
具有推进功能的纤毛细胞的例子包括但不限于呼吸导管纤毛细胞；输卵管和子宫内膜纤毛细胞；睾丸网和输精小管纤毛细胞；中枢神经系统纤毛细胞。
而且认为脂肪细胞和骨骼肌细胞衍生自相同的间质干细胞前体，并提示在体外骨骼肌和脂肪的发育程序相互排斥。在体外，经常存在骨骼肌和脂肪之间的逆关联。与脂肪细胞系相反，骨骼肌细胞系系出现。单个的用低浓度的RA(10-8M)处理的EB在HS细胞分化过程中自发发育，其后产生脂肪细胞和骨骼肌细胞(分别由a-FABP和肌细胞生成素基因的表达确定)。但随着RA浓度的提高，分化程序发生偏移。高于10-8M的RA浓度下肌细胞生成素的表达受到抑制，而a-F ABP的表达得以提高。
显微镜检结果表明，a-F ABP和肌细胞生成素基因的表达与脂肪细胞和肌细胞的发育相平行。主要由间质细胞表达的A2COL6基因的表达未被修饰，这表明用RA预处理早期的EB并不引起HS细胞发育程序的全面改变。RA以浓度依赖的方式诱导生肌和生脂肪之间的转换。尽管需要对骨骼肌生成早期基因标记，如Myf5或MyoD的表达进行研究以便了解在成肌细胞前体发育的哪个阶段被阻断，由这些结果得出结论，即HS细胞定型为脂肪细胞系的许可期对肌细胞而言同样关键。HS细胞的体外分化能允许对决定干细胞沿生脂肪途径发育还是沿生肌发育途径发育所涉及的因子进行表征。
也可利用本领域已知的技术诱导本发明中分离的HS细胞和祖细胞分化成心肌，参见Kehat等，J.Clin.Invest.，108407-414(2001)和Muller等，The FASEB Journal，142540-2548(2000)，所述文献在此引入作为参考。
分化成神经组织神经和感觉组织由具有延长的突触的细胞组成，该突触从由具有特化的接收，产生和发射神经冲动的细胞体伸出。神经和感觉组织的细胞可分为四类自主神经元；神经元和神经胶质细胞；感觉器官和周围神经元的支持细胞；和感觉传导器。下面举例说明各类神经和感觉细胞。
利用本领域的已知技术可将本发明的分离的HS细胞和祖细胞诱导分化成各种类型的神经组织，参见Guan等，Cell Tissue Res，305171-176(2001)，Przyborski等，Eur.J.of Neuroscience，123521-28(2000)，Brustle等，Science，285754-6(1999)，Hancock等，Biochem.& Biophys.Res.Comm.，271418-421(2000)，Liu等，PNAS，97(11)6126-31(2000)，and Fairchild等，Curr.Bio.，10(23)1515-18(2000)上述文献的内容在此引入作为参考。
(a)利用视黄酸差示激活同源框基因同源框基因指定在果蝇和脊椎动物胚胎发生中的位置信息，它反应于RA，是一种天然形态发生基因。在人HS细胞中，RA可用于特异性地激活全部四簇人触角足样同源框基因，已知为HOX1，2，3，和4。参见，例如Bottero等，Rec.Res.Cancer Res.123133-143(1991)，在此引入作为参考，说明在EC细胞中RA以浓度依赖的方式，以与其在所述簇中3′到5′的排列共线性的顺序差示激活人HOX2基因。
所述的基因正常地是沿发育中的中枢神经系统的前后轴表达，其中，3′基因表达在myencephalon中更向嘴侧，而5′基因在脊髓中更近尾部表达。同源框基因的浓度依赖性说明HS细胞可暴露于特定浓度的RA中，以引起特定的同源框簇或某一簇中各个基因的表达，从而定型分化成与某种精确定位相应的组织类型，如相应于中枢神经系统的亚区。
(b)自主神经元自主神经元的例子包括但不限于1)胆碱能神经元；2)肾上腺素能神经元；和3)肽能神经元。
本发明的分离的HS细胞可分化成自主神经元细胞，或直接分化或是通过合适的前体细胞，利用本领域已知的分化ES细胞、EC细胞、其他多能或干细胞和/或畸胎癌细胞的技术进行。
(c)神经元和神经胶质细胞神经元和神经胶质细胞的例子包括但不限于；神经元，2)星形胶质细胞，和3)少突神经胶质细胞。
本发明的分离的HS细胞可分化成神经元和神经胶质细胞，或直接分化或是通过合适的中间体细胞，如神经前体细胞利用本领域已知的分化ES细胞、EC细胞、其他多能或干细胞和/或畸胎癌细胞的技术进行。所述的技术包括下述的方法，所述内容均在此引入作为参考。
Woodbury等，J.Neurosci.Res.61364-370(2000)，(在此引入作为参考)描述了利用含1-10mM BME(SFM/BME)的无血清培养基在重组的骨髓基质细胞(rMSCs)中诱导神经元表型。
Lee等，(Nature Biotech.18675-678(2000)，在此引入作为参考)描述了利用促细胞分裂剂及特殊的信号分子及因子如sonichedgehog(SHH)，FGF-8，抗坏血酸cAMP及其类似物，由小鼠胚胎干细胞有效地产生中脑和后脑神经元，特别是多巴胺能和5-羟色胺能神经元。
Okabe等，(Mech.Dev.5989-102(1996)，在此引入作为参考)描述了允许由胚胎干(ES)细胞分化为神经上皮前体细胞的培养条件。特定地，由ES细胞衍生的高度富集的神经上皮前体细胞在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)存在下进行增殖。去除bFGF后这些细胞在分化成神经元和神经胶质。
McDonald等，(Nature Medicine51410-1412(1999)，在此引入作为参考)描述了作为定向分化方式的原位移植方法。特定地，在创伤9天后将神经分化的小鼠胚胎干细胞移植到大鼠脊髓。2-5周后进行组织学分析表明移植物衍生的细胞存活并分化成星形胶质细胞，少突神经胶质细胞和神经元，且由受损边缘移动了8mm远。
Borlongan等，(NeuroReport 93703-3709(1998)，引入作为参考)描述了利用视黄酸刺激由永生化人胚胎癌细胞(Ntera 2或NT2细胞)发育成有丝分裂后神经元样(hNT)细胞。
Oliver Brstle等，″Protocol for producing Glial precursorsfrom pES CellsA Source of Myelinating Transplants″，TheAmericatt Association for the Advancement of Science 285754-756(1999)，进一步描述了ES细胞分化成神经胶质细胞的技术。这一技术可用于分化HS细胞，在此引入作为参考。
为表征神经元前体细胞的电生理特性，可将其在含有B27和5％FCS的神经基础(neurobasal)培养基中维持12天以上，并记录这三个培养皿中的15个细胞的活性。这种细胞的静息膜电势应为约-60mV，并且当去极化时，它们应当表现出距离静息电位20mv的内向动作电位。
内向电流接下来是快速的灭活输出电流(IA)和持续的外向电流。这些电流应不存在于填充Cs的细胞中，这表明它们很可能是由外向的K-调节通道介导的。
大多数的神经元细胞表达不同持续时间和强度的自发突触电流。向所记录的神经元前体细胞临近的细胞，即向假定的神经元施用谷氨酸可引发所记录的神经元中的突触电流的产生，具有短暂的延迟。所记录的突触电流有两种类型快速兴奋突触后电流，在约0mV时反向，和慢衰减抑制性突触电流，用含醋酸盐的移液管记录时在约-50mV反向。而且，所记录的细胞还应当对局部应用谷氨酸产生反应，在静息电位时记录到显著的内向电流。自发的和激发的突出应答及细胞对谷氨酸的应答表明所记录的培养物中的细胞，保持了与那些产前的，经培养的CNS神经元类似的一系列性质。
用NMDA刺激记录的细胞诱导环腺苷酸反应元件结合蛋白(CREB蛋白)磷酸化和c-fos基因转录。分析这两种诱导作用确定功能性NMDA受体是否表达。未刺激的细胞不应被磷酸-CREB染色。相反，所记录的神经元细胞在受谷氨酸或NMDA刺激10min后应当表现出强烈的核免疫反应，且可被磷酸-CREB染色。与此相反，神经胶质样细胞的大核不表现为可被磷酸-CREB染色。
另外，对经谷氨酸盐或NMDA处理的细胞进行RT-PCR显示c-fos诱导，提示在这一制剂中的一些神经元具有功能性的MDNA受体，突触连接的存在还可通过电子显微镜观察或形态学特征确定，例如应当观察到含有大量突触小泡的突触前结构，或作为活性区特征的膜增厚。这种结果表明由HS细胞衍生的神经元前体细胞可分化成有丝分裂后神经元，其形成功能性的突触连接。
先前的研究已表明bFGF对神经上皮前体细胞是强烈的促细胞分裂剂。为研究HS细胞对bFGF的应答，将在ITS/FN培养基中保持了6-7天的HS细胞分离并铺于几个不同的基于DMEM/F12-的培养中。3天后测定细胞密度。添加了经修饰的N3(mN3)培养基的DMEM/F12，bFGF和纤连蛋白的组合应当具有最高的增殖效果。在5-50ng/ml的浓度下，bFGF应表现出相同的增殖效果。在低于1ng/ml的浓度下，bFGF不表现明显的增殖效果。由于预期层粘连蛋白比纤连蛋白表现出稍高的细胞增殖刺激，所以将N3培养基，bFGF和层粘连蛋白的组合(″N3FL″培养基)用作神经元前体样细胞的增殖条件。
在N3FL培养基中占优势的增殖细胞应当类似于ITS/FN培养基诱导的nestin-阳性细胞。在N3FL培养基中生长时，HS细胞如多种ES细胞系(D3，CJ7和J1)应该呈现出相同的形态，并且其增殖严格依赖于bFGF。在铺板后第1，4和7天对细胞密度计数，由此对细胞增殖进行定量。细胞计数表明在培养7天后细胞的数量增长了6倍。
也可以用特异于下述细胞的抗体对所述制备物进行染色，所述细胞为神经元前体(nestin)，有丝分裂后神经元(微管相关蛋白2；MAP2)，星形胶质细胞(神经胶质纤维酸性蛋白；GFAP)和少突神经胶质细胞系细胞(O4，Gal-C)。在每一时间点，Nestin-阳性细胞均应占到总细胞数的80％以上；MAP2-阳性细胞数约为总细胞数的10-15％；GFAP-阳性细胞应少于总细胞数的2％。在这一制备物中不应存在O4或Gal-C阳性细胞。
而且由成人中枢神经系统分离的祖细胞移植到脑中后分化为神经元和神经胶质细胞；移植到脊髓中后分化成少突神经胶质细胞和星形胶质细胞。类似地，干细胞可移植到脊髓中并在那里进行分化和迁移，并促进受损脊髓的恢复。McDonald等，1999，Nature Medicine 51410-1412，移植了暴露于RA(视黄酸)的ES细胞以诱导神经分化(4天暴露于500nM全反式-RA)，观察到分化成星形胶质细胞，少突神经胶质细胞和神经元，以及在脊髓内的迁移，行为(运动)结果表明受损脊髓的恢复。
在一个实施方案中，HS细胞可替代ES细胞移植到脊髓中进行分化和迁移，促进需要所述治疗的患者得以恢复。HS细胞衍生的胚状体(4天无，而后4天有视黄酸)用于移植，其中，应用RA诱导神经分化。将部分胰蛋白酶化的胚状体作为细胞聚集体移植到脊髓挫伤后9天形成的管中。假手术的对照进行同样的操作，但它们仅接受管内注射培养基代替细胞移植。用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)运动分级评分评估运动功能。
在进行移植的前一天(损伤后第8天)获得BBB平方，对照组和实验组相配对，将受试对象随机分配至各组中，保证各组的起始运动评分相等。在撞击损伤后的第9天，将神经分化的HS细胞(约1×106)或载体培养基通过脊椎立体定位框的方式移植给受试者，将具有100μm直径吸头的玻璃移液管配合5μl Hamilton注射器，或Kopf微立体定位注射系统(Kopf Model 5000 & 900；Kopf，Tujunga，California)。在5min内在T9水平将HS细胞或载体培养基(5μl)注射到管的中央。总共完成了具有时间匹配对照的三次独立的实验。第一组在移植后5周完成了行为分析和其后的组织学分析(n＝每组11)，HS细胞移植物与对照进行了比较。第二组用于比较早期(移植后2周)和晚期(移植后5周)组织学结果(n＝每组11)，HS细胞移植物(ROSA lacZ转基因系)与对照进行了比较。
经遗传标记并在体外用10μM BrdU的24小时脉冲进行预标记的HS细胞-衍生的细胞，在移植后的14-33天进行原位鉴定。也可以用特异的抗体进行鉴定。移植2-5周后，应当发现HS细胞衍生的细胞聚集或单个分散地遍布受损位点。而且，在距管嘴侧或尾侧边缘8mm处均可发现单个的细胞。在大多数受移植的受试者中，移植两周后，HS细胞衍生的细胞填充了一定的空间，所述的空间在用培养基处理的受试者中是由管占据的。到第5周，在这一区域HS细胞-衍生的细胞的密度应下降，并由含纤维的胞外基质替代。
存活的HS细胞-衍生的细胞也可通过针对下述标记的抗体进行鉴定，所述标记特异于少突神经胶质细胞(腺瘤性息肉coli基因产物)，星形胶质细胞(神经胶质纤维酸性蛋白)和神经元(神经元特异的核蛋白)。核可通过Hoechst 33342染色进行清楚地鉴定。大多数存活的HS细胞-衍生的细胞应当是少突神经胶质细胞和星形胶质细胞，但某些HS细胞-衍生的神经元应当出现于脊髓的中间。许多HS细胞-衍生的少突神经胶质细胞应当对髓磷脂碱性蛋白，即髓磷脂的整体成分，具有免疫反应性。
通过HS细胞移植增强了在“露天运动”(open field locomotion)中的能力。不同于假手术移植组对支持体重的无能，接受HS细胞移植的受试者可表现出部分的承重移动。在移植后2周达到BBB评分统计学上的差异。1个月后在假手术和HS细胞移植组间BBB评分将产生2分的差异。由前者获得的评分表明不能支持体重也不能进行协调运动，而后者得到的评分表现出以部分肢体承重为特征的步态和部分肢体协调性。
总体来说，在负重损伤9天后将HS细胞衍生的细胞移植到脊髓可至少存活5周；由移植位点向外至少迁移8mm；分化成星形胶质细胞，少突神经胶质细胞和神经元而不形成肿瘤；并产生改善的运动功能。
先前通过去除bFGF而诱导分化的神经元细胞可在添加了B2 7添加物和5％胎牛血清的神经基础培养基中维持至少2周，而没有明显的细胞死亡。这一长期培养可成功地应用于J1，CJ7和D3细胞系。长期培养是困难的，但是在N3为基础的无血清培养基中进行。
在培养物中用MAP2和神经丝-M(NF-M)双标记的细胞应显示出存在两类神经突。抗-MAP2抗体对短粗的突触和细胞体染色而抗-NF-M对细长的突触染色。双标记的HS细胞-衍生神经元应具有MAP2阳性的树突和NF-M阳性的轴突。
抗-突触素I染色揭示出与树突的质膜紧密连接的突出结构。这种染色模式显示出沿轴突的不同位点的突触小泡的分离。
为研究神经递质表型，用几种神经递质的抗体对分化成神经元细胞的HS细胞进行染色。结果表明大量的谷氨酸阳性细胞与完全阴性的细胞混合在一起。
而且，γ氨基丁酸(GABA)-阳性的细胞是常见的，GABA染色也是有效的。因此，可以鉴定GABA阳性但MAP2阴性的细突触。由于GABA能神经元的轴突应当是GABA阳性且MAP2阴性，所以这一发现表明树突和轴突结构的分化。
神经元基因表达可进一步利用神经元-特异的引物通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行分析。所述制备物包含表达谷氨酸脱羧酶(GAD6 5)′calbindin D28，NMDA受体1，2A.2B，20，(1-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸盐(AMPA)受体，和GABAA受体的细胞。在每种情况下，由分化细胞总RNA中应检测到更大量的转录物。
为研究这些神经元细胞是否相应于位于任何特定CNS区域的细胞，检测了沿前后轴的三个位置特异性标记的表达。Otx-1主要在前脑和中脑表达，En-1在中脑和后脑分界处表达，Hoxa-7在脊髓后部表达。未分化的HS细胞应表达Hoxa-7，但不表达Otx-1和En-1。因此后部标记Hoxa-7的表达应在bFGF存在下增殖的nestin-阳性细胞中下调10天以上。相反，Otx-1和En-1在这些增殖细胞中应上调。通过更换为含B27和血清的神经基础培养基进行分化后，Hoxa-7的表达再次上调，Otx-1和En-1的表达应保持。不同转录因子的存在表明所述制备物产生了不同CNS区域的特征性神经元。
(d)感觉器官和周围神经元的支持细胞感觉器官和周围神经元的支持细胞的例子包括但不限于柯蒂氏器的支持细胞(如，内部和外部的柱细胞，内部和外部的指细胞，边缘细胞，Hensen细胞)；前庭器官的支持细胞；味蕾的支持细胞；嗅觉上皮的支持细胞；施旺氏细胞；肠神经胶质细胞；和卫星细胞。
本发明的分离的HS细胞可分化成支持细胞，或直接分化或是通过合适的前体细胞，利用本领域已知的分化ES细胞、EC细胞、其他多能或干细胞和/或畸胎癌细胞的技术进行。
(e)感觉传导器感觉传感器的例子包括但不限于1)光受体；听觉感受器(如，柯蒂氏器的内部和外部毛细胞)；2)加速度和重力感受器；2)味觉感受器(1I型味蕾细胞)；3)嗅觉感受器(如，嗅觉神经元)；血液pH感受器(I型和II型颈动脉体细胞)；4)触觉感受器(如，表皮Merkel细胞，初级感觉神经元)；5)温度和痛觉感受器(如，初级感觉神经元)；和6)肌肉骨骼系统中的构型和力感受器(本体感受初级感觉神经元)。
本发明的分离的HS细胞可分化成感觉传导器，特别是初级感觉神经元，或直接分化或是通过合适的前体细胞，如肌细胞，利用本领域已知的分化ES细胞、EC细胞、其他多能或干细胞和/或畸胎癌细胞的技术进行。
分化成生殖细胞涉及生殖的细胞包括生殖细胞(germcell)，如卵母细胞和精母细胞，抚育细胞，如卵巢滤泡，胸腺上皮细胞和支持细胞。
本发明的分离的HS细胞可分化成生殖细胞，或直接分化或是通过合适的前体细胞，如卵原细胞，精原细胞或原生殖细胞(起源于卵黄囊内胚层的)，利用本领域已知的分化ES细胞、EC细胞、其他多能或干细胞和/或畸胎癌细胞的技术进行。
E.实施例实施例1.纯合干细胞的形成，及其分化成祖细胞及在畸胎瘤内三个胚层中的各种组织实施例1(a)通过激活作用，其后通过阻止第二极体挤出由小鼠减数分裂I后的卵母细胞衍生HS细胞利用下述方法通过超数排卵由杂交的(BDA2 F1C57 black xDBA2，Charles River Laboratories，Wilmington，MA)、8周龄雌性小鼠获得73个卵母细胞。通过注射方式向三只杂交小鼠施用5IU/100ul孕马血清促性腺素(PMS；PCCA，Houston，TX(29-10001BX))和5IU/100μl人绒毛膜促性腺素(HCG；Sigma，St.Louis，MO，(C8554))，两次注射间隔约48小时。
注射HCG约17小时后收获卵母细胞，在一滴(约300μl)以终浓度为0.3mg/ml溶于M2培养基(M7167，Sigma)的透明质酸酶(H4272，Sigma)中温育新获得的卵母细胞，排除卵丘团。然后在进行进一步处理前用HEPES缓冲的M2培养基将所述卵母细胞洗涤三次。
用5μM钙离子载体(C7522，SigmaCa2+1mg/764.8μl；DMSO2.5mM＝500x(储液)；终浓度2μl Ca2+(500X)/1ml M2＝5μM)溶液在室温下处理卵母细胞5min使之激活。然后用HEPES缓冲的M2培养基将卵母细胞洗涤两次。
Ca++激活的卵母细胞在含有6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP(D2629，Sigma)；250mM＝50x(储液)；终浓度20μl/1ml M16＝5mM)的M16碳酸氢盐缓冲的培养基(M7292，Sigma)，5％CO2，37℃条件下温育3小时。然后用M16培养基将卵母细胞洗涤三次，然后在矿物油下的M16培养基中温育至少4天。
在M16培养基中温育4-5天后从Ca++激活的卵母细胞中收获类似胚泡的细胞团。将包围这些胚泡样团的壳剥离(″孵化″)后，将它们转移到ES培养基(DMEMGibco，Life Technologies，Rockville，MD(11995-065)；20％FBSGibco(16141-079))中经丝裂霉素-C处理的小鼠胚胎饲养细胞层上至少15天以形成干细胞。
或者通过免疫外科方法从孵化的胚泡样团衍生干细胞。孵化的胚泡样团与抗-小鼠Thy-1兔血清(1∶10，ACL2001，Accurate Chemical，Westbury，NY)和抗-人淋巴细胞兔血清(1∶10，CL8010，AccurateChemical)在37℃下一起温育1小时。用M2培养基洗涤细胞团三次，再用豚鼠补体(1∶10，ACL4051，Accurate Chemical)在37℃下温育30min以裂解滋养层细胞。然后将用补体处理的细胞团在M2培养基中洗涤3次，然后转移到经丝裂霉素-C处理的小鼠胚胎饲养细胞层中以形成干细胞至少15天。
小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞购自Stemcell，Inc.(00308)，传代2-3次。将一个铺满扩增饲养细胞的60mm培养皿用含丝裂霉素-C(终浓度10μg/ml，Sigma M4287)的5ml DMEM/10％FBS于37℃下处理3小时。将处理后的饲养细胞用5ml DMEM/10％FBS洗涤3次，通过1ml胰蛋白酶在37℃下处理5min，用5ml DMEM/10％FBS培养基中和，然后1000rpm离心5min而收集。经丝裂霉素处理的细胞颗粒状沉淀重悬于15ml DMEM/10％FBS培养基中，铺于三个60mm培养皿(5ml细胞悬液/培养皿)，在使用前于37℃下温育过夜。
实施例1(b)通过激活，其后通过阻止第二极体挤出使人二倍体卵母细胞发育为胚泡样细胞团用leurplide acetate(Lupron TAP Pharmaceuticals，Deerfield，IL)下调雌性卵子供体，然后以300IU/天的剂量接受促滤泡激素(FSH)(Seromo Pharmaceutical)的处理开始COH(控制的卵巢超刺激)，从而诱导合适的多滤泡反应。当满足滤泡成熟超声波检查标准时，施用单一剂量10,000IU的hCG，然后在施用hCG约36小时后，经阴道将卵泡吸出。将其暴露于80IU/ml透明质酸酶约30秒，而后暴露于添加了10％人血清白蛋白(InVitroCare，Inc.，SanDiego，CA)的HEPES-缓冲的人输卵管液，从而去除卵母细胞中的卵丘。
为实现有丝分裂激活，用5μM钙离子载体(A23187，Sigma)在33℃下处理无卵丘的成熟M-II卵母细胞5min，而后在1-5mM 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP，Sigma)中于37℃下温育3-5小时。被激活的卵母细胞在IVC-1培养基(InVitroCare，Inc.)中温育3天，然后在IVC-3(InVitroCare，Inc.)中进一步温育2天以进行细胞分裂并使胚泡形成。另外，第二天的胚胎样细胞团可在STO饲养细胞上培养。在第6天，通过下述操作进行辅助孵化，即在显微操作器下，用显微操作器的一个臂施加酸化的台氏液使之达透明带总外表面面积的1/8，同时用显微操作器的另一个臂固定透明带。其后胚泡从弱化的带中释放出来，再用抗-Thyl和补体处理所得胚泡，以免疫外科的方式消除滋养外胚层的细胞。然后在经丝裂霉素处理的STO饲养细胞(ATCC)上，在干细胞培养基中培养经处理的胚泡，所述培养基在添加了非必需氨基酸，青霉素-链霉素(Life Technologies)，β-巯基乙醇(Sigma)和LIF(Chemicon)的DMEM培养基中含20％胎牛血清(Lifetechnologies)。参见图8D。
实施例1(c)通过激活，其后通过允许第二极体挤出和基因组自我复制作用使人减数分裂I后的二倍体卵母细胞发育为胚泡样细胞团用leurplide acetate(Lupron TAP Pharmaceuticals，Deerfield，IL)下调雌性卵子供体，然后以300IU/天的剂量接受促滤泡激素(FSH)(Seromo Pharmaceutical)的处理开始COH(控制的卵巢超刺激)，从而诱导合适的多滤泡反应。当满足滤泡成熟超声波检查标准时，施用单一剂量10,000IU的hCG，然后在施用hCG约36小时后，经阴道将卵泡吸出。将其暴露于80IU/ml透明质酸酶约30秒，而后暴露于添加了10％人血清白蛋白(InVitroCare，Inc.，SanDiego，CA)的HEPES-缓冲的人输卵管液，从而去除卵母细胞中的卵丘。
为实现有丝分裂激活，使无卵丘的成熟M-II卵母细胞经假ICSI(胞浆内精子注射)处理，模拟由精子诱导的激活作用而后与25μM钙离子载体(A23187，Sigma)在33℃下温育5min。经此种方式激活的卵母细胞挤出第二极体成为单倍体。将所述单倍体卵母细胞在IVC-1培养基(InVitroCare，Inc.)中温育3天，然后在IVC-3(InVitroCare，Inc.)中进一步温育2天以进行细胞分裂并使胚泡形成。另外，第二天的胚胎样细胞团可在STO饲养细胞上共培养。在第6天，通过下述操作进行辅助孵化，即在显微操作器下向胚泡带外部施加酸化的台氏液。胚泡然后从弱化的带中释放出来，在经丝裂霉素处理的STO饲养细胞(ATCC)上，在干细胞培养基中培养，所述培养基在添加了非必需氨基酸，青霉素-链霉素(Life Technologies)，β-巯基乙醇(Sigma)和LIF(Chemicon)的DMEM培养基中含20％胎牛血清(Lifetechnologies)。
由激活作用所得的单倍体卵母细胞在无胞质分裂的情况下能自我复制其基因组形成二倍体细胞(Taylor，A.S.，等，″The earlydevelopment and DNA content of activated human oocytes andparthenogenetic human embryos，″Hum.Reprod.9(12)2389-97(1994)；Kaufman，M.H.等，″Establishment of pluripotentialcell lines fiom haploid mouse embryos，″J.Embryol.Exp.Morphol.73249-61(1983)。在第6天，通过下述操作进行辅助孵化，即在显微操作器下向胚泡带外部施加酸化的台氏液。胚泡然后从弱化的带中释放出来，在经丝裂霉素处理的STO饲养细胞(ATCC)上，在干细胞培养基中培养，所述培养基在添加了非必需氨基酸，青霉素-链霉素(Life Technologies)，β-巯基乙醇(Sigma)和LIF(Chemicon)的DMEM培养基中含20％胎牛血清(Life technologies)。参见图8A-C。
实施例1(d)小鼠HS细胞的生长，这些HS细胞在小鼠肾囊中的分化，及由这些细胞形成胚状体将由实施例1(a)中所述的胚泡样团中获得的HS细胞接种到0.1％明胶包被的培养皿(10cm)中的ES细胞培养基中，所述培养基含1,400U ml-1的白血病抑制因子(LIF)(ESGROTM)，Chemicon ESG1106106单位/ml[ES培养基500mlknock-DMEM(Gibco 10829-018)425ml；FCS(合格的ES细胞，Gibco 16141-061)75ml；MEM非必需AA溶液(Gibco 11140-050)5ml；青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Gibco10378-016)5ml；2-巯基乙醇(Gibco 21985-023)0.5ml至最终100μM，于实施例1(b)所述的小鼠饲养细胞层生长集落]。
HS细胞集落分成几部分，植入26个杂交小鼠两个肾囊之一以诱导干质形成。在植入后的第1，3，6，9.5，10.5，11，12，和14周处死小鼠收获干质。将每个干质的一半用福尔马林固定用于形态学研究，另一半于-80℃下冷冻用于分子表征。干质在三周左右开始形成可见大小。交错收集干质，研究在干质中发育的各种组织类型。此处所鉴定的所有组织类型都是由所述的干质产生的。通过如前所述的基于PCR的等位基因分析鉴定干质基因型。
为构建胚状体(EB)，在60mm的培养皿中先将HS细胞用PBS洗两次。然后加入1ml胰蛋白酶/EDTA溶液，再使所述细胞在37℃下保持5min。再加入5ml ES培养基，将细胞用刮刀刮出，1000rpm离心5min。将所得的细胞颗粒状沉淀重悬于5ml无LIF的ES培养基中，对细胞计数。再将细胞以2×106/10cm培养皿接种于细菌培养皿中。使细胞在ES培养基中培养4天，每两天按下述方式更换一次培养基，即将所述细胞转移到15ml的管中，等待约5min使细胞完全沉降到管底，然后更换培养基。将细胞聚集在一起以形成EB，然后转移到最初的培养皿中进一步分化。
实施例1(e)人HS细胞在畸胎瘤内的分化，以及所述分化组织的遗传纯合性由病理学军事学院研究所(the Armed Forces Institute ofPathology)Washington，DC，和纽约大学病理学系.New York，NY(Dr.J.Liu)的保存档案中索取了31个畸胎瘤。从女性患者的20个卵巢肿瘤中获得多种不同类型的专门分化的组织。如在代表性的病例中用本领域已知的方法通过FISH分析和针对染色体3和8的α-卫星探针所确证的，发现分化的组织是二倍体。鉴定了3到12个来自女性患者的7个卵巢肿瘤和来自男性患者的4个睾丸肿瘤的分化组织区域及分化的组织，并对每一病例进行选择性地显微解剖以进行遗传分析。发现在每一病例中，分化的组织是遗传上纯合的，未分化的组织是遗传上杂合的。
显微解剖.将玻片上未染色的6微米切片用二甲苯脱蜡，用100％到80％的乙醇漂洗，用苏木精和曙红漂染，然后用含10％甘油的TE缓冲液漂洗。在直接的光显微显现下进行显微解剖。每一病例中将6到12个不同的组织分化区域分别通过显微解剖进行遗传分析。此外还采集了几个正常的区域和非肿瘤组织区域。
DNA提取.将收集的细胞立即重新悬浮于25μl含Tris-HCl，pH8.0；1.0mM乙二胺四乙酸，pH8.0；1％Tween20，和0.5mg/ml蛋白酶K的缓冲液中于37℃下温育过夜。将上述混合物煮沸5min以灭活蛋白酶K，用其中的1.5μl溶液进行DNA的PCR扩增。
遗传分析.为可靠地鉴定显微解剖后获得的有限量的DNA中的纯合性，用多达14个不同的高度多态的微卫星标记对多个不同的显微解剖的组织样品进行了分析，所述的微卫星标记包括DIS1646和D1S243(Ip)，D3S2452(3p)，D5S346(5q)，D7S1822(7q)，Ank-1(8p)，D9S171(9q)，D9S303(9q)，Int-2和PYGM(11q)，IFNA(9p)，D17S250(17q)，CYP2D(22q)，和AR(Xq)。每一PCR样品含上述的模板DNA1.5μl，每种引物各10pmol，dATP，dCTP，DGTP，和DTTP各20nmol，15mM MgCl2，0.1U Taq DNA聚合酶，0.05ml[32P]dCTP(6000Ci/mmol)，和1μl 10X缓冲液，总体积10μl。进行35个PCR循环95℃下变性1min，退火1min(退火温度根据标记物的不同在55到60℃之间)，及72℃下延伸60sec。最后一次延伸持续10min。将标记的扩增DNA产物与等体积的甲酰胺上样染料(95％甲酰胺，20mM EDTA，0.05％溴酚蓝，和0.05％二甲苯靛)混合。
将样品在95℃下变性5min，上样于6％丙烯酰胺(丙烯酰胺双丙烯酰胺49∶1)的凝胶上1800V下电泳90min。电泳后，将凝胶转移到3mm Whatman滤纸上干燥。用Kodak X-OMAT膜(Eastman Kodak，Rochester，NY)放射自显影。
结果表现出一致的相同等位基因纯合性的已分化畸胎瘤组织包括鳞状上皮，神经胶质，和软骨(利用标记Ankl(顶部)和D1S1646(底部)分析)显微解剖样品。正常的卵巢组织作为对照。
在畸胎瘤亚型中，发现分化的畸胎瘤组织具有不协调的纯合等位基因(通过对下述标记进行分析Int-2，D9S303，D1S1646，D3S2452，和Ankl)包括表皮，皮脂腺，呼吸道上皮，和神经胶质样品。正常的卵巢组织作为对照。在这些肿瘤中，等位基因的杂合性是由生殖细胞中减数分裂前的肿瘤发生引发的。致畸形肿瘤细胞引发后，通过随机和独立的事件导致带有减数分裂后基因型的祖细胞形成。
分析了一系列包含分化的和未分化组织的卵巢畸胎瘤和睾丸生殖细胞肿瘤。在每一肿瘤中均发现了分化的和未分化的组织元件。使用标记D3S2452，D3S303，CYP2D，和D17S250检测了纯合和杂合的组分。正常的卵巢和睾丸组织作为对照。在未分化的组织元件中检测到杂合的等位基因，所述组织包括未成熟的鳞状上皮，神经组织(有的是在同一肿瘤神经组织的不同区域中)，软骨，腺体结构，和间质。发现从同一肿瘤中通过显微解剖分离出的分化组织元件对于同一标记是纯合的。检测的成熟元件包括皮脂腺组织，毛囊，和成熟的鳞状上皮(有的是在同一肿瘤鳞状上皮的不同区域中)。在一些肿瘤中，分化的元件表现出相反的纯合等位基因，表明有重组事件发生或表明有来自不同减数分裂后细胞的不同元件。
实施例1(f).由人HS细胞衍生祖细胞初级分化将与原代胚胎成纤维细胞层一起生长在60mm培养皿(Falcon，#353802)和/或0.1％明胶包被的培养皿中的HS细胞经1.5ml胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen，#25300-050)胰蛋白酶化，然后转移到15ml锥形管中的1.5ml ES-LIF培养基中。1200rpm将细胞离心下来，然后弃上清。将所得细胞颗粒状沉淀重悬于2ml ES-LIF培养基中制成单细胞悬液，作为悬浮细胞以1-3X106细胞的密度于悬浮培养-35*10mm培养皿(NalgeNunc，#171099)中培养4-6天，使干细胞长成圆球形的簇，称作胚状体(EBs)。每两天将形成中的Ebs转移到15ml锥形管中进行洗涤，然后使细胞沉到管底。弃上清加入新的ES-LIF。然后将EBs转回到悬浮培养培养皿中。HS细胞长成的胚状体包含全部三个生殖细胞层，外胚层，内胚层，和中胚层。
外胚层祖细胞.4-6天后，将EB用1ml胰蛋白酶/EDTA进行胰蛋白酶消化，在4ml ES-LIF培养基中洗涤，然后在添加了10％血清替代物(Invitrogen，#10828)，和G5(Invitrogen，#17503)，N2(Invitrogen，#17502-048)或βNGF(100ng/ml)(R&D Systems，#256-GF)的DMEM/敲除培养基(Invitrogen，#10829-018)中重悬成单细胞悬浮液。将这些细胞在3-5X105/3ml纤连蛋白包被的35mm培养皿中(50μg/ml)(Sigma，#F-0895)培养10天，每2-3天更换一次培养基。
另外，EB在0.1％明胶包被的培养皿中的ES-LIF培养基中培养1-2天，然后将所述培养基换成添加了胰岛素(5ug/ml)，氯化硒(.015nM)转铁蛋白(50μg/ml)，和纤连蛋白(5μg/ml)(Sigma)的无血清培养基培养6天。将所述细胞用胰蛋白酶消化，然后将单细胞悬液在N2培养基(添加了N2(Invitrogen，#I7502-048)，B27(Invitrogen，#I7504-44)，和bFGP(10ng/mL)(Invitrogen，#13256 029)的无血清-DMEM/F12)中培养。进行细胞计数，然后以2-5X104细胞/孔/400μlN2培养基的密度接种到用聚-L-鸟氨酸(15μg/ml)(Sigma，#P36550)预包被的24孔板，扩增6天。
添加G5，RA，FGF，NGF，GNDF，或BNDF使这些祖细胞进一步分化成不同的神经元细胞类型。它们也维持在它们存在的条件培养基中继续培养。
中胚层祖细胞.为形成中胚层祖细胞，将所述的单细胞悬液在上述添加了10％血清替代物和β-NGF的DMEM/敲除培养基中培养10天，每2/3天更换一次培养基。此后，将所述细胞进一步在添加了活化素A(20ng/ml)(Sigma，#A4941)的条件培养基中继续培养10天以形成心脏祖细胞。为形成肾脏和副中肾管祖细胞可使上述细胞在添加了活化素A(20ng/ml)(Sigma，#A4941)的条件培养基中培养4-6天，然后向其中添加2ng/ml TGF-β(R&D Systems，#)，将细胞继续培养4-6天。
内胚层祖细胞.为形成内胚层祖细胞，将所述单细胞悬液与G5或β-NGF一起在添加了10％血清替代物及层粘连蛋白包被的(10μg/ml)(Sigma，#L2020)，或胶原I包被的(10μg/ml) (Sigma，#C-7661)DMEM/敲除培养基中培养10天。向培养基中添加HGF(20ng/ml)和/或TGF-α(2ng/ml)以替代G5或β-NGF，继续培养细胞6-8天。
另外，将Ebs铺于胶原I包被的培养皿中并且在ES-LIF培养基中培养4天。加入FGF(20ng/ml)使细胞继续培养3天。此后，加入HGF(20ng/ml)和/或TGF-α(2ng/ml)继续培养6天。
Ebs也转移到层粘连蛋白包被的粘附培养皿(10ng/ml)(Sigma，#L2020)或0.1％明胶包被的35*10mm粘附培养皿中，并且在ES-LIF培养基中培养1-2天。弃去该培养基，换成添加了胰岛素(5ug/ml)(Invitrogen，#I1882)，氯化硒(0.015nM)(Sigma，#S5261)，转铁蛋白(50μg/ml)(Sigma，#T-2036)，和纤连蛋白(5μg/ml)(Sigma)的无血清DMEM/F12(Invitrogen，#11330 0321)培养基。该培养基命名为ITSFn培养基。将所述细胞在ITSFn中培养6天，每两天更换一次培养基。
实施例1(g)由移植的HS细胞发育和分离纯合祖细胞为获得纯合祖细胞，将由上述说明书和实施例的方法所得到的多能HS细胞移植到无免疫应答的小鼠肾囊下，使其在N2培养基(添加了N2(Invitrogen，#I7502-048)，B27(Invitrogen，#I7504-44)，和bFGF(10ng/mL)(Invitrogen，#13256029))的无血清-DMEM/F12培养基)中培养。进行细胞计数，然后以2-5X104细胞/孔/400μl N2培养基的密度接种到用聚-L-鸟氨酸(15μg/ml)(Sigma，#P36550)预包被的24孔板，扩增6天。
添加G5，RA，FGF，NGF，GNDF，或BNDF使这些祖细胞进一步分化成不同的神经元细胞类型。它们也维持在它们存在的条件培养基中进行细胞扩增。
中胚层祖细胞.为形成中胚层祖细胞，将所述的单细胞悬液在上述添加了10％血清替代物和β-NGF的DMEM/敲除培养基中培养10天，每2/3天更换一次培养基。此后，将所述细胞进一步在添加了活化素A(20ng/ml)(Sigma，#A4941)的条件培养基中继续培养10天以形成心脏祖细胞。为形成肾脏和副中肾管祖细胞可使上述细胞在添加了活化素A(20ng/ml)(Sigma，#A4941)的条件培养基中再培养4-6天，然后向其中添加2ng/ml TGF-β(R&D Systems，#)，将细胞继续培养4-6天。
内胚层祖细胞.为形成内胚层祖细胞，将所述单细胞悬液与G5或β-NGF一起在添加了10％血清替代物及层粘连蛋白包被的(10μg/ml)(Sigma，#L2020)，或胶原I包被的(10μg/ml)(Sigma，#C-7661)DMEM/敲除培养基中培养10天。向培养基中添加HGF(20ng/ml)和/或TGF-α(2ng/ml)以替代G5或β-NGF，继续培养细胞6-8天。
另外，将Ebs铺于胶原I包被的培养皿中并且在ES-LIF培养基中培养4天。加入FGF(20ng/ml)使细胞继续培养3天。此后，加入HGF(20ng/ml)和/或TGF-α(2ng/ml)继续培养6天。
Ebs也转移到层粘连蛋白包被的粘附培养皿(10ng/ml)(Sigma，#L2020)或0.1％明胶包被的35*10mm粘附培养皿中，并且在ES-LIF培养基中培养1-2天。弃去该培养基，换成添加了胰岛素(5ug/ml)(Invitrogen，#I1882)，氯化硒(0.015nM)(Sigma，#S5261)，转铁蛋白(50μg/ml)(Sigma，#T-2036)，和纤连蛋白(5μg/ml)(Sigma)的无血清DMEM/F12(Invitrogen，#11330 0321)培养基。该培养基命名为ITSFn培养基。将所述细胞在ITSFn中培养6天，每两天更换一次培养基。
实施例1(g)由移植的HS细胞发育和分离纯合祖细胞为获得纯合祖细胞，将由上述说明书和实施例的方法所得到的多能HS细胞移植到无免疫应答的小鼠肾囊下，使其在体内生长4-6周。所得的细胞团粉碎成单细胞，在饲养细胞上培养以进一步增殖并发育成细胞系。
对已知的细胞系特异的标记，例如，针对外胚层的NF-H，角蛋白，D-β-H，针对中胚层的烯醇酶，CMP，凝乳酶，激肽释放酶，WT1，δ-珠蛋白，β-珠蛋白，及针对内胚层祖细胞系的白蛋白，α-1-AT，淀粉酶，PDX-1，胰岛素，α-FP进行基因表达测定，如RT-PCR，northern印迹，免疫组织化学等，从而评估细胞系定型(祖细胞的类型)。
实施例2.小鼠HS细胞分化成来自中胚层的细胞实施例2(a)分化成造血细胞小鼠HS细胞在ES培养基(DMEM Gibco 1195-065；FBS Gibco16141-079，100μM非必需氨基酸Gibco 11140-050；50单位/ml青霉素-链霉素Gibco 15070-063；100μM-巯基乙醇Gibco 21985023)中与LIF(1000IU/ml)共同培养3-5天。利用胰蛋白酶/EDTA(Gibco25300-054，1ml/60mm；培养皿)在37℃下处理5min对所述细胞进行胰蛋白酶处理，然后添加5ml ES培养基。用细胞刮刀将小鼠干细胞从培养皿中取出，将细胞悬液1000rpm离心5min。将所得的细胞颗粒以2×106/10cm的细胞浓度重悬于无LIF但含4.5×10-4MMTG(单硫代甘油Sigma M6145)ES培养基中37℃、5％CO2下，维持4天。悬液中的小鼠HS细胞聚集形成胚状体(EBs)。
将所形成的30-40个EB转移到35mm培养皿中的3ml基于甲基纤维素的造血细胞分化培养基M3434(Stemcell 03434)中，该培养基包含胎牛血清，牛血清白蛋白，牛胰岛素，人转铁蛋白(铁饱和的)，β-巯基乙醇，L-谷氨酰胺，rm IL-3，rh IL-6，rmSCF和rh-促红细胞生成素，在37℃、5％CO2条件下温育。温育10天后，用移液头挑出几个集落和不同类型的细胞，将其重悬于500μl IMDM培养基(Sigma13390)。将所述混合物转移到4孔腔玻片，将所述玻片在37℃下温育至少3小时，使所述细胞和集落粘附于玻片上。当细胞粘附于玻片上以后，弃去IMDM培养基，将细胞在甲醇中固定7分钟。甲醇固定后将所述玻片在空气中干燥，在室温下用1∶20稀释的Giemsa(SigmaGS-500)染色30min，然后用水漂洗三次。培养10天后可观察到集落和不同类型的造血细胞。用上述方法获得的CFU(集落形成单位)参见图5A，红细胞参见图5B，单核细胞参见图5C，淋巴细胞参见图5D。
在M3434中生长了10-15天的EBs也转移到含有IMDM，10％FBS和单独的IL-3(Stemcell 02733)或IL-3及GM-CSF(Stemcell 02732)的组合的35mm培养皿中。如上所述对细胞进行固定和染色并观察在带有细胞因子的液体IMDM中5天内由EBs开始的细胞分化。由含IL-3的IMDM分化的细胞包含粒细胞但无单核细胞，由含IL-3和GM-CSF的IMDM分化的细胞含粒细胞和一些单核细胞(参见图SE和5F)。
实施例2(b)分化成自发性收缩肌细胞小鼠HS细胞在ES培养基(DMEM Gibco 1195-065；FBS Gibco16141-079，100μM非必需氨基酸Gibco 11140-050；50单位/ml青霉素-链霉素Gibco 15070-063；100μM-巯基乙醇Gibco 21985023)中与LIF(1000 IU/ml)共同培养3-5天。利用胰蛋白酶/EDTA(Gibco25300-054，1ml/60mm；培养皿)在37℃下处理5min对所述细胞进行胰蛋白酶处理，然后添加5ml ES培养基。用细胞刮刀将小鼠干细胞从培养皿中取出，将细胞悬液1000rpm离心5min。将所得的细胞颗粒以2×106/10cm的细胞浓度重悬于无LIF的ES培养基中37℃、5％CO2下，维持4天。悬液中的小鼠HS细胞聚集形成胚状体(EBs)。
10-15个形成的EBs转移到用明胶包被的24孔板(每孔加入1ml0.1％明胶在通风橱中放置2小时以上。去除明胶使所述板干燥30min)在无LIF的ES培养基中温育，每两天更换一次培养基。在第4天前后，自发收缩细胞或搏动Ebs出现并持续搏动达3-4天(参见图6)。
此外，搏动EBs可在37℃和5％CO2条件下于称作M3434(Stemcell03434)的包含下列组分的半固体培养基(含1％甲基纤维素)中温育而诱导产生，所述组分为胎牛血清，牛血清白蛋白，牛胰岛素，人转铁蛋白(铁饱和的)，β-巯基乙醇，L-谷氨酰胺，rm IL-3，rh IL-6，rm SCF和rh-红细胞生成素。温育3-4天后可观察到搏动EBs。
搏动EBs也可通过使EB在37℃和5％CO2的条件下在无血清ITSFn培养基中温育4天而形成，该培养基包含含有胰岛素(5μg/ml，Sigma11882)，氯化硒(30nM，Sigma S5261)和纤连蛋白(5μg/ml，SigmaF1141)的DMEM/F12(Gibco 11320-033)。
实施例3.小鼠HS细胞分化成来源于内胚层的细胞实施例3(a)分化成胰腺细胞将与原代胚胎成纤维细胞层一起生长在60mm培养皿(Falcon，#353802)和/或0.1％明胶包被的培养皿中的HS细胞经1.5ml胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen，#25300-050)胰蛋白酶化，然后转移到15ml锥形管中的1.5ml ES-LIF培养基中。1000rpm将细胞离心下来，然后弃上清。
将所得细胞颗粒状沉淀重悬于2ml ES-LIF培养基中制成单细胞悬液，作为悬浮细胞以1-3×106细胞的密度于悬浮培养-35*10mm培养皿(NalgeNunc，#171099)中培养4-6天，使干细胞长成圆球形的簇，称作胚状体(EBs)。每两天将形成中的Ebs转移到15ml锥形管中进行洗涤，然后使细胞沉到管底。弃上清加入新的ES-LIF。然后将EBs转回到悬浮培养培养皿中。HS细胞长成的胚状体包含全部三个生殖细胞层，外胚层，内胚层，和中胚层。
胰腺前体细胞的筛选.作为胚状体培养4-6天后，将所述细胞转移到15ml锥形管使其沉降。去除一半培养基向管中添加1.5ml新鲜的ES-LIF培养基，然后将管中的全部内容转移到0.1％明胶包被的35*10mm粘附培养皿中过夜培养。第二天，去除ES-LIF培养基，换成添加了胰岛素(5ug/ml)(Invitrogen，#I1882)，氯化硒(0.015nM)(Sigma，#S5261)，转铁蛋白(50μg/ml)(Sigma，#T-2036)，和纤连蛋白(5μg/ml)(Sigma)的无血清DMEM/F12(Invitrogen，#113300321)培养基。该培养基命名为ITSFn培养基。将所述细胞在ITSFn中培养6天，每两天更换一次培养基培养基。
EBs也在层粘连蛋白包被的粘附培养皿(10ng/ml)(Sigma，#L2020)中的ES-LIF培养基中培养2-4天使内胚层细胞从胚状体中迁移出来，在添加了下述成分的8.7mM葡萄糖DMEM/F12无血清培养基中扩增4天，所添加的成分为N2(Invitrogen，#I7502-048)，B27(Invitrogen目录#I750444)，和bFGF(10ng/mL)(Invitrogen，#13256-029)。内胚层扩增后，将所述培养基换为ITSFn培养基，使所述细胞在ITSFn中培养6天，每两天更换一次培养基以筛选胰腺前体细胞。
或者，4-6天后，将EB用1ml胰蛋白酶/EDTA进行胰蛋白酶消化，在ES-LIF培养基中洗涤，然后在添加了10％血清替代物(Invitrogen，#10828)，和G5(Invitrogen，#17503)，N2(Invitrogen，#17502-048)或βNGF(100ng/ml)(R&D Systems，#256-GF)的DMEM/敲除培养基(Invitrogen，#10829-018)中重悬成单细胞。将这些细胞以3-5×105/3ml在纤连蛋白包被的35mm培养皿(50μg/ml)(Sigma，#F-0895)中培养4-6天，每2天更换一次培养基。4-6天后，加入ITSFn培养基替换DMEM/敲除培养基，将所述细胞继续培养6天以筛选胰腺前体细胞。
胰腺前体细胞对于早期标记Nestin，neurogenin 3，和酪氨酸羟化酶是阳性的。
由bFGF扩增胰腺前体细胞.去除培养基后，用PBS将ITSFn培养基中的细胞洗两次。加入1mL胰蛋白酶/EDTA，使细胞在37℃下温育5min以引起解离。利用细胞刮刀使细胞进一步解离。然后向培养皿中加入3ml ES-LIF培养基，再将全部内容物转移到15ml锥形管中。使由胰腺前体筛选剩余的EBs沉降约2-5min，将上清液转移到新的15ml锥形管，1200rpm离心。弃上清，将所得细胞颗粒状沉淀重悬于5.8mM或更低浓度葡萄糖，添加了N2(Invitrogen，#17502-048)，B27(Invitrogen，#I7504-44)，和bFGF(10ng/mL)(Invitrogen，#13256-029)的无血清DMEM/F12培养基。这种培养基称作N2培养基。
细胞计数并以2-5×105细胞/孔/400uL N2培养基的密度接种于用聚-L-鸟氨酸(15ug/ml)(Sigma，#P36550)预包被的24孔板，扩增6-8天。或者，以2-5×104细胞/孔/400ul N2培养基的密度接种，扩增8-10天。
预包被方法如下在24-孔板的每个孔中加入400μl 15ug/ml聚-L-鸟氨酸在室温下放置过夜；然后用PBS洗两次，加入新鲜的PBS在37℃下温育30min；用PBS洗板，加入400μl纤连蛋白(10μg/ml)，使用前在室温下至少温育2小时。
胰腺前体细胞分化成分泌胰岛素的β-胰岛细胞通过从N2培养基中去除bFGF，并在100ng/ml EGF(Invitrogen，#53003-018)，20ng/ml HGF(Sigma，#H1404)，和20ng/ml活化素A(Sigma，#A4941)或20ng/ml VEGF(R&D Systems，#298-VS)存在下诱导胰腺前体细胞分化成分泌胰岛素的β胰岛细胞。使细胞分化6天，每两天更换一次培养基。一旦开始分化，所述的上皮胰腺细胞形成小的圆形细胞，其可迅速增殖形成组织化的细胞簇，表现为平滑的球体，参见图7A。
分泌胰岛素的β胰岛细胞的检测.为检测胰岛素的产生和分泌，去除分化培养基，替换为添加了10mM尼克酰胺，.015nM氯化硒，50ug/ml转铁蛋白，.1mM腐胺(Sigma，#P5780)，和20nM孕酮(Sigma，#P8783)的高葡萄糖的DMEM/F12。然后将这些细胞在37℃下温育3h。3小时后，收集每孔中的培养基于-70℃保存以进行胰岛素释放测定，将每孔中的细胞在4％低聚甲醛(EMS，#15712)中室温下固定30min以进行免疫细胞化学测定，或通过RNAzol(Tel-Test，Inc.，Friendswood，TX，#CS-105)从每孔中收集RNA以进行基因表达的RT-PCR分析。在一些实验中，通过4℃下酸-乙醇提取过夜测定上述胰腺球体簇中的胰岛素含量，替代免疫组织化学或RT-PCR。收集无细胞提取物用0.4MTris-碱中和，贮存于-70℃以备进行胰岛素含量测定。
免疫组织化学室温下在4％低聚甲醛中固定30min后将细胞在PBS(Biofluids，#P312-500)中洗3次。室温下将这些细胞在100％甲醇(Fischer Scientific，#HC400 1gal)中进一步固定并透化5min。然后将所述细胞再在PBS中洗3次并用封闭溶液(DAKO Envision双染色系统，#K1395)封闭5min。排除过量的封闭缓冲液，加入第一抗体使细胞在室温下温育2小时。对于胰岛素，所用的第一抗体是多克隆豚鼠抗-胰岛素(DAKO，#A0564)1∶50的稀释液。所用的稀释液是用培养基B(Caltag，#GAS002)配制的。
将所述细胞用PBS漂洗3次，加入HRP-偶联的第二抗体(第2瓶)(DAKO，#K1395)，使细胞温育30min。用PBS将细胞漂洗3次，吸去过量的液体，加入液体的DAB+发色团底物(第3瓶)5-10min。最后再用PBS将细胞漂洗一次，在显微镜下镜检，参见图7B。
依照DAKO Envision双染色方案，(参见图7B)双染色胰高血糖素，1∶300(DAKO，#A0565)。也利用Pa×6，1∶300(Covance，#PRB-278P)，和抗体标记其他的细胞类型。供选择地，所有的免疫染色都是用荧光染料偶联的第二抗体(Sigma，Molecular Probes，或JacksonLabs)并在Leica倒置荧光显微镜下目测检查。
胰岛素的释放和细胞含量检测试验为测定胰岛素蛋白或胰腺球状簇中的胰岛素含量，对培养基或由每孔中收集的乙醇提取物进行酶联免疫分析，ELISA，(Crystalchem，Chicago，Illinois)。
实施例3(b)HS细胞分化成肝细胞下述的由HS细胞分化成肝细胞的方案是依照Hamazaki等″Hepatic maturation in differentiating embryonic stem cell invitro″，FEBS Lett.497(1)15-9(2001)。
纯合干细胞铺于组织培养皿(FALCON 35-3802，60×15mm规格，聚苯乙烯，无致热源的，Becton Dickinson Labware)上干细胞培养基中的经丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞(STO细胞)上，所述培养基在添加了非必需氨基酸，青霉素-链霉素(Life Technologies)，β-巯基乙醇(Sigma)和LIF(Chemicon)的DMEM培养基中含20％胎牛血清(Life technologies)。所述细胞在37℃，5％CO2条件下培养过夜。然后将HS细胞用胰蛋白酶-EDTA(0.05％-0.5％)(Life Technologies)进行胰蛋白酶消化，在悬浮培养皿(有盖和通风孔的悬浮培养皿，NalgeNunc International，171099，35×10mm)中培养，以形成胚状体，在不含LIF的同种培养基中培养5天。形成的胚状体转移到0.1％I型胶原(Sigma，C7661)包被的24孔板(Corning Incocrporated/Costar3524，24孔细胞培养板/平底，有盖/非无致热源的聚苯乙烯)中的含100ng/ml酸性成纤维细胞生长因子(Sigma，F-3133)的无LIF的干细胞培养基中培养3天。
3天后用含20ng/ml肝生长因子(Sigma，H-1404)的无LIF干细胞培养基替换上述的培养基培养6天，然后转入含有10ng/ml OSM(Sigma，0-9635)，10μM地塞米松(Sigma，D-6645)，5μg/ml亚硒酸(Aldrich，22985-7)，50μg/ml胰岛素(Invitrogen，I-1882)，和50μg/ml转铁蛋白(Sigma，T-2036)的无LIF干细胞培养基中。然后分析分化细胞的肝特异基因表达。所分析的基因，PCR退火温度，预期产物大小，和RTPCR引物序列如下运甲状腺素蛋白(TTR)55℃，225bp，5-CTC ACC ACA GAT GAGAAG，5-GGC TGA GTC TCT CAA TTC；α-胎蛋白(AFP)55℃，173bp，5-TCGTAT TCC AAC AGG AGG，5-AGG CTT TTG CTT CAC CAG；α-1抗-胰蛋白酶(AAT)，55℃484bp，5-AAT GGA AGA AGC CAT TCG AT，5-AAG ACT GTAGCT GCT GCA GC；白蛋白(ALB)，55℃260bp，5-GCT ACG GCA CAG TGCTTG，5-CAG GAT TGC AGA CAG ATA GTC；葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)55℃210bp，5-CAG GAC TGG TTC ATC CTT，5-GTT GCT GTA GTA GTC GGT；酪氨酸氨基转移酶(TAT)，50℃206bp，5-ACC TTC AAT CCC ATCCGA，5-TCC CGA CTG GAT AGG GTA G；β-肌动蛋白55℃，200bp，5-TTCCTT CTT GGG TAT GGA AT，5-GAG CAA TGA TCT TGA TCT TC；和SEK150℃，300bp，5-TGT ATG GAG CTC ATG TCT ACC；5-GTC TAT TCT TTC AGGTGC CA。
实施例4.小鼠HS细胞分化成外胚层细胞实施例4(a)分化成神经元前体细胞和功能性有丝分裂后神经细胞在一个实施方案中，诱导HS细胞形成神经元前体细胞。由HS细胞衍生的神经上皮前体细胞分化成神经元和神经胶质，并且进一步的分化导致多种类型的神经元-特异基因的表达，及产生兴奋和抑制性突触连接。在ES细胞中可见的位置特异的神经标记的表达方式表明存在多种中枢神经系统(CNS)神经元细胞类型。通过类推的方法，可知HS细胞也可产生可有效地分化成多种CNS结构的功能性有丝分裂后神经元的神经元前体细胞。
用Okabe等的方法引发HS细胞分化成多种神经元细胞和神经元(Okabe等，Mech.Dev.5989-102(1996))。
材料所用材料购自下述来源纤连蛋白，层粘连蛋白，神经基础培养基，B27添加物，和superscrip tII RNA酶H-逆转录酶购自Gibco/BRL(Grand Island，NY)；bFGF购自R&D Systems(Minneapolis，MN)；胰岛素，转铁蛋白，氯化硒，聚鸟氨酸，孕酮，腐胺，T3，阿糖胞甙，抗-MAP2抗体，抗-NF-M抗体，抗-GABA抗体，和抗-谷氨盐抗体购自Sigma(St.Louis，MO)；Taq聚合酶购自Bushranger-Mannheim(Mannheim，Germany)；抗-GFAP抗体购自ICNBiomedicals(Costa Mesa，CA)；抗角蛋白8抗体购自ATCC(Rockville，MD)；Vectastain ABC试剂盒购自Vectorlaboratories(Burlingame，CA)；双染色试剂盒和氨基-乙基咔唑购自Zymed Laboratories Inc.(Carlton Court，CA)抗磷酸化CREB抗体购自Upstate Biotechnology Inc.(Lake Plac id，NY)；BrdU染色试剂盒购自Amersham(Arlington Heights；IL)；荧光第二抗体购自Cappel(Durham，NC)。
Nestin-阳性细胞的筛选将在ES培养基悬浮培养物中(参见前述实施例中的培养基成分)保存4天的HS细胞簇(或EBs)转移到15ml管中。待EBs沉降后，去除一半ES培养基，向起始的培养皿中加入2.5ml新鲜的ES培养基。用ES培养基漂洗培养皿，然后加入到同一个15ml管中。EBs转移到新的组织培养皿中。24小时后更换ES培养基，加入含纤连蛋白(FN)，(按下述方式小心制备25μl储液/5ml培养基，即将ES细胞-合格的水加入5mg FN(1mg/ml)并4℃下静置于30min)的ITS培养基。(500ml ITS培养基DMEM/F12(1∶1)(Gibco12500-039)6g；胰岛素(Intergen 4501-01)2.5mg溶解于0.5ml无菌H2O和5mcl 10N NaOH；30mcl氯化硒(0.5mM)；0.775g葡萄糖；0.0365g谷氨酰胺；1.2g NaHCO3；和转铁蛋白(Sigma T-2036)25mg；pH7.5；5ml 100X P/S.)。
将细胞在含FN的ITS培养基中培养6-10天，每两天更换一次培养基；图9A表示培养6天后的nestin-阳性细胞。
通过bFGF扩增Nestin-阳性细胞保持在ITS/FN培养基中的细胞用PBS洗两次。1ml胰蛋白酶/EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.04％EDTA)加入培养基中，使所述细胞在37℃下保持5分钟使细胞解离。加入5mlES培养基(如前述实施例所述)，将细胞转移到15ml管中。
首先使EBs沉降，然后离心收集。将细胞颗粒状沉淀重悬于5ml含B27培养基添加物(B27无血清添加物50X，液体，Gibco 17504-44)的N2培养基中(N2培养基500mlf12/DMEM 6g；葡萄糖0.775g；谷氨酰胺0.0365g；NaHCO30.845g；胰岛素0.0125g；1M腐胺(储液)50μl(终浓度100uM)；0.5mM亚硒酸盐(储液)30mcl(终浓度30nM；0.1mM孕酮(储液)100mcl(终浓度20nM)；调整到PH7.2；5ml100XP/S.)。
细胞计数，然后以5×105细胞/孔的密度将细胞接种于24孔板(400mcl N2培养基)或5-7×106细胞/皿接种于6cm培养皿中(3ml N2培养基)，用聚-L-鸟氨酸(15μgml-1)和层粘连蛋白(1μgml-1)预包被的培养皿，均购自Bector Dickinson Labware，Bedford，MA.(预包被方案每孔(24孔板)插入无菌的盖片(assistent 1001/0012，12mm)；然后加入400μl聚-L-鸟氨酸(15μg/mT′)用PBS由1000X储液稀释，保持过夜；用PBS洗板，然后加入新鲜的PBS，将板置于37℃30min；再次用PBS洗板，然后加入400ul FN(1ug/ml)，再用PBS由1000X储液稀释；将板置于37℃至少2小时)。
添加含10-20ng/ml-1bFGF(R&D Systems，Minneapolis，MN)和B27添加物的N2培养基至铺板的细胞，使所述细胞在培养基中培养6天，每2天更换一次培养基。用含0.05％胰蛋白酶和0.04％EDTA的PBS解离细胞，离心收集重新涂布。
通过bFGF扩增的Nestin阳性细胞的分化.从细胞培养物中去除bFGF诱导细胞分化。使细胞簇在添加了层粘连蛋白(1mg ml-1)，存在或不存在购自Sigma，St.Louis，MO的cAMP(1mM)和AA(200uM)的N2培养基中铺开3-4天。将细胞在分化条件下温育6-15天。
免疫组织化学用含2％低聚甲醛的磷酸缓冲盐溶液(PBS；pH7.4)固定细胞20-30min，用0.2％Triton X-100PBS透化，用5％的正常山羊血清处理。然后将所述细胞与针对nestin(1∶1000；自Dr.M.Marvin，NIH)的第一抗体一起温育30min至1h。细胞也可以与针对角蛋白8(1∶1000)，脑脂肪酸结合蛋白(1∶1000)，MAP2(1∶200)，NF-M(1∶100)，突触素I(1∶1000)，GFAP(1∶50)，04，GalC(产生细胞的上清液)，GABA(1∶1000)，和谷氨酸盐(1∶500)的第一抗体一起温育。用PBS洗细胞，然后用Vectastain ABC试剂盒的方法加工细胞。
对于用MAP2和NF-M进行双免疫荧光染色，先将细胞固定再用Triton X-100透化，再用NGS以类似的方式处理。然后用单克隆抗-MAP2抗体然后是荧光标记的抗-小鼠IgG温育细胞，再次用2％低聚甲醛固定30min。再固定后用抗-NF-M抗体，然后是罗丹明标记的抗-小鼠IgG温育细胞。第二次固定排除了罗丹明偶联的抗-小鼠IgO与抗-MAP2单克隆抗体的交叉反应。
为利用酶联第二抗体进行双标记免疫细胞化学分析，依照双染色试剂盒(Zymed Laboratories，Inc.)的说明进行。利用抗磷酸化CREB抗体(1∶1000)的染色技术如Ginty等(1993)所述。
增殖测定.用BrdU在37℃下将细胞温育8h。温育后立即将细胞固定，然后依照BrdU染色试剂盒的说明操作。颜色反应后，用0.8％过氧化氢和5％NGS PBS温育细胞30min以灭活HARP活性。彻底清洗后，将细胞进行抗-nestin或抗-MAP2抗体染色，在细胞质中产生利用氨乙基咔唑显现的微红反应物。
200X放大对每视野的细胞计数以确定细胞密度。每个样品分析8个视野，校正并平均细胞密度。
RT-PCR.利用Chomczynski和Sacchi(Chomczynski andSacchi，Anal Biochem 162156-159(1987))所述的方法提取每一细胞制备物的总RNA。用无DNA酶的RNA酶处理总RNA。依照superscript II RNA酶H-逆转录酶的说明合成cDNA。在含0.2mMdNTP，正反向引物各0.3uM，及0.25UTaq聚合酶的PCR反应缓冲液(50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.8)，1.5mM MgCl2，0-001％(w/v)明胶)中进行PCR反应。循环参数为90℃下变性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸60s。每一引物对循环次数的确定是根据使扩增处于指数期内。
基因组DNA的扩增可根据产物肌动蛋白-NMDARI，NMDAR2D，钙结合蛋白D28，GAD65，GABAAa3，AMPA受体的大小区分。对于其他的引物，对照扩增在无逆转录酶的情况下观察是否有其他基因组DNA扩增。应当在对照试验中观察不到任何基因组DNA的扩增。
电生理学.在室温下用含130mM醋酸钾(或120 CsCl+10KCl)，10mM HEPES，2mM MgCl2，1mM ATP，0.1mM EGTA，10mM NaCl的3-6M欧姆膜片钳移液管记录细胞，然后用KOH调pH至7.2，再用蔗糖调克分渗透压浓度至300mosM。记录的盐水含130mM NaCl，5mM KCl，2mM CaCl2，1mM MgCl2，10mM HEPES，和10mM葡萄糖。用蔗糖调节渗透压至320mosM，用NaOH调pH至7.4。利用压力通过置于记录细胞旁或在视野中的临近细胞旁(范围在记录细胞的100μm之内)的微移液管施用谷氨酸(在记录的盐水中为1mM)。电流信号通过Axopatch放大器放大，储存于IBM计算机中利用pClamp-6软件分析。
电子显微镜.塑料培养皿中的细胞用含2％低聚甲醛和1％戊二醛的PBS固定1h。用水洗细胞，用1％OsO4固定，用醋酸铀酰封闭染色，乙醇脱水，Araldite树脂包埋。在JEOL 1200 EX电子显微镜下观察薄切片样品。
对分化的神经元培养物的刺激在神经基础培养基中分化的细胞及B27和5％FCS在含10μM谷氨酸或NMDA的相同培养基中温育10min。经磷酸-CREB染色后立即将细胞固定。刺激后温育细胞50min，提取RNA用于c-fos诱导分析。
实施例4fb)分化成酪氨酸羟化酶阳性的神经元细胞在下述的若干分化步骤后，在体外HS细胞能产生酪氨酸羟化酶。如实施例1(d)中所述，在4天中形成Ebs，然后铺于ES细胞培养基中的粘附组织培养物表面。
培养24小时后，用无血清胰岛素/转铁蛋白/硒/纤连蛋白(ITSFn)培养基替换ES细胞培养基从而开始筛选nestin-阳性的细胞，上述培养基含DMEM/F12(1∶1)，添加了胰岛素(Sigma I1882)的Gibco11320-0335μg/ml，氯化硒(Sigma S5261)30nM和纤连蛋白(SigmaF 1141)5μg/ml。
nestin筛选6-10天后，细胞扩增开始。特异的，用0.05％胰蛋白酶/0.04％EDTA解离细胞，铺于塑料或玻璃的组织培养盖片上，所述的盖片用15μg/ml聚鸟氨酸(Sigma，P3655)和1μg/ml层粘连蛋白(Sigma，L2020)预包被，于N2培养基中浓度为1.5-2×105细胞cm-2，该培养基含DMEM/F12(1∶1)，添加了N2添加物的Gibco 11320-033(100X，Gibco 17502-048)，20μg/ml胰岛素，1μg/ml层粘连蛋白(Sigma，L2020)，10ng/ml bFGF(R&D Systems，233-FB)，500ng/ml鼠N-末端SHH片段(R&D Dsystems，461-SH)和100ng/ml鼠FGF8同工型b(R&D Systems，423-F8)，每两天更换一次培养基。
从上述培养基中去除bFGF以诱导酪氨酸羟化酶阳性细胞分化，用层粘连蛋白(1mg/ml)，在存在或不存在1M cAMP(Sigma，A6885)，200M抗坏血酸(Sigma，A5960)的条件下进行细胞扩增。在分化条件下温育细胞6-15天。
为检测酪氨酸羟化酶阳性细胞，诱导的HS细胞培养物用PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.4)漂洗一次，用4％低聚甲醛(Electron MicroscopySciences，15712)固定30min。然后将固定后的细胞用PBS漂洗3次，再用甲醇处理5min。
经甲醇处理的细胞再用PBS漂洗3次，再用Envision+系统(Dako，K4010)的封闭溶液(第1瓶)封闭5min。
排除过量的封闭缓冲液，加入第一抗体兔抗酪氨酸羟化酶(PelFreez，P40101-0，1∶300，溶于PBS)施用于所述细胞，然后在室温下温育60min。
经第一抗体染色的细胞用PBS漂洗3次，应用Envision+系统的第二抗体标记的聚合物(第2瓶)覆盖细胞培养物并在室温下温育30min。
用PBS将用第二抗体染色的细胞漂洗3次，应用Envision+系统的液体DAB+底物(第3瓶)覆盖细胞培养物并温育5min。最后再用PBS漂洗3次。在显微镜下观察酪氨酸羟化酶阳性细胞(参见图9B，该图表明筛选6天后的nestin-阳性细胞)。
权利要求
1.分离的纯合干细胞(HS)。
2.来源于人的分离的纯合干细胞(HS)。
3.来源于非人物种的分离的纯合干细胞(HS)。
4.如权利要求3所述的分离的纯合干细胞3，其中所述的非人物种选自小鼠，仓鼠、狗、猫、兔、雪貂、水貂、豚鼠、刺猬、牛、绵羊、山羊、美洲驼、马、鹿、猪、猴，和猿。
5.由下述方法获得的分离的纯合干细胞，所述方法包括(a)通过下述步骤产生有丝分裂激活的纯合的减数分裂I后的二倍体生殖细胞将两个卵母细胞或两个精子细胞融合；在卵子发生过程中阻止第二极体挤出；在适当的条件下允许第二极体挤出和自发的自我复制；或将两个精子或两个单倍体卵核转移至去核卵母细胞中；(b)培养所述激活的纯合的减数分裂I后的二倍体生殖细胞以形成胚泡样团；和(c)由所述胚泡样团的内细胞团分离纯合干细胞。
6.如权利要求5的方法获得的分离的纯合干细胞，该方法进一步包括在通过(a)将两个卵母细胞或两个精子细胞融合，或(b)将两个精子或两个单倍体卵核转移至去核卵母细胞中产生有丝分裂激活的减数分裂I后的二倍体生殖细胞时，通过基因型分析筛选纯合的干细胞。
7.产生纯合干细胞的方法，该方法包括(a)通过下述步骤产生有丝分裂激活的纯合的减数分裂I后的二倍体生殖细胞将两个卵母细胞或两个精子细胞融合；在卵子发生过程中阻止第二极体挤出；在适当的条件下允许第二极体挤出和自发的自我复制；或将两个精子或两个单倍体卵核转移至去核卵母细胞中；(b)培养所述激活的纯合的减数分裂I后的二倍体生殖细胞以形成胚泡样团；和(c)由所述胚泡样团的内细胞团分离纯合干细胞。
8.如权利要求7所述的方法，进一步包括在通过(a)将两个卵母细胞或两个精子细胞融合，或(b)将两个精子或两个单倍体卵核转移至去核卵母细胞中产生有丝分裂激活的减数分裂I后的二倍体生殖细胞时，通过基因型分析筛选纯合的干细胞。
9.制备所需祖细胞、分化细胞、分化细胞群、或组织类型的方法，该方法包括诱导分离的纯合干细胞在适当的条件下分化。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述的分化通过在培养基中加入调节因子、激素或细胞因子而实现。
11.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是角质化上皮细胞。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述的角质化上皮细胞选自表皮角质细胞，表皮基底细胞，指甲和/或趾甲角质细胞，甲床基底细胞，毛干细胞，毛根鞘细胞，和毛基质细胞。
13.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是湿复层屏障上皮细胞。
14.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是特化用于外分泌的上皮细胞。
15.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是特化用于分泌激素的细胞。
16.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是肠、外分泌腺或泌尿生殖道的上皮吸收性细胞。
17.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是特化用于代谢和储存的细胞。
18.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是衬垫肺、肠、外分泌腺或泌尿生殖道或作为屏障的上皮细胞。
19.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是衬垫封闭内部体腔的上皮细胞。
20.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是有推进功能的纤毛细胞。
21.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群特化用于分泌胞外基质的细胞。
22.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是收缩细胞。
23.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是血液和免疫系统的细胞。
24.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是感觉传导器。
25.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是自主神经元。
26.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是感觉器官和周围神经元的支持细胞。
27.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是中枢神经系统的神经元或神经胶质细胞。
28.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是晶状体细胞。
29.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是色素细胞。
30.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是生殖细胞。
31.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是抚育细胞。
32.如权利要求9所述的方法，其中，所需细胞或细胞群是来自包括外胚层，内胚层或中胚层的胚生殖层之一。
33.产生祖细胞的方法，该方法包括(a)通过下述步骤产生有丝分裂激活的纯合的减数分裂I后的二倍体生殖细胞将两个卵母细胞或两个精子细胞融合；在卵子发生过程中阻止第二极体挤出；在适当的条件下允许第二极体挤出和自发的自我复制；或将两个精子或两个单倍体卵核转移至去核卵母细胞中；(b)培养所述激活的纯合的减数分裂I后的二倍体生殖细胞以形成胚泡样团；(c)由所述胚泡样团的内细胞团分离纯合干细胞；和(d)诱导所述的纯合干细胞分化以产生祖细胞。
34.如权利要求33所述的方法，进一步包括在通过(a)将两个卵母细胞或两个精子细胞融合，或(b)将两个精子或两个单倍体卵核转移至去核卵母细胞中产生有丝分裂激活的减数分裂I后的二倍体生殖细胞时，通过基因型分析筛选纯合的干细胞。
35.如权利要求33所述的方法，进一步包括分离所述祖细胞，并维持永久性的祖细胞系。
36.如权利要求33所述的方法，其中，在没有未分化的干细胞存在下诱导来自所述胚泡样团的细胞分化。
37.产生遗传改变的祖细胞的方法，包括(a)在HS细胞中插入，去除或修饰所需基因以创建遗传改变的HS细胞，和(b)诱导所述遗传改变的HS细胞分化。
38.产生遗传改变的祖细胞的方法，包括(a)在HS细胞中插入，去除或修饰所需基因以创建遗传改变的HS细胞，和(b)诱导所述遗传改变的祖细胞长成遗传改变的祖细胞。
39.如权利要求9，33或37所述的方法，其中，在平面粘附环境下诱导所述的纯合干细胞分化。
40.如权利要求9，33或37所述的方法，其中，在3D粘附环境下诱导所述的纯合干细胞分化。
41.如权利要求9，33或37所述的方法，其中，在微重力环境下诱导所述的纯合干细胞分化。
42.如权利要求9，33或37所述的方法，其中，通过在免疫缺陷的小鼠中产生干质而诱导所述的纯合干细胞分化。
43.如权利要求9，33或37所述的方法，其中，所述的祖细胞能分化成来自三个胚层，即外胚层，中胚层，和内胚层之一的多种组织及细胞。
44.一种治疗方法，该方法包括将如权利要求9，33，37，或38所述的方法获得的细胞施用于需进行治疗的患者。
45.一种治疗方法，该方法包括施用如权利要求9，33，37，或38所述的方法获得的细胞以治疗选自下组的疾病或状况帕金森氏病，亨廷顿氏舞蹈病，阿尔茨海默病，ALS，脊髓缺陷或损伤，多发性硬化，肌肉萎缩，囊性纤维化，肝病，糖尿病，心脏病，软骨缺陷或损伤，烧伤，足溃疡，血管病，尿道疾病，AIDS和癌症。
46.一种治疗方法，该方法包括将如权利要求9，33，37，或38所述的方法获得的细胞施用于需进行治疗的患者，其中，所述的患者是人，而所述细胞来自动物。
47.一种治疗方法，该方法包括将如权利要求9，33，37，或38所述的方法获得的细胞施用于需进行治疗的患者，其中，所述的患者是动物，所述细胞来自人。
48.一种治疗方法，该方法包括将如权利要求9，33，37，或38所述的方法获得的细胞施用于需进行治疗的患者，其中，所述的患者是人，所述细胞来自人。
49.一种治疗方法，该方法包括将如权利要求9，33，37，或38所述的方法获得的细胞施用于需进行治疗的患者，其中，所述的患者是动物，所述细胞来自动物。
50.一种治疗方法，该方法包括将如权利要求9，33，37，或38所述的方法获得的细胞施用于需进行治疗的患者，其中，所述的患者是人，而所述细胞是人细胞。
51.如权利要求50所述的方法，其中，所述的来自人的细胞是异基因的。
52.如权利要求50所述的方法，其中，所述的来自人的细胞是同基因的。
53.来源于下述方法的祖细胞，该方法包括(a)产生有丝分裂激活的纯合的减数分裂I后的二倍体生殖细胞；(b)培养所述激活的纯合的减数分裂I后的二倍体生殖细胞以形成胚泡样团；和(c)由所述胚泡样团的内细胞团分离纯合干细胞；和(d)诱导所述的纯合干细胞分化以产生祖细胞。
54.来自权利要求53的方法的祖细胞，该方法进一步包括在通过(a)将两个卵母细胞或两个精子细胞融合，或(b)将两个精子或两个单倍体卵核转移至去核卵母细胞中产生有丝分裂激活的减数分裂I后的二倍体生殖细胞时，通过基因型分析筛选纯合的干细胞。
55.如权利要求53所述的祖细胞，进一步包括分离所述的祖细胞并将其维持为永久性细胞系。
56.如权利要求53所述的祖细胞，其中，在没有未分化的干细胞存在下诱导来自所述胚泡样团的细胞分化。
57.如权利要求53所述的祖细胞，其中，在平面粘附条件下诱导来自所述胚泡样团的纯合干细胞分化。
58.如权利要求53所述的祖细胞，其中，在3D粘附条件下诱导来自所述胚泡样团的纯合干细胞分化。
59.如权利要求53所述的祖细胞，其中，在微重力条件下诱导来自所述胚泡样团的纯合干细胞分化。
60.如权利要求53所述的祖细胞，其中，通过在免疫缺陷小鼠中产生干质而诱导来自所述胚泡样团的纯合干细胞分化。
61.如权利要求53所述的祖细胞，其中，所述的祖细胞能分化成三个胚层，即外胚层，内胚层或中胚层之一。
62.一种治疗方法，包括向需要进行治疗的患者施用如权利要求53所述的祖细胞。
63.一种治疗方法，包括施用如权利要求53所述的祖细胞，以治疗选自下组的疾病或状况帕金森氏病，亨廷顿氏舞蹈病，阿尔茨海默病，ALS，脊髓缺陷或损伤，多发性硬化，肌肉萎缩，囊性纤维化，肝病，糖尿病，心脏病，软骨缺陷或损伤，烧伤，足溃疡，血管病，尿道疾病，AIDS和癌症。
64.一种治疗方法，包括向需要进行治疗的患者施用如权利要求53所述的祖细胞，其中，所述的患者是人，所述的分化细胞来自于动物。
65.一种治疗方法，包括向需要进行治疗的患者施用如权利要求53所述的祖细胞，其中，所述的患者是动物，所述的分化细胞来自于人。
66.一种治疗方法，包括向需要进行治疗的患者施用如权利要求53所述的祖细胞，其中，所述的患者是动物，所述的分化细胞来自于动物。
67.一种治疗方法，包括向需要进行治疗的患者施用如权利要求53所述的祖细胞，其中，所述的患者是人，所述的分化细胞来自于人。
68.如权利要求67所述的方法，其中，来自于人的细胞是异基因的。
69.如权利要求67所述的方法，其中，来自于人的细胞是同基因的。
70.一种来自下述方法的纯合干细胞，该方法包括(a)通过下述步骤产生有丝分裂激活的纯合的减数分裂I后的二倍体生殖细胞将两个卵母细胞或两个精子细胞融合；在卵子发生过程中阻止第二极体挤出；在适当的条件下允许第二极体挤出和自发的自我复制；或将两个精子或两个单倍体卵核转移至去核卵母细胞中(b)培养所述激活的纯合的减数分裂I后的二倍体生殖细胞以形成被透明带环绕的胚泡样团；(c)用辅助孵化的方法使所述胚泡样团从所述透明带中释放出来；和(d)从所述胚泡样团的内细胞团分离纯合干细胞。
71.如权利要求70所述的分离的干细胞，其中的辅助孵化的方法包括将所述的胚泡样团固定在显微操作器上，所述显微操作器有两个臂，一个臂控制所述胚泡样团于固定位置，另一个臂将酸化的台氏液施用于相当于所述透明带总面积约1/8的区域的透明带表面，使所述透明带弱化并将胚泡样团释放出来。
72.一种来自下述方法的纯合干细胞，该方法包括(a)通过下述步骤产生有丝分裂激活的纯合的减数分裂I后的二倍体生殖细胞将两个卵母细胞或两个精子细胞融合；在卵子发生过程中阻止第二极体挤出；在适当的条件下允许第二极体挤出和自发的自我复制；或将两个精子或两个单倍体卵核转移至去核卵母细胞中(b)培养所述激活的纯合的减数分裂I后的二倍体生殖细胞以形成被透明带环绕的胚泡样团；(c)在激活后第2天将所述激活的减数分裂I后的二倍体生殖细胞转移到经丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层细胞上直至胚泡样团形成；(d)用辅助孵化的方法使所述胚泡样团从所述透明带中释放出来；和(e)从所述胚泡样团的内细胞团分离纯合干细胞。
全文摘要
本发明公开并描述了多能纯合干(HS)细胞及制备所述细胞的材料和方法。本发明还提供用于使HS细胞分化成祖(多能)细胞或其他所需细胞、细胞群或组织的方法。此外，在此公开的HS细胞可用于，包括(但不限于)诊断和治疗多种疾病(例如，遗传疾病，神经变性疾病，内分泌相关的紊乱和癌症)，创伤，并可用于美容和治疗性移植，以及基因治疗和细胞替代治疗。
文档编号A61K35/12GK1643135SQ01822395
公开日2005年7月20日 申请日期2001年11月30日 优先权日2000年11月30日
发明者W·L·颜, J·雷, H·林, R·坎纳, S·C·-W·黄, M·-T·阮 申请人:斯坦姆荣公司