[0119]实施例6不同时间红细胞裂解液处理脐带提取间充质干细胞的方法
[0120]样本的采集与运输，脐带组织的预处理方法参考实施例2，将外层羊膜组织剪成l-3mm3肉糜状组织块，加入含5g/L的NH 4C1与0.1mM Na2-EDTA的红细胞裂解液(pH为7.2-7.4)，分别处理脐带组织块1、2、5、7或10分钟后，采用包含IV胶原酶的消化液消化8h，过200目筛后均匀接种在100mm无菌培养皿上，每皿加10ml间充质干细胞无血清培养基，放入C02浓度为5 %的37 °C培养箱进行培养。观察细胞生长情况。
[0121]结果:在处理时间为1分钟的组中，平皿底仍有明显可见的红细胞影响间充质干细胞贴壁；在处理时间为2或5分钟的组中，皿底红细胞较少，间充质干细胞贴壁数量多，细胞明亮，快速贴壁(2-3天)；在处理时间为7或10分钟的组中，平皿底无红细胞，间充质干细胞数量极少，贴壁的间充质干细胞生长缓慢。
[0122]实施例7不同浓度IV型胶原酶的消化液提取间充质干细胞的方法
[0123]样本的采集与运输，脐带组织的预处理方法参考实施例2，将外层羊膜组织剪成l-3mm3肉糜状组织块，加入含5g/L的NH 4C1与0.1mM Na2-EDTA的红细胞裂解液(pH为
7.2-7.4)，处理2分钟，离心收集组织块，向离心管中加入组织块2倍体积的包含IV型胶原酶的消化液(包含0.1%、0.5%、1%、2%或5% IV型胶原酶、0.5%透明质酸酶、300U/mlDNA酶、2%血清替代物的D-Hank’s液)，移入C02浓度为5%的37°C恒温培养箱中，消化8小时后从培养箱中移出洁净工作台。过200目无菌筛。加入脐带间充质干细胞无血清培养基，制成细胞悬液，以3X 104细胞/cm2接种于100mm培养皿，放入C0 2浓度为5%的37°C培养箱进行培养。观察细胞生长情况。
[0124]结果:经其中IV型胶原酶浓度为0.1 %或0.5%的消化液处理8h后，消化液中仍有大量组织块未消化完全，200目筛困难，易堵塞；经其中IV型胶原酶浓度为1%的消化液处理8h后，组织块消化充分，少量残余组织块，易过筛，铺皿后，大部分细胞贴壁生长，死细胞少；经其中IV型胶原酶浓度为2%或5%的消化液处理8h后，组织块消化充分，过200目筛以相同密度铺皿后，有大量细胞消化死亡，不能贴壁生长。
[0125]实施例8不同时间IV型胶原酶的消化液提取间充质干细胞的方法
[0126]实施方法参照实施例5的条件，IV型胶原酶的消化液为包含1 % IV型胶原酶、
0.5%透明质酸酶、300U/ml DNA酶、2%血清替代物的D-Hank’s液，消化液处理时间分别为
2、4、6、8、10、12、16、20、24h，其他条件相同，观察细胞生长情况。
[0127]结果:在处理时间为2、4或6h的组中，消化不充分，消化液中仍有大量组织块残留，200目筛困难，易堵塞，细胞数量少，原代细胞培养时间长；在处理时间为8、10或12h的组中，组织块消化充分，少量残留组织块，易过筛，铺皿后，大部分细胞贴壁生长，死细胞少，细胞生长快速；在处理时间为16、20或24h的组中，组织块消化充分，过200目筛以相同密度铺皿后，不能贴壁死细胞较多，贴壁细胞生长缓慢。
[0128]实施例9 hUC-MSC形杰学鉴定
[0129]通过实施例3的分离培养，在培养2天后，显微镜下可见明亮贴壁圆形细胞。培养3天后在显微镜下可见到明亮贴壁圆形细胞伸出触角，呈梭形贴壁状，在7天左右形成旋涡状细胞团出现。消化传代培养过程中，细胞形态均一，增殖快，传代过程细胞状态稳定。
[0130]实施例10流式细胞仪分析hUC-MSC的表面标志
[0131]取实施例3分离培养的第3代细胞，待细胞生长至90%汇合后，2mL0.125%胰酶消化，然后在4°C下1200rpm离心6分钟，弃上清收集细胞，PBS清洗两次，将细胞每管1 X 105转移至流式管，分别加 5 μ L CD34-PE、CD45-FITC、CD29-FITC、CD44-PE、CD73-PE、CD105-PE、CD90-FITC、HLA-ABC-FITC、HLA-DR-PE、IgGl_PE(同型对照)和 IgGl_FITC(同型对照)抗体，混匀4°C下避光孵育30分钟，PBS清洗一次，离心去上清，加500 μ L PBS缓冲液重悬混匀，上机检测(流式细胞仪XL，Beckman公司)，每个样本收集1 X 104细胞。
[0132]细胞免疫表型如下:
[0133]阳性表达:CD29>99.0%，CD44>99.0 %，CD73>99.0 %，CD105>99.0 %,CD90>99.0%，HLA-ABC 99.0% ；
[0134]阴性表达:CD34<1.0%, CD45<1.0%, HLA-DR<1.0%o
[0135]结果参见图3。
[0136]实施例11细胞活力仪分析hUC-MSC的细胞活力、生长特性
[0137]将实施例3分离培养的第二代细胞接种到T25培养瓶中，待细胞达到95% -100%汇合后，0.125%胰酶消化，收集细胞以1X105/孔密度接种于两个6孔板。待细胞全部贴壁后且部分生长10小时后，收集两孔细胞加500 μ L PBS制成细胞悬液，上机分析(细胞活力分析仪V1-Cell XR，Beckman公司)。此后每12小时取样分析，绘制生长曲线。
[0138]结果参见图4，表明hUC-MSC活性在99.7%以上，细胞直径分布在9-12 μ m，成梭形旋涡状生长的hUC-MSC消化后具有完整圆度，并且具有潜伏期、对数增长期、平台期的增殖特性。
[0139]实施例12 hUC-MSC多向分化潜能的鉴定
[0140]1)成骨诱导分化
[0141]将实施例2分离培养的第4代hUC-MSC以3X 104细胞/cm 2接种至6孔细胞培养板，24小时后，每孔添加新鲜配制的人UC MSC成骨诱导分化培养基(HUXUC-90021，赛业产品)2mL，此后每3天更换新鲜的成骨分化诱导培养基，2周后多聚甲醛固定，茜素红染色3-5分钟。
[0142]结果参见图5A，表明以本发明方法得到的hUC-MSC在成骨诱导两周后，茜素红与成骨过程的钙结节发生深红色显色反应，另外成骨标志基因0ΡΝ也在诱导前后出差异表达。
[0143]2)成脂诱导分化
[0144]将实施例2分离培养的第4代hUC-MSC以2 X 104细胞/cm 2接种至6孔细胞培养板，待细胞达到100%汇合后，每孔添加成脂诱导分化培养基A液(HUXUC-90031，赛业产品)开始诱导，3天后换成成脂诱导分化培养基B液进行维持24小时，如此循环。当脂滴出现较多但较小时，用成脂诱导液B维持7天，诱导结束后4%多聚甲醛固定，油红0染色。
[0145]结果参见图5B，表明以本发明方法得到的hUC-MSC在成脂诱导两周后，油红0对成脂细胞着色明显。
[0146]实施例13 RT-PCR分析hUC-MSC多能性基因
[0147]将实施例2分离培养的第3代hUC-MSC以5 X 105细胞的密度接种于T25细胞培养瓶中，2-3天后至细胞100%汇合收集细胞，按总RNA提取试剂盒(R6834-01，0MRGA公司产品)抽提RNA，将抽提的RNA用反转录试剂盒(RR014A，TAKARA产品)反转录得到cDNA样本，并进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后移至凝胶成像仪观察。
[0148]结果参见图6，表明脐带多能性标志基因NANOG、0CT4、S0X2以及SSEA4有明亮程度不同的条带。
[0149]实施例14免疫荧光染忾分析hUC-MSC特异性蛋白
[0150]将实施例2分离培养的第3代hUC-MSC以5 X 103细胞每孔的密度接种于24孔细胞培养板，待细胞生长至30%?50%汇合，以4%多聚甲醛固定15分钟后用0.25% TritonX-100打孔处理20分钟，山羊血清封闭后加稀释好的鼠抗人一抗(抗-S0X2抗体、抗-0CT4抗体、抗-NAN0G抗体和抗-NAN0G抗体)，在4°C下过夜避光孵育；之后加FITC标记的山羊抗鼠二抗，在室温下避光孵育2小时；然后以DAPI/PI染核，在室温下避光孵育20分钟，荧光显微镜下观察。
[0151]结果参见图7，表明以本发明方法分离提取的hUC-MSC表达S0X-2、OCT-4、NAN0G以及SSEA-4特异性蛋白。
[0152]以上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
【主权项】
1.一种分离提取hUC-MSC的方法，其特征在于，所述方法包括:采用红细胞裂解液与胶原酶处理脐带外层羊膜组织。2