一种从脐带外层羊膜组织中分离提取hUC-MSC的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及脐带间充质干细胞的高效快速分离提取方法，特别是从新鲜脐带外层羊膜组织中提取间充质干细胞的方法。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有高度自我更新和多向分化潜能，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中。目前已有研究表明，不同的培养方法可使MSC表现为神经元表型、胰岛样细胞表型、内皮细胞表型，或表达心肌细胞标记，从而揭示MSC在免疫抑制、内分泌系统调节、神经系统调节以及心血管功能改善中具有广泛的临床应用前景。因此MSC已逐渐成为细胞治疗和基因治疗领域中极具实用价值的细胞来源。特别是与其他来源的MSC相比，源于人脐带的人脐带间充质干细胞(human Umbilical Cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)具有生长环境单一、采集方便、增殖分化能力强、免疫原性低、无伦理问题等诸多优点。
[0003]鉴于hUC-MSC的多向分化潜能以及在疾病治疗领域的应用潜力，目前国内市场的hUC-MSC的存储业务具有广阔的前景。但是，如何高效规范的保证干细胞的分离提取率以及保证干细胞优质，从而满足未来干细胞移植的临床需求，是目前国内干细胞存储业务的亟待解决的问题。
[0004]目前hUC-MSC多采用酶消化法和组织贴壁法来制备。然而，目前国内外关于h U C -M S C的分离和扩增方法混乱，且大多步骤相当复杂，使得快速提取大数量、高纯度hUC-MSC仍存在一定困难。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对本领域的需要，提供一种能够高效、快速地分离提取hUC-MSC的方法。
[0006]本发明的另一目的是提供通过本发明的方法获得的hUC-MSC。
[0007]具体而言，因此，本发明针对目前国内外人脐带间充质干细胞的提取现状，利用红细胞裂解液处理对hUC-MSC原代生长影响较大的红细胞，同时利用胶原酶进行消化来缩短原代细胞培养时间，从而实现快速高效地提取高纯度hUC-MSC。并且，整个过程采用无血清培养体系，更有利于干细胞的未来临床转化应用。
[0008]本发明的技术方案如下。
[0009]一方面，本发明提供了从新鲜脐带离体外层羊膜组织中分离和提取间充质干细胞的方法，其为一种分离培养脐带间充质干细胞的方法，所述方法包括:采用红细胞裂解液与胶原酶处理外层羊膜组织。
[0010]本发明采用的红细胞裂解液为包含NH4C1和Na2-EDTA的水溶液，优选为包含l-20g/L 的 NH4C1 和 0.05-0.2mM Na2-EDTA 的水溶液，更优选为包含 5_10g/L 的 NH4C1 和0.lmmol/L Na2_EDTA的水溶液，pH为7.2-7.4。在使用之前，过0.22 μ m微滤膜，平衡至室温。
[0011 ] 本发明采用的胶原酶为IV型胶原酶，优选为包含IV型胶原酶的消化液，优选为包含IV型胶原酶、透明质酸酶、DNA酶和血清替代物的D-Hank’ s液，更优选为包含1% IV型胶原酶、0.5%透明质酸酶、300U/ml DNA酶和2%血清替代物的D-Hank’ s液。其中百分数按重量百分数计。
[0012]本发明的方法具体包括:将获得的脐带外层羊膜组织分割成组织块，加入1-3倍组织块体积的所述红细胞裂解液，在室温下处理2-5分钟；然后向经处理的组织块中加入包含IV型胶原酶的消化液再次处理。
[0013]优选地，所述方法还包括:经胶原酶消化后，采用间充质干细胞无血清培养基培养，以获得原代间充质干细胞。
[0014]间充质干细胞无血清培养基包含a-MEM/DMEM_F12、β -巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)和血清替代物。
[0015]优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.05-0.2体积份的β -巯基乙醇、
0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液、8-12体积份的血清替代物、85-95体积份的a_MEM/DMEM-F12和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，其中所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；更优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、10体积份的血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-F 12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子；最优选地，所述间充质干细胞无血清培养基由所述a-MEM/DMEM-F12、β -巯基乙醇、非必需氨基酸水溶液、重组人碱性成纤维生长因子和血清替代物组成。
[0016]根据本申请的【具体实施方式】，所述非必需氨基酸水溶液可以采用Gibco公司货号为11140的产品。
[0017]根据本申请的【具体实施方式】，所述血清替代物可以采用KnockOut? SerumReplacement (Gibco 公司产品，货号 10828-010)。
[0018]优选地，所述方法包括:将获得的脐带外层羊膜组织剪成1-3_3大小的组织块，加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟；然后向经处理的组织块中加入2-3倍体积的包含IV型胶原酶的消化液，在37°C和5%浓度的C02下消化8_12小时；
[0019]优选地，所述方法还包括:以1-5X104细胞/cm 2培养皿面积的密度将得到的细胞接种于间充质干细胞无血清培养基中，在37°C和5%浓度的C02下培养，每3-4天更换新鲜培养基。
[0020]优选地，所述方法包括以下步骤:
[0021](1)脐带组织的预处理:
[0022]将新鲜脐带分割成小段，去除血管淤血，纵向剖开，剔除脐动脉和脐静脉，钝性分离外层羊膜，加入PBS缓冲液清洗；
[0023](2)红细胞裂解液处理:
[0024]将经步骤(1)获得的脐带外层羊膜组织分割成组织块，加入红细胞裂解液处理，离心收集经处理的组织块，加入PBS缓冲液清洗；
[0025](3)胶原酶消化:
[0026]将经步骤(2)获得的组织块中加入包含IV型胶原酶的消化液再次处理，然后加入PBS缓冲液稀释，无菌筛过滤收集细胞；
[0027](4)原代培养:
[0028]采用间充质干细胞无血清培养基培养经步骤(3)获得的细胞，以获得原代间充质干细胞；
[0029]优选地，所述方法还包括以下步骤:
[0030](5)上清液检测:
[0031]取步骤⑷中培养细胞的上清液，检测以下项目中的一种或多种:甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人类免疫缺陷病毒、支原体、衣原体和内毒素；
[0032](6)传代培养:
[0033]取步骤(5)中检测项目为阴性的培养细胞，胰酶消化后离心收集细胞，传代培养，收集细胞或继续传代；
[0034](7)细胞检测:
[0035]取步骤(6)中培养的细胞，检测以下项目中的一种或多种:分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。
[0036]优选地，所述步骤(1)包括:将新鲜脐带分割成2-3cm长的小段，去除血管中淤血，纵向剖开，剔除脐动脉和脐静脉，钝性分离外层羊膜，加入1.5-2倍体积的PBS缓冲液，轻微摇晃清洗；
[0037]优选地，所述步骤⑵包括:
[0038]将经清洗的脐带外层羊膜组织剪成1-3_3大小的组织块，加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟，离心收集组织块，PBS缓冲液清洗2-3次；其中优选地，所述离心为1000-1200rpm、4°C下离心6分钟；
[0039]优选地，所述步骤(3)包括:
[0040]向经处理的外层羊膜组织块中加入2-3倍体积的包含IV型胶原酶的消化液，在37°C和5%浓度的C02下消化8-12小时，然后加入PBS缓冲液稀释后经100目或200目无菌筛过滤，收集滤过液，PBS清洗离心；其中优选地，所述离心为1000-1200rpm、4°C下离心6分钟；
[0041 ] 优选地，所述步骤(4)包括:
[0042]以1-5 X 104细胞/cm2培养皿面积的密度将经步骤(3)获得的细胞接种于间充质干细胞无血清培养基中，在37°C和5%浓度的C02下培养，每3-4天更换新鲜培养基；
[0043]优选地，所述步骤(5)包括:
[0044]取步骤(4)中培养细胞的上清液，检测以下项目中的全部:甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人类免疫缺陷病毒、支原体、衣原体和内毒素；
[0045]优选地，所述步骤(6)包括:
[0046]取步骤(5)中全部检测项目为阴性的培养细胞，待贴壁细胞汇合率达3