胞，以及保留分离出的血 浆。
[0033]步骤三、脐血有核冻存:收集细胞并计数和活率(细胞仪计数），细胞计数结果如表 1所示，按3X107/ml/管进行冷冻保存，采用90%的血浆和10%的中二甲基亚砜作为冷冻保 护剂;将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取5X106细胞做细胞表面标志检测，检测结 果如表2所示。
[0034]步骤四、脐血单核细胞（富含造血干细胞)成分鉴定:脐血单个核细胞⑶34/CD45抗 原表达及HSC-CFU培养。细胞⑶34表达和CFU集落形成结果如表3所示。
[0035] 步骤五、临床用脐血单核细胞（富含造血干细胞)使用：取冷冻细胞，复苏后红细胞 会全部破碎，用生理盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细 胞和复方电解质溶液混匀待用;并留样进行内毒素和细菌检测。复苏后的细菌、内毒素检测 以及细胞数和活率结果如表4所示。
[0036] 表1冷冻前细胞计数仪计数结果
[0037]
[0038] 表2冻存前细胞无菌检测、支原体检测及细胞表面标志检测结果
[0040] 表3细胞⑶34表达和CFU集落形成结果
[0042] 表4复苏后细菌检测、内毒素检测以及细胞数和活率
[0043]
[0044] 从表1和4的检测结果可知，细胞冷冻复苏后的有核细胞总数及活率与冷冻前的细 胞总数(10.8X107)和活率(95%)无明显下降。
[0045] 实施例2
[0046] 本实施例提供一种临床用脐血单核细胞(富含造血干细胞)的制备方法，具体包括 如下步骤：
[0047] 步骤一、脐血筛选与保存:筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带(样本2)，置于脐血 保存袋中4°C冷藏，并于24小时内进行分离处理；
[0048] 步骤二、脐血分离:将脐血通过两步离心法去掉绝大多数红细胞，分离出我们要的 单核细胞层，用高温灭菌过的超纯水裂解两次，去除分离出的红细胞，以及保留分离出的血 浆。
[0049]步骤三、脐血有核冻存:收集细胞并计数和活率(细胞仪计数），细胞计数结果如表 5所示，按3X107/ml/管进行冷冻保存，采用90%的血浆和10%的中二甲基亚砜作为冷冻保 护剂;将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取5X106细胞做细胞表面标志检测，检测结 果如表6所不。
[0050]步骤四、脐血单核细胞（富含造血干细胞)成分鉴定:脐血单个核细胞⑶34/CD45抗 原表达及HSC-CFU培养。细胞⑶34表达和CFU集落形成结果如表7所示。
[0051]步骤五、临床用脐血单核细胞（富含造血干细胞)使用：取冷冻细胞，复苏后红细胞 会全部破碎，用生理盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细 胞和复方电解质溶液混匀待用;并留样进行内毒素和细菌检测。复苏后的细菌、内毒素检测 以及细胞数和活率结果如表8所示。
[0052]表5冷冻前细胞计数仪计数结果
[0053]
[0054]表6冻存前细胞无菌检测、支原体检测及细胞表面标志检测结果
[0056] 表7细胞⑶34表达和CFU集落形成结果
[0058]表8复苏后细菌检测、内毒素检测以及细胞总数和活率
[0059]
[0060]从表5和8的检测结果可知，细胞冷冻复苏后的有核细胞总数及活率与冷冻前的细 胞总数(14.13X107)和活率(95%)无明显下降。
[0061]实施例3
[0062]本实施例提供一种临床用脐血单核细胞(富含造血干细胞)的制备方法，具体包括 如下步骤：
[0063]步骤一、脐血筛选与保存:筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带(样本3)，置于脐血 保存袋中4°C冷藏，并于24小时内进行分离处理；
[0064]步骤二、脐血分离:将脐血通过两步离心法去掉绝大多数红细胞，分离出我们要的 单核细胞层，用高温灭菌过的超纯水裂解两次，去除分离出的红细胞，以及保留分离出的血 浆。
[0065]步骤三、脐血有核冻存:收集细胞并计数和活率(细胞仪计数），细胞计数结果如表 9所示，按3X107/ml/管进行冷冻保存，采用90%的血浆和10%的中二甲基亚砜作为冷冻保 护剂;将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取5X106细胞做细胞表面标志检测，其结果 如表10所示。
[0066]步骤四、脐血单核细胞（富含造血干细胞)成分鉴定:脐血单个核细胞⑶34/CD45抗 原表达及HSC-CFU培养。细胞⑶34表达和CFU集落形成结果如表11所示。
[0067]步骤五、临床用脐血单核细胞（富含造血干细胞)使用：取冷冻细胞，复苏后红细胞 会全部破碎，用生理盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细 胞和复方电解质溶液混匀待用;并留样进行内毒素和细菌检测。复苏后的细菌、内毒素检测 以及细胞数和活率结果如表12所示。
[0068]表9冷冻前细胞计数仪计数结果
[0069]
[0070]表10冻存前细胞无菌检测、支原体检测及细胞表面标志检测结果
[0072]表11细胞CD34表达和CFU集落形成结果
[0074]表12复苏后细菌检测、内毒素检测以及细胞总数和活率
[0075]
[0076]从表9和12的检测结果可知，细胞冷冻复苏后的有核细胞总数及活率与冷冻前的 细胞总数(17.05X107)和活率(96%)无明显下降。
[0077]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。
【主权项】
1. 一种富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，包括如下步骤： 步骤A，取适量分离获得的脐带血，置于脐血保存袋中冷藏保存； 步骤B，脐血分离:将脐血通过两步离心法去掉绝大多数红细胞，分离出所需单核细胞 层，用高温灭菌过的超纯水裂解，去除分离出的红细胞，以及保留分离出的血浆； 步骤C，脐血有核冻存:收集细胞并计数和活率，进行冷冻保存;并将细胞上清进行无菌 检测、支原体检测，做细胞表面标志检测； 步骤D，脐血单核细胞成分鉴定:脐血单个核细胞⑶34/⑶45抗原表达及HSC-CFU培养； 步骤E，临床用脐血单核细胞使用:取冷冻细胞，复苏后红细胞会全部破碎，用生理盐水 洗涤，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待 用;并留样进行内毒素和细菌检测。2. 如权利要求1所述的富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，其特征在 于，步骤A中，所述分离获得的脐带通过筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带获得，所述筛选 的检测项目包括携带病毒或遗传家族史。3.如权利要求1所述的富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，其特征在 于，步骤A中，所述脐血保存袋只含有标准量的血液抗凝剂，不含有血清培养基，不含抗生 素。4.如权利要求1所述的富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，其特征在 于，步骤A中，所述脐带置于脐血保存袋中4°C冷藏保存，并在24小时内进行分离处理。5.如权利要求1所述的富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，其特征在 于，步骤B中，所述两步离心法采用医用级别淋巴分离液。6. 如权利要求1所述的富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，其特征在 于，步骤C中，所述冷冻处理采用的细胞冷冻保护液由体积百分比为90%的血浆和10%的二 甲基亚砜配制而成。7.如权利要求6所述的富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，其特征在 于，所述血浆为自体血浆。8. 根据权利要求1所述的富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法，其特征 在于，步骤C中，所述无菌检测包括用血培养仪进行细菌和真菌检测;所述支原体检测包括 用PCR法进行支原体检测。
【专利摘要】本发明提供一种临床用脐血单核细胞的制备方法，包括如下步骤：取适量分离获得的脐带血，置于脐血保存袋中冷藏保存；进行脐血单核分离处理，获得脐血单核细胞，进行冷冻处理；冷冻细胞复苏后用生理盐水洗涤，后再次计数和活率，并留样进行内毒素和细菌检测，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用。冷冻过程中采用脐血本身血浆作为冻存防护剂，可以避免其他动物源蛋白的影响，更符合临床标准。该方法从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级监控，以实现脐血单核细胞的临床标准产品。
【IPC分类】C12N5/0786, C12N5/0789
【公开号】CN105420191
【申请号】CN201510875945
【发明人】朱兵锐, 江晔, 刘朋程
【申请人】上海华颜医药科技有限公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月2日