A对CB CD34+和⑶34+⑶90+细胞在不存在细胞因子的情况下的离体 扩增的影响。在图5A中，原代CB CD34+细胞(PC)如图IA中所示用细胞因子激活并且在SF培 养条件下在仅培养基(无细胞因子)或仅VPA(无细胞因子）中在不存在其他细胞因子下处理 7天。仅含有培养基(无细胞因子)和仅含有VPA(无细胞因子)的两种培养物相比于PC产生显 著更大数目的 CD34+和CD34+CD90+细胞（##p〈0 · 0001 和*p〈0 · 05)(平均值土 SE; ANOVA，p〈 0.0001)，（η = 6)。在图5B中，在仅含有培养基(无细胞因子)相对于仅含有VPA(无细胞因子） 的SF培养物中观察到CD34+和CD34+CD90+细胞的增加倍数的显著差异。*ρ〈0.05，#ρ〈0.005 (平均值土SE;AN0VA，p〈0.0001)，（n = 6)。
[0018] 图6示出HDACI对HDAC蛋白质表达水平的影响。新鲜分离脐带血单核细胞(CB-MNC) 并且在不存在和存在Scriptaid(SCR)、CAY10433(C433)或丙戊酸(VPA)的情况下处理24小 时。制备总细胞裂解物并且使用如实施例中所述对I类（1、2和3)、IIa类(4和5)和IIb类(6) HDAC具特异性的HDAC mAb进行蛋白质印迹。使用b-肌动蛋白作为上样对照。未被处理的新 鲜分离的CB-MNC，C对照。示出4种代表性实验之一。
[0019] 图7A-B示出在扩增的CB-CD34+细胞中的醛脱氢酶(ALDH)功能活性。图7A示出在对 照条件下或用VPA处理7天的原代脐带血(CB) CD34+细胞(PC)的结果，其中对细胞因子评估 ALDH活性。包括ALDH+⑶34+细胞(左列）、ALDH+细胞（中列）的细胞的各种群体的轮廓曲线分 析。将ALDH+细胞(方框）门控以进行⑶34和c-kit(⑶117)的共表达（右列）。相比于含血清 (SC)对照培养物(p = 0.005)以及含VPA的培养物(p = 0.001 )，在不含血清(SF)中观察到更 大程度的ALDH活性。类似地，相比于SC培养物，在SF中的ALDH+CD34+和ALDH+CD34+CD117+细 胞的百分比显著更大(分别为P = 0.001和P = 0.007)。左图：SC培养物，和右图：SF培养物。示 出7个代表性实验之一。如图7B中所示，在SF培养物中，相比于SC培养物，在VPA存在下产生 远远更大数目的 ALDH+CD34+CD117+细胞（平均值土 SD; *p〈0.05，ANOVA，p = 0.009)，（n = 3-5)〇
[0020] 图8 A-C示出在VPA扩增的⑶34+细胞中的多能性基因的转录物的结果。图8A示出多 能性基因在VPA处理的CD34+细胞中的表达的结果。在不含血清(SF)和含血清(SC)培养物中 在存在或不存在VPA的情况下处理后，再次分离⑶34+细胞。从总RNA制备cDNA并且进行RT-PCR。胚胎干(ES)细胞代表S0X2/0CT4/NAN0G转录物的阳性对照和CD34表达的阴性对照。通 过RT-PCR在SF培养条件下的VPA处理⑶34+细胞中未检测到假0CT4的表达。在两种不同凝胶 上使对照/VPA(SF)和VPA(SC)/ES细胞的泳道进行电泳并且在单一凝胶上使0CT4假基因/真 基因的泳道进行电泳。GAPDH-管家基因，M-A 50-bp DNA梯级。示出4种代表性实验之一。图 8B示出VPA对与多能性相关的基因的影响的定量。如上所述分离并处理在不同条件下培养 的CD34+细胞（图8A)。通过Sybr Green Q-PCR计算基因（S0X2/0CT4/NAN0G)的相对转录物水 平。通过相对于PC中存在的相应转录物水平标准化来计算从对照培养物(左图）和含VPA培 养物（右图）中再次分离的CD34+细胞的mRNA表达的变化倍数（平均值土 SD ; ANOVA，p = 0.0001)，（n = 4)。图8C示出在SF或SC培养条件下VPA处理后与染色质重塑和多能性相关的 基因表达的定量。如上所述计算SET、MYST3、SMARCAD1和ZIC3基因的mRNA表达水平的变化倍 数(平均值土 SE，AN0VA，p = 0.04)，（n = 3)。
[0021] 图9A-C示出多能性基因在VPA扩增的⑶34+细胞中表达的结果。图9A示出在对照条 件下培养7天后或在暴露于VPA后在再次分离的CD34+细胞中的S0X2、0CT4和NANOG表达的代 表性流式细胞术分析的结果。将细胞固定，渗透化，并用匹配的同种型IgG(每个图中的最左 侧曲线）或S0X2/0CT4/NAN0G mAb染色，以评估从对照(对照图中的最右侧曲线）和VPA(VPA 图中的最右侧曲线)培养物中再次分离的CD34+细胞中的蛋白质的胞内水平。示出4种代表 性实验之一。图9B示出多能性基因表达的共焦显微术分析结果:在SF培养物中在用VPA处理 后再次分离⑶34+细胞并且如实施例中所述用同种型匹配的IgG、或0CT4/S0X2/NAN0G和 ZIC3抗体(FITC)免疫染色。细胞核用DAPI染色。示出共焦z系列的单一光学截面(比例尺= 10ym，0CT4、S0X2和NAN0G(63x)以及IgG、ZIC3和更高放大倍数的0CT4(126x))。示出3种代表 性实验之一。图9C示出多能性基因的共免疫沉淀的结果。ES(H9)细胞和VPA处理细胞(V)的 后代在第7天裂解，ES或V细胞裂解物用NANOG pAb(或抗IgG对照)免疫沉淀（IP)并通过SDS-PAGE分级。来自ES和VPA处理细胞的总蛋白质裂解物(输入)也包括在相同凝胶中，但是不连 续的，并且使用〇CT4pAb进行蛋白质印迹分析(WB)。也利用ES和V裂解物进行使用NANOG mAb 的WBA-肌动蛋白是上样对照。示出3种代表性实验之一。
[0022] 图10A-E示出siRNA介导的多能性基因敲低的结果。在图IOA中，在不含血清(SF)培 养物中用VPA处理原代CB CD34+细胞(PC)。在3天后，如实施例中所述将细胞用S0X2、0CT4和 NANOG的汇集物（SON)、乱序siRNA(阴性对照）和GAPDH siRNA(阳性对照）转染。通过Sybr Green Q-PCR定量3(?2、0(^4、祖勵6、64130!1和2103转录物并且相对于0)34转录物水平标准 化。*ρ〈0·05，**ρ <0·006，***p = 0·0001(平均值±SE;AN0VA，p〈0·0001)，（n = 3)。在图10B 中，通过RT-PCR分析在siRNA介导的基因敲低后的S0X2/0CT4/NAN0G、CD34和GAI3DH的表达。 M-DNA标志物，胚胎干(ES)细胞代表S0X2、0CT4、NANOG和ZIC3的阳性对照。泳道在相同凝胶 上进行电泳。在图IOC中，通过共焦显微术分析多能性基因表达。上图：乱序siRNA，和下图： SON siRNA，显示在用VPA处理的细胞中的S0X2、0CT4、NAN0G和ZIC3表达。图像代表共焦z系 列的光学截面:比例尺= 1〇μπι(4〇Χ)。在两个其他实验中获得类似的数据。在图IOD中，在转 染7天后，使用流式细胞术分析CD34+和CD34+CD90+的细胞的百分比。曲线图代表在用包括 乱序和SON的siRNA转染后在VPA培养物中产生的⑶34+和⑶34+CD90+细胞的百分比的比较 分析。*Ρ<〇·〇5(平均值土 SE;AN0VA，p = 0·0005)，（n = 3)。图10E示出计算在用乱序或S0N siRNA转染后在含VPA培养物中产生的CD34+和CD34+CD90+细胞/CB收集物的绝对数目。*ρ〈 0.05，***p = 0.0001(平均值土SE;AN0VA，p = 0.0008)，（η = 3)。
[0023] 图IIA-F示出在原代NSG小鼠中的人细胞嵌合性的分析结果。向NSG小鼠移植原代 细胞(PC)、从对照培养物和含有VPA的培养物中再次分离的CD34+细胞。通过流式细胞术测 定与（图 11A)人细胞(CD45+)、（图 11B)CD34+CD45+细胞、（图 11C)CD34+CD184+细胞、（图 11D) CD33+细胞和（图11E)巨核细胞(CD41+)、红系细胞(血型糖蛋白A(GPA+))、粒细胞(CD14+)、T 细胞(CD3+)和B细胞(CD19+)的嵌合性百分比（平均值±50)。在图IlF中，利用PC、在具有或 不具有VPA的SF培养条件下在不存在或存在细胞因子的情况下处理的CD34+细胞进行移植 所实现的平均人细胞嵌合性程度的比较分析。（图11Α)**ρ = 0.006，***p = 0.0008(AN0VA，p 〈0.0001)，（图118)**口 = 0.004(八勵￥八，口 = 0.03)，（图11〇*口 = 0.01，**口 = 0.0008(八勵￥八，口 =0.01)，（图110)**口 = 0.003，****口〈0.0001(八腸￥八，口〈0.0001)和（图1把）平均值±50*口〈 0.05，**p〈0.005，（AN0VA，p〈0.0001)和（图llF)*p〈0.05(单尾t检验），**ρ <0·002(ΑΝ0ΝΑ〈 0.0001KNSG 接受者(η = 27)。
[0024] 图12Α-Β示出在二代NSG小鼠中的人细胞嵌合性的分析结果。在移植原代CB CD34+ 细胞(PC)或在先前所述的各种条件下扩增7天的移植物后第13-14周，将原代接受者小鼠处 死并且将2 X IO6个BM细胞移植到二代NSG小鼠中。每个条柱代表如通过单克隆抗体染色和 流式细胞术分析所测定的二代NSG小鼠的骨髓中出现的人供体细胞植入的中值百分比和 (图12A和图12B)在来自原代接受者的不同类型的移植物的移植后第15-16周的二代NSG小 鼠中发生的多谱系造血细胞植入的中值百分比。每个组中存在2-3只小鼠。谱系发展模式在 统计学上显著不同，*P〈〇. 05，#p〈0.005，（平均值土SD，图 12A和图 12B(AN0VA，p〈0.0001))， NSG 接受者(η = 18)。
[0025] 图13A-C示出在原代CB CD34+细胞(PC)和在对照条件下培养或用VPA处理的相等 数目的CD34+细胞的后代中存在的SCID重建细胞(SRC)的频率的比较结果。在图13A中，将增 加数目的？以50、250、500、2500和5000)和用相等数目的在对照条件下或在￥?4存在下培养 的细胞起始的培养物后代单独地移植到NSG小鼠中。示出在12-13周后植入接受者小鼠的BM 中的人CD45+细胞的百分比。在图13B中，使用具有或不具有人细胞植入证据的小鼠数目进 行Poi sson统计学分析(表3)。曲线图表示在PC或来自对照培养物或含有VPA的培养物的相 等数目的CD34+细胞的后代移植后，不具有人细胞嵌合性的小鼠的百分比（阴性）。虚线表示 95%置信区间。在图13(：中，使用?〇丨88〇11统计分析计算31^数目并且表示为31^/1\10 60)34 +细胞的数目。**?<〇.〇〇2(厶1^^4 = 0.003)，吧6接受者小鼠（11 = 111)。
[0026]图14示出原代脐带血(CB)CD34+细胞(PC)和在不具有细胞因子的不含血清(SF)培 养基(仅培养基）中或在不具有细胞因子的仅VPA存在下培养7天的CD34+细胞的表型分析结 果。示出培养细胞的〇)34丄090丄乂0?4(00184)、0)49付卩0)451^表达。描绘了0)34+0)90+细 胞的 CD184、CD49f 和 CD45RA 的共表达。（n = 4)
[0027] 图15示出HDACI对HEK293细胞中的HDAC蛋白质水平的影响。将HEK293细胞用SCR、 C433和VPA处理2小时（Tl)和24小时(T2)。如实施例中所述用若干I类（1、2和3)、IIa类(4和 5)和IIb类(6)HDAC的初级单克隆抗体(mAb)探测蛋白质印迹。每个HDACI均一地影响HDAC2 和HDAC4的表达。使用β-肌动蛋白作为上样对照。（η = 4)
[0028] 图16示出在ES细胞中的多能性基因的共焦显微术分析的结果。如实施例中所述将 ES(H9)细胞固定，渗透化，并用0CT4/S0X2/NAN0G/ZIC3抗体(FITC)染色。细胞核用DAPI染 色。在ES细胞的细胞核中相比于细胞质中，包括S0X2、0CT4、NANOG和ZIC3的多能性基因蛋白 更显著。示出共焦z系列的单一光学截面(比例尺= 25μπι(63倍放大倍数，具有光学放大））。
[0029] 图17A-G示出畸胎瘤形成测定的结果。将从对照培养物或含有VPA的培养物中再次 分离的IX IO6个ES(H9)细胞或CD34+细胞与Matrigel混合并皮下注射至NSG小鼠的右后肢 (n = 9)。在8周后，将小鼠处死并且将群体解剖，固定，并用苏木精和曙红染色。（图17A和图 17B)。在三只小鼠中的每一个中，仅ES(H9)细胞形成畸胎瘤(左图），（图17C)对照和VPA处理 的CD34+细胞都不形成畸胎瘤(右图），（图17D)。染色切片的显微照片呈现出三个不同的胚 层(小箭头-外胚层，实心箭头-中胚层，和间断箭头-内胚层）（4倍），（图17E)中胚层(软骨） (4倍）、（图17F)色素性外胚层(20倍），和（图17G)内胚层(20倍）。每个组利用3只小鼠，包括 ES (H9)、对照和VPA(η = 9只小鼠）。
[0030] 图18示出CD34+、CD34+CD90+和CD34+CD90+CD184+细胞的绝对数目的结果：将CB-CD34+细胞用VPA处理7天并且在冷冻保存前和冷冻保存后（5周）进行表型分析。ns =不显 著。（n = 2)。
[0031] 图19A-C示出VPA扩增的HSC产物含有如通过表型所限定的所有种类的HSC1^tVPA 扩增的CD34+细胞分析CD34+CD90-CD49f-快速(R-SRC)、CD34+CD90+CD49f-中间（IT-SRC)和 CD34+CD90+CD49+长（LT-SRC)(η = 3)。
[0032] 图20Α-Β是示出HDACI对从ALDH+CD34+和ALDH-CD34+细胞产生的BFU-E+CFU混合物 的绝对数目的影响的曲线图：如下文实施例中所述将用CA、VPA、SCR或C433处理的CD34+细 胞用Aldef Iuor和⑶34单克隆抗体染色并且在第7天分选。在SF培养物中，相比于SC培养物， 在每一种HDACI存在下产生的ALDH+CD34+细胞产生远远更大数目的BFU-E+CFU混合物 (ANOVA，p = 0.001)。相比之下，在SC培养物中，相比于SF培养物，从ALDH-CD34+细胞产生更 大数目的 BFU-E+CFU 混合物。平均值土 SE，ANOVA，ρ = 0·01(η = 3)。
[0033] 发明详述
[0034] 本发明涉及源自人脐带血的分离和扩增的干细胞的富集群体、其离体扩增，和涉 及向受试者施用所述分离和扩增的干细胞的富集群体的治疗方法。根据本发明，有可能通 过在不含血清的培养基中和在组蛋白脱乙酰酶抑制剂存在下离体培养造血干细胞以实现 表达特定表型的干细胞的独特群体来扩增造血干细胞。
[0035] 根据一个方面，本发明涉及分离和扩增的人脐带血干细胞的富集群体。所述扩增 的干细胞是 〇)34+、0)90+、0)184+、0049€+、0)117 +、41^!1+，但贫乏地表达0)451^(8口是 CD45RA-)，并且表达多能性基因 S0X2、0CT4、NAN0G和ZIC3。
[0036] 造血干细胞是多能(multipotent或pluripotent)细胞，这允许它们分化成所有谱 系的血细胞并且能够在维持其多能性(multipotency或pluripotency)的同时本身再生。
[0037] 本发明的富集和扩增的干细胞是从人分离的并且源自人脐带血。
[0038] 本发明的富集群体的干细胞是 〇)34+、0)90+、0)184+、0049€+、0)117+和0)451^-。 0)34+、0)90+、0)184+、0049€+、0)117+是指在细胞表面上表达（+ )00(分化簇）34、90、184、 49f和117抗原。这些抗原是造血干细胞的标志物。CD45RA-是指在细胞表面上不(或贫乏地） 表达抗原⑶45RA。本发明的干细胞群体富集干细胞标志物⑶34+、⑶90+、⑶184+、CD49f+、 CD117+和 CD45RA-并表达多能性基因 S0X2、0CT4、NAN0G 和 ZIC3。
[0039] 可以例如通过使用通过使糖尿病小鼠与免疫缺陷小鼠杂交获得的N0D/SCID小鼠 来进行用于测试具有骨髓重建能力的人造血干细胞的存在的实验程序。通过这种测定检测 的细胞被称为SCID重建细胞(SRC)并且视为与人造血干细胞最接近。
[0040] 在本发明的干细胞群体中的干细胞被称为扩增的干细胞，这意味着在培养后造血 干细胞的数目大于培养前，或换另一种方式，在培养后的干细胞数目大于从脐带血样本获 取的细胞数目。
[0041] 在一个实施方案中，本发明的干细胞的富集群体是仅含有或主要含有由来自脐带 血分离物的造血干细胞的自我更新产生的造血干细胞的干细胞群体。从分离的造血干细胞 分化的造血祖细胞或含有造血干细胞和造血祖细胞的细胞群体也可存在于富集群体中。然 而，在一个实施方案中，富集群体中的造血祖细胞的数目小于造血干细胞的数目。例如，在 实验结果中，在7天后VPA处理的细胞主要含有CD34+CD90+(74.2±9.8%)细胞，其中其余细 胞为血型糖蛋白+ (17.0±5.4%)、0)41 + (8.9±2.0%)、0)14+(3.9±1.5%)，几乎没有1'细 胞(003-0.2±0.3%)和能田胞(0019-0.5±0.1%)。扩增的移植物由原始小幼单核细胞与无 颗粒的细胞质和明显核仁的均质群体组成。
[0042] 在一个实施方案中，所述富集群体包含原始小幼单核细胞与无颗粒的细胞质和明 显核仁的均质群体。
[0043] 造血干细胞的扩增进一步是指造血干细胞的分化以增加具有上述表型的造血干 细胞的绝对数目。在一个实施方案中，富集群体中至少约16%、17%、18%、19%、20%、 21%、22%、23%、24%、25%或26%的干细胞处于62/]?期。可选地，富集群体中约18.0%± 1.2%或约17-19%的干细胞处于G2/M期。在另一个实施方案中，富集群体中至少约4%、 5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、 21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、 36 %或37 %的干细胞处于G0/G1期。可选地，富集群体中约23.2 % ± 13.8%或约20-26 %的 干细胞处于G0/G1期。
[0044] 本发明的富集群体的干细胞具有表达多能性基因S0X2、0CT4、NAN0G和ZIC3的额外 特性。在一个实施方案中，富集群体中至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或99%的干细胞表达多能性基因 S0X2、0CT4、NAN0G和ZIC3。
[0045] 根据一个实施方案，干细胞的富集群体的干细胞不显示胚胎干细胞多能性基因 hTERT的表达水平的任何上调。
[0046] 在一个实施方案中，本发明的富集群体中的干细胞对于醛脱氢酶活性呈阳性。特 定地，本发明的富集群体中的至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或更多的干细 胞对于醛脱氢酶活性呈阳性。
[0047] 本发明的干细胞的富集群体可与选自30?、？1七3、了?0、11^3的细胞因子和这些细胞 因子的组合接触。
[0048]另外，富集群体的干细胞可与组蛋白脱乙酰酶抑制剂接触。合适的组蛋白脱乙酰 酶抑制剂包括（但不限于）￥?4、5〇?、1^耶89、了54、54说丄&7 10433(0433)(也称为81^-210) 和Cay10298。
[0049] 本发明的富集和扩增群体中的干细胞相比于不与组蛋白脱乙酰酶抑制剂接触的 分离和扩增的人脐带血干细胞具有降低的HDACUHDAC3和HDAC5表达。
[0050] 本发明的干细胞的富集群体不含T细胞和B细胞。例如，在本发明的一个实施方案 中，富集群体主要含有⑶34+CD90+、⑶41+和⑶14+细胞，基本上没有T细胞和B细胞。例如，富 集群体可含有约64-84%CD34+CD90+细胞、约12-23%血型糖蛋白（GPA)+细胞、约7-11 % CD41+细胞、约2.5-5.5%0014+细胞、约0-0.5%1'细胞(0019+)和0.4-0.6%8细胞(〇)3+)。在 一个实施方案中，扩增的干细胞几乎不含T细胞和B细胞并且含有有限数目的单核细胞 (CDH) 0
[0051] 根据一个实施方案，本发明的干细胞的富集群体在HDACI存在下培养约7天后含有 以下表型标志物：约64-84%、65-83%、66-82%、67-81%、68-80%、69-79%、70-78%、71_ 77%、72-76%、73-75%或74%CD34+CD90+细胞；约 12-23%、13-22%、14-21 %、15-20%、 16-19%或17-18%血型糖蛋白（6卩八)+细胞；约7-11%、8-10%或9%〇)41+细胞；约2.5-5 · 5 %、3-5 % 或4 % CD14+细胞;约0-0 · 5 % CD19+细胞;和约0 · 4-0 · 6 % CD3+细胞。
[0052] 本发明的富集和扩增群体中的干细胞可被冷冻保存以供未来使用。冷冻保存方法 讨论于Berz等，"Cryopreservation of Hematopoietic Stem Cells ,''Am. J.Hematol · 82 (6): 463-472(2007)中，所述文献特此以全文引用的方式并入。
[0053]本发明的另一个方面涉及产生分离和扩增的人脐带血干细胞的富集群体的方法。 这种方法涉及提供人脐带血干细胞的分离群体并且在有效产生分离和扩增的人脐带血干 细胞的富集群体的条件下在不含血清的培养体系中在组蛋白脱乙酰酶抑制剂存在下处理 人脐带血干细胞的分离群体。扩增的人脐带血干细胞是CD34+、CD90+、CD184+、CD117+、 CD49f +、ALDH+、CD45RA-并且表达多能性基因 S0X2、0CT4、NANOG和ZIC3。
[0054] 在本发明的这个方面的一个实施方案中，在不含血清的培养体系中并且在组蛋白 脱乙酰酶抑制剂存在下处理人脐带血干细胞的分离群体以增加干细胞的绝对数目。例如， 可进行所述方法以使干细胞(CD34+CD90+)的绝对数目扩增约2.0 X IO4倍。
[0055] 通过本发明的方法获得的分离和扩增的干细胞的富集群体中的干细胞具有上述 扩增干细胞的富集群体的特性。
[0056] 在进行本发明的方法时，培养体系可包括通常用于动物细胞培养的培养容器如 Petri培养皿、烧瓶、塑料袋、Teflon?袋，其可能具有或可能不具有利用细胞外基质或细胞 粘附分子的初步涂层。当使用时，用于这种涂层的材料可为胶原蛋白I至XIX、纤连蛋白、玻 连蛋白、层粘连蛋白1至12、nitogen、腱生蛋白、血小板反应蛋白、血管性血友病因子、骨桥 蛋白、血纤蛋白原、各种类型的弹性蛋白、各种类型的蛋白多糖、各种类型的钙粘蛋白、桥粒 芯粘着蛋白（desmocolin)、桥粒芯蛋白（desmoglein)、各种类型的整合素、E-选择素、P-选 择素、L-选择素、免疫球蛋白超家族、MatrigeU聚D-赖氨酸、聚L-赖氨酸、壳多糖、壳聚糖、 琼脂糖、海藻酸凝胶和/或水凝胶或其片段。这种涂层材料可为具有人工修饰的氨基酸序列 的重组材料。所述造血干细胞可通过使用可以机械地控制培养基组成、pH等并获得高密度 培养物的生物反应器来培养（参见Schwartz ,"Rapid Medium Perfusion Rate Significantly Increases the Productivity and Longevity of Human Bone Marrow Cultures，" Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88:6760(1991);KoIler，"Clinical-scale Human Umbilical Cord Blood Cell Expansion In a Novel Automated Perfusion Culture System，''Bone Marrow Transplant 21: 653( 1998) ;KolIer，"Large-scale Expansion of Human Stem and Progenitor Cells from Bone Marrow Mononuclear Cells in Continuous Perfusion Cultures，"Blood 82:378(1993)，其特此以全文引用的 方式并入）。
[0057] 虽然培养体系是不含血清的，但可使用各种营养素来提供干细胞的足够生长和扩 增条件。合适的营养素培养基包括(但不限于)达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbe