.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红细胞裂解液为包含NH4C1和Na2-EDTA的水溶液，优选为包含l_20g/L的NH4C1和0.05-0.2mM Na2-EDTA的水溶液，更优选为包含 5-10g/L 的 NH4C1 和 0.1mM Na2_EDTA 的水溶液，pH 为 7.2-7.4 ； 优选地，所述胶原酶为IV型胶原酶，优选为包含IV型胶原酶的消化液，优选为包含IV型胶原酶、透明质酸酶、DNA酶和血清替代物的D-Hank’ s液，更优选为包含1% IV型胶原酶、0.5%透明质酸酶、300U/ml DNA酶和2%血清替代物的D-Hank’ s液。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括:将获得的脐带外层羊膜组织分割成组织块，加入1-3倍组织块体积的所述红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟；然后向经处理的组织块中加入所述包含IV型胶原酶的消化液再次处理。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括:经胶原酶消化后，采用间充质干细胞无血清培养基培养，以获得原代间充质干细胞；其中所述间充质干细胞无血清培养基包含a-MEM/DMEM-F12、β -巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)和血清替代物； 优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.05-0.2体积份的β -巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液、8-12体积份的血清替代物、85-95体积份的a_MEM/DMEM-F12和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，其中所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸； 更优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.1体积份的β -巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、10体积份的血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-F 12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子； 最优选地，所述间充质干细胞无血清培养基由所述a-MEM/DMEM-F 12、β -巯基乙醇、非必需氨基酸水溶液、重组人碱性成纤维生长因子和血清替代物组成。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括:将获得的脐带外层羊膜组织剪成1-3_3大小的组织块，加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟；然后向经处理的组织块中加入2-3倍体积的所述包含IV型胶原酶的消化液，在37°C和5%浓度的C02下消化8-12小时； 优选地，所述方法还包括:以1-5X104细胞/cm 2培养皿面积的密度将得到的细胞接种于间充质干细胞无血清培养基中，在37°C和5%浓度的C02下培养，每3-4天更换新鲜培养基。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)脐带组织的预处理: 将新鲜脐带分割成小段，去除血管淤血，纵向剖开，剔除脐动脉和脐静脉，钝性分离外层羊膜，向羊膜组织中加入PBS缓冲液清洗； (2)红细胞裂解液处理: 将经步骤(1)获得的脐带组织分割成组织块，加入红细胞裂解液处理，离心收集经处理的组织块，加入PBS缓冲液清洗； (3)胶原酶消化: 将经步骤(2)获得的组织块中加入包含IV型胶原酶的消化液再次处理，然后加入PBS缓冲液稀释，无菌筛过滤收集细胞； (4)原代培养: 采用间充质干细胞无血清培养基培养经步骤(3)获得的细胞，以获得原代间充质干细胞； 优选地，所述方法还包括以下步骤: (5)上清液检测: 取步骤⑷中培养细胞的上清液，检测以下项目中的一种或多种:甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人类免疫缺陷病毒、支原体、衣原体和内毒素； (6)传代培养: 取步骤(5)中检测项目为阴性的培养细胞，胰酶消化后离心收集细胞，传代培养，收集细胞备用、冻存或继续传代； (7)细胞检测: 取步骤(6)中培养的细胞，检测以下项目中的一种或多种:分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括:将新鲜脐带分割成2-3cm长的小段，去除血管中淤血，纵向剖开，剔除脐动脉和脐静脉，钝性分离外层羊膜，向羊膜组织中加入1.5-2倍体积的PBS缓冲液，轻微摇晃清洗； 优选地，所述步骤(2)包括: 将经清洗的脐带外层羊膜组织剪成1-3_3大小的组织块，加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟，离心收集组织块，PBS缓冲液清洗2-3次；其中优选地，所述离心为1000-1200rpm、4°C下离心6分钟； 优选地，所述步骤(3)包括: 向经处理的外层羊膜组织块中加入2-3倍体积的包含IV型胶原酶的消化液，在37°C和5%浓度的C02下消化8-12小时，然后加入PBS缓冲液稀释后过100目或200目无菌筛过滤，收集滤过液，PBS清洗离心；其中优选地，所述离心为1000-1200rpm、4°C下离心6分钟； 优选地，所述步骤(4)包括: 以1-5X 104细胞/cm 2培养皿面积的密度将得到的细胞接种于间充质干细胞无血清培养基中，在37°C和5%浓度的C02下培养，每3-4天更换新鲜培养基； 优选地，所述步骤(5)包括: 取步骤(4)中培养细胞的上清液，检测以下项目中的全部:甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人类免疫缺陷病毒、支原体、衣原体和内毒素； 优选地，所述步骤(6)包括: 取步骤(5)中全部检测项目为阴性的培养细胞，待贴壁细胞汇合率达30-60%时，胰酶消化后离心收集细胞，传代培养至汇合率达90%以上，收集细胞备用、冻存或继续传代；其中优选地，所述胰酶的使用浓度为质量百分比为0.125%，消化1-2分钟，消化过程中轻拍培养皿或培养瓶侧壁；并且其中优选地，所述离心为1000-1200rpm、4°C下离心6分钟； 优选地，将收集的细胞以2-3X 106细胞/ml的密度冷冻保存在-196液氮中；或者优选地，将收集的细胞以1:3-1:4的比率进行细胞传代； 优选地，所述步骤(7)包括: 取步骤(6)中培养的细胞，检测以下项目中的全部:分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中在步骤(1)之前还进行脐带清洗、保存和使用前处理； 优选地，所述处理包括: 无菌条件下采集自然分娩或剖宫产的健康新生儿脐带组织，经表面无菌生理盐水清洗后，放入脐带保存运输液中，优选在6小时内冰上运输至洁净细胞实验室；在使用前，将新鲜脐带以75%乙醇水溶液冲洗2-3遍，再用无菌生理盐水冲洗3-5次； 其中优选地，所述脐带保存运输液为包含注射用青霉素钠、硫酸链霉素、庆大霉素和两性霉素B的无钙镁D-Hank’s液；更优选地，其中所述青霉素钠、硫酸链霉素和庆大霉素的浓度为100-200U/mL，优选150U/ml ;两性霉素B的浓度为200-400U/mL，优选300U/mL。9.通过权利要求1至8中任一项所述的方法获得的hUC-MSC。10.根据权利要求9所述的hUC-MSC，其特征在于，所述间充质干细胞具有以下特征: (1)粘附于塑料培养器皿成梭形旋涡状生长； (2)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和 HLA-ABC 的阳性比例大于 99.0% ;CD45、CD34 和HLA-DR的阳性比例小于1.0% ; (3)体外可诱导分化为成骨细胞和成脂细胞； (4)活细胞检测比率达99%以上； (5)呈典型的“S型”生长曲线特性； (6)表达多能性基因，所述多能性基因为选自SSEA-4、0CT-4、NAN0G和SOX-2中的一种或多种。11.权利要求2所述的红细胞裂解液、包含IV型胶原酶的消化液和/或权利要求4所述的间充质干细胞无血清培养基在制备用于分离培养间充质干细胞的试剂中的用途。12.一种用于分离培养间充质干细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的红细胞裂解液、包含IV型胶原酶的消化液和/或权利要求4所述的间充质干细胞无血清培养基。
【专利摘要】本发明提供了一种快速分离提取人脐带间充质干细胞(human？Umbilical？Cord？mesenchymal？stem？cells，hUC-MSC)的方法。该方法包括以下步骤：取新鲜采集的健康新生儿的脐带组织，在含双抗的脐带保存运输液中冰上运输，经75％酒精和生理盐水清洗消毒，剔除血管后钝性分离外层羊膜，机械粉碎，经红细胞裂解液处理3分钟，IV型胶原酶消化，过100-200目筛后以无血清培养基悬浮培养，每3-5天进行换液，取上清检测细胞污染，待平皿内贴壁率达30-70％，胰酶消化后，离心收集细胞进行传代扩增，至细胞汇合率达90％以上汇合，收集细胞冻存并检测hUC-MSC的生物学特性。
【IPC分类】C12N5/0775
【公开号】CN105420185
【申请号】CN201510918974
【发明人】郭镭
【申请人】郭镭, 里程
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月11日