骨过程的钙结节发生显色反应产生的深红色化合物，图5B为油红0对成脂细胞的脂肪泡特异性着色。
[0088]图6为获得的hUC-MSC多能性基因在转录水平的RT-PCR分析。其中Μ为核酸分子量标准，1为内参基因β -Actin，2为NAN0G，3为0CT_4，4为S0X_2，5为SSEA-4。
[0089]图7为免疫荧光染色分析获得的hUC-MSC多能性特异蛋白。
【具体实施方式】
[0090]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0091]未注明具体条件的，按照本发明所属领域的常规条件或仪器试剂供应商的建议条件进行；未注明商购来源的，为可以市售购得的常规产品。
[0092]实施例1间充质干细胞无血清培养基组成的筛选
[0093](一)血清替代物的含量筛选
[0094]受试培养基:0.1体积份的β -巯基乙醇，10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF, Peprotech公司)，1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140,Gibco公司)，1、2、5、8、10、12、15或20体积份的Knockout FBS血清替代物(10828-028，Gibco公司)，89体积份的 a-MEM0
[0095]在生物安全柜内，取分离于自然分娩新生儿脐带华通式胶组织的第3代的hUC-MSC，以2X 104个细胞八1112密度接种于了75细胞培养瓶，加12_15ml常规市售培养基培养细胞。培养并观察细胞已完全贴壁后，更换15mL受试培养基。观察细胞生长情况。
[0096]结果:在培养基中分别含1、2、5体积份血清替代物的三个浓度组中，细胞增殖缓慢，在接种24小时后观察细胞，hUC-MSC部分细胞聚集，细胞扁平，折光率差，汇合度达20%左右，接种48小时后观察细胞，hUC-MSC细胞明亮，达60%左右汇合后，基本停止增殖(见图1A);在培养基中分别含8、10、12体积份血清替代物的三个浓度组中，细胞生长状态良好，在接种24小时后观察细胞，hUC-MSC呈梭形旋涡状聚集，伸展度高，细胞明亮，汇合度达40-60%，接种48小时后观察细胞，hUC-MSC细胞明亮，达90%以上汇合；在培养基中分别含15、20体积份血清替代物的两个浓度组中，出现和低浓度组相同的状况，细胞生长缓慢，细胞扁平化，轮廓清晰(见图1B)。
[0097]( 二)重组人碱性成纤维生长因子的含量筛选
[0098]受试培养基:0.1体积份的0-巯基乙醇，1、2、5、8、10、12、15、18或201^/1111的重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF，Peprotech公司)，1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140，Gibco 公司)，10 体积份的 Knockout FBS 血清替代物(10828-028，Gibco 公司),89体积份的a-MHM。
[0099]参考第(一)部分方法，以相同细胞源、相同密度接种，加12_15mL常规市售培养基培养细胞。培养并观察细胞已完全贴壁后，更换15mL受试培养基。观察细胞生长情况。
[0100]结果:在培养基中分别含l、2ng/ml bFGF的两个浓度组中，细胞增殖缓慢，细胞状态差，呈现营养不足状态(参见图1C);在培养基中分别含5、8、10、12、15ng/ml bFGF的浓度组中，细胞正常生长，亮度高，生长好；在培养基中分别含18、20ng/ml bFGF的浓度组中，细胞增殖良好，明亮，但经过多次传代过程中，细胞易分化，细胞会成团状汇集，或触角变长(参见图1D) ο
[0101 ] 实施例2红细胞裂解液辅助胶原酶提取hUC-MSC的方法
[0102]样本的采集与运输:无菌条件下采集自然分娩新生儿脐带样本，放入含青霉素钠、硫酸链霉素、庆大霉素和两性霉素B的脐带保存运输液，(D-Hank’s液中所述青霉素钠、硫酸链霉素和庆大霉素的浓度为150U/ml ;两性霉素B的浓度为300U/mL)中，6小时内冰上运输至洁净细胞房；
[0103]样本的清洗和消毒:在生物安全柜柜内，将新鲜脐带样本放入50ml无菌离心管中，75%酒精冲洗2遍，再用无菌生理盐水冲洗3次；
[0104]脐带组织的预处理:用眼科剪将脐带剪成2-3cm长短左右小段，用镊子除去血管中淤血，每段用眼科剪纵向剖开，用血管钳去除两条脐动脉和一条脐静脉，将脐带外层羊膜组织置于50ml离心管，加1.5-2倍体积PBS缓冲液，轻微摇晃清洗；
[0105]红细胞裂解液处理:将PBS清洗的脐带外层羊膜组织转移至洁净无菌的100mm培养皿，剪成1-3_3大小组织块；将肉糜状脐带外层羊膜组织块重新转移至离心管，加入
1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液，室温处理3分钟，然后1200rpm、4°C下离心6分钟，弃上清，收集组织块；PBS缓冲液清洗2次；其中红细胞裂解液包含5g/L的NH4C1和0.1mMNa2-EDTA，pH 为 7.2-7.4 ；
[0106]IV型胶原酶消化:向离心管中加入组织块2倍体积的包含IV型胶原酶的消化液(包含1% IV型胶原酶、0.5%透明质酸酶、300U/ml DNA酶、2%血清替代物的D-Hank’ s液)，移入C02浓度为5%的37°C恒温培养箱中，消化8小时后从培养箱中移出洁净工作台，加PBS缓冲液稀释后过200目无菌筛过滤，收集滤过液，放入50ml离心管，PBS清洗后1200rpm、4°C下离心6分钟，去残留酶；
[0107]hUC-MSC原代培养:轻弹离心管底细胞团，加入脐带间充质干细胞无血清培养基，制成细胞悬液，以3 X 104细胞/cm2接种于100mm培养皿，共得6个皿，移入恒温培养箱中，每3天更换新鲜培养基；所述间充质干细胞无血清培养基包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液(11140，Gibco公司)、10体积份的Knockout?血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的b_FGF ；
[0108]移入恒温培养箱中培养第5天，用移液器缓慢吸取培养上清液，检测以下项目:甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人类免疫缺陷病毒，支原体、衣原体、内毒素；
[0109]细胞传代:移入恒温培养箱中培养，原代培养第6天贴壁细胞汇合率达50%左右时(图2A)，加0.125%胰酶消化1-2分钟(消化过程中轻拍培养皿或培养瓶侧壁)后，4°C下1200rpm离心6分钟，弃上清收集细胞，再以1:4比例接种于T75细胞培养瓶继续进行传代培养，直至汇合率达90%，收集细胞冻存或继续进行传代培养。
[0110]检测得知，待细胞传至第2代后细胞纯度大于99%。传代后培养的成纤维状细胞形态见图2B。
[0111]实施例3红细胞裂解液辅助胶原酶提取hUC-MSC的方法
[0112]采用的红细胞裂解液包含10g/L的NH4C1和0.1mM Na2_EDTA，pH为7.2-7.4。
[0113]参考实施例2的方法进行，包含IV型胶原酶的消化液消化12小时，原代细胞共铺8个培养皿，培养至第2天有间充质干细胞贴壁，在第7天左右汇合率达60%，胰酶消化后传代；传至第三代后细胞纯度大于99.2%，活力为99.7%。
[0114]实施例4不使用红细胞裂解液提取脐带间充质干细胞的方法
[0115]样本的采集与运输，脐带组织的预处理方法参考实施例2，将外层羊膜组织剪成l-3mm3肉糜状组织块，不经红细胞裂解液处理，仅采用包含IV胶原酶的消化液消化8h，过200目筛后均匀接种在100mm无菌培养皿上，每皿加10ml间充质干细胞无血清培养基，放入C02浓度为5%的37°C培养箱进行培养。移入培养箱第3天有间充质干细胞贴壁，但有大量红细胞贴在皿底，占据干细胞贴壁空间，细胞生长状况不佳(图2C)。
[0116]实施例5不同浓度红细胞裂解液提取间充质干细胞的方法
[0117]样本的采集与运输，脐带组织的预处理方法参考实施例2，将外层羊膜组织剪成1-3_3肉糜状组织块，分别加入含1、2、5、7、10、15或20g/L的NH4C1与0.1mM Na2_EDTA的红细胞裂解液(pH为7.2-7.4)，处理2分钟，采用包含IV胶原酶的消化液消化8h，过200目筛后均匀接种在100mm无菌培养皿上，每皿加10ml间充质干细胞无血清培养基，放入C02浓度为5%的37°C培养箱进行培养。观察细胞生长情况。
[0118]结果:经其中NH4C1浓度为1或2g/L的红细胞裂解液处理后，平皿底仍有明显可见的红细胞影响间充质干细胞贴壁；经其中NH4C1浓度为5、7或10g/L的红细胞裂解液处理后，皿底红细胞较少，间充质干细胞贴壁时间短(2-3天)；经其中NH4C1浓度为15或20g/L的红细胞裂解液处理后，平皿底无红细胞，但间充质干细胞贴壁数量极少，大量漂浮死亡细胞，贴壁时间晚(4-5天)。