0-60%时，胰酶消化后离心收集细胞，传代培养至汇合率达90%以上，收集细胞冻存或继续传代；其中优选地，所述胰酶的使用浓度为质量百分比为0.125%，消化1-2分钟，消化过程中轻拍培养皿或培养瓶侧壁；并且其中优选地，所述离心为1000-1200rpm、4°C下离心6分钟；
[0047]优选地，将收集的细胞以2-3X 106细胞/ml的密度冷冻保存在_196°C液氮中；或者优选地，将收集的细胞以1:3-1:4的比率进行细胞传代；
[0048]优选地，所述步骤(7)包括:
[0049]取步骤(6)中培养的细胞，检测以下项目中的全部:分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。
[0050]优选地，所述方法中在步骤(1)之前还进行脐带清洗、保存和使用前处理，优选包括:
[0051]无菌条件下采集自然分娩或剖宫产的健康新生儿脐带组织，经表面无菌生理盐水清洗后，放入脐带保存运输液中，优选在6小时内冰上运输至洁净细胞实验室；在使用前，将新鲜脐带以75%乙醇水溶液冲洗2-3遍，再用无菌生理盐水冲洗3-5次；
[0052]其中优选地，所述脐带保存运输液为包含注射用青霉素钠、硫酸链霉素、庆大霉素和两性霉素B的无钙镁D-Hank’s液；更优选地，其中所述青霉素钠、硫酸链霉素和庆大霉素的浓度为100-200U/mL，优选150U/ml ;两性霉素B的浓度为200_400U/mL，优选300U/mL。
[0053]根据本发明的【具体实施方式】，所述从新鲜脐带外层羊膜组织中分离和提取间充质干细胞的方法包括以下步骤:
[0054](1)样本的采集与运输:无菌采集自然分娩或剖宫产的健康新生儿脐带组织，放入保存运输液中，冰上运输；
[0055](2)脐带组织的清洗和消毒:将新鲜脐带样本放入50ml无菌离心管中，75%酒精冲洗2-3遍，再用无菌生理盐水冲洗3-5次；
[0056](3)脐带组织的预处理:用眼科剪将脐带剪成2-3cm长短左右小段，用镊子除去血管中淤血，每段用眼科剪纵向剖开，用血管钳剔除两条脐动脉和一条脐静脉，钝性分离外层羊膜，将外层羊膜组织块置于50ml离心管，加1.5-2倍体积PBS缓冲液，轻微摇晃清洗；
[0057](4)红细胞裂解液处理:将PBS清洗的脐带外层羊膜组织转移至洁净无菌的100mm培养皿，剪成1-3_3大小组织块；将肉糜状脐带外层羊膜组织块重新转移至离心管，加入
1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液；室温处理2-5分钟，离心收集组织块；PBS缓冲液清洗2-3次；
[0058](5) IV型胶原酶消化:向离心管中加入组织块体积2-3倍的IV型胶原酶溶液，移入C02浓度为5%的37°C恒温培养箱中，8-12小时后从培养箱中移至洁净工作台，加PBS缓冲液稀释后过100或200目无菌筛，收集滤过液于50ml离心管，PBS缓冲液清洗离心，去残留酶；
[0059](6) hUC-MSC原代培养:轻弹离心管底细胞团，加入hUC-MSC无血清培养基，制成细胞悬液，转移至100mm培养皿，移入C02浓度为5%的37°C恒温培养箱中，每3天更换新鲜培养基；
[0060](7)取步骤(6)中培养上清，检测以下项目:甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人类免疫缺陷病毒、支原体、衣原体、内毒素；
[0061](8)hUC-MSC传代培养:待平皿内贴壁细胞汇合率达60-80%左右时，胰酶消化，离心去上清收集细胞，再接种于T75细胞培养瓶继续进行传代培养，直至汇合率达90%以上，收集细胞冻存或继续进行传代培养；
[0062](9)针对步骤⑶所得的hUC-MSC，检测以下项目:分化能力、细胞活性、细胞纯度、
细胞污染、增殖特性。
[0063]上述方法中，所述样本为新鲜脐带组织。
[0064]上述方法中，所述脐带保存运输液为临用现配的加入注射用青霉素钠、硫酸链霉素、庆大霉素、两性霉素B的无钙镁D-Hank’ s液，其中青霉素钠、硫酸链霉素和庆大霉素在保护液中的终浓度均为100-200U/mL，两性霉素B终浓度为300U/ml ;40_60mL保护液装于无菌样本瓶，封口膜封口。
[0065]上述方法中，所述间充质干细胞培养基为无血清培养基，包含0.1体积份的β -巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸、10体积份的血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的b-FGF。
[0066]所述红细胞裂解液为包含5-10g/L的NH4C1和0.lmmol/L Na2_EDTA的水溶液，pH为7.2-7.4，过0.22 μ m微滤膜，平衡至室温备用。
[0067]IV型胶原酶消化液为含1%胶原酶IV、0.5%透明质酸酶、300U/ml DNA酶、2%血清替代物的D-Hank’ s液。
[0068]并且步骤(6)中，接种密度为2-3 X 104细胞/cm 2。
[0069]步骤(8)中，胰酶浓度为0.125 %，消化时间为1_2分钟，消化过程中轻拍培养皿或培养瓶侧壁；所述传代比例为1:3-1:4 ;所述冻存为每ml冻存液保存2-3X106个细胞。
[0070]另一方面，本发明还提供通过上述方法获得的hUC-MSC。
[0071 ] 优选地，所述hUC-MSC具有以下特征:
[0072](1)粘附于塑料培养器皿成梭形旋涡状生长；
[0073](2)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105 和 HLA-ABC 的阳性比例大于 99.0% ;CD45、CD34和HLA-DR的阳性比例小于1.0% ;
[0074](3)体外可诱导分化为成骨细胞和成脂细胞；
[0075](4)活细胞检测比率达99 %以上；
[0076](5)呈典型的“S型”生长曲线特性；
[0077](6)表达多能性基因，所述多能性基因为选自SSEA-4、0CT_4、NAN0G和S0X-2中的一种或多种。
[0078]又一方面，本发明提供本文所述的红细胞裂解液、包含IV型胶原酶的消化液和/或所述间充质干细胞无血清培养基在制备用于分离培养间充质干细胞的试剂中的用途。
[0079]再一方面，本发明提供一种用于分离培养间充质干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括本文所述的红细胞裂解液、包含IV型胶原酶的消化液和/或所述间充质干细胞无血清培养基。
[0080]本发明提出了一种采用红细胞裂解液辅助胶原酶消化的脐带间充质干细胞提取方法，其中用红细胞裂解液处理能够去除对hUC-MSC原代细胞生长影响较大的红细胞，在很大程度上提高了所提取的hUC-MSCs纯度；而胶原酶消化显著缩短了原代细胞的培养时间，因而这一提取方法实现了优良效果。综合而言，本发明的提取方法在6-8天便可收获原代细胞，并且在第二代后细胞纯度便可达到99%以上。此外，本发明的方法简单易行，成本低廉，采用的培养基无血清组分，且组成明晰，避免了在培养细胞培养过程中因血清批次差异导致细胞生长过程不稳定的情况，也排除了传播异种病原体危险的可能，基于此的无血清培养使得hUC-MSC的安全性更高，具有良好的应用前景。
[0081]经流式细胞仪测定，经活力检测、分化能力鉴定以及多能性基因分析，通过本发明方法获得的间充质干细胞活率高，纯度高，分化能力强，建立的细胞库可直接用于科学研究和临床辅助治疗。
【附图说明】
[0082]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:
[0083]图1是在培养基组成筛选过程中的细胞图，其中图1A为低浓度血清替代物培养基接种48小时后细胞形态，图1B为高浓度血清替代物培养基接种24小时后细胞形态，图1C为低浓度bFGF培养基接种24小时后细胞形态，图1D为高浓度bFGF培养基培养细胞在传代后细胞形态。
[0084]图2为所培养的hUC-MSC的细胞形态，其中图2A为原代细胞的初始汇合形态，图2B为传代后培养的成纤维状细胞形态，图2C为不使用红细胞裂解液处理的细胞形态。
[0085]图3 (3A至31)为获得的hUC_MSC经流式细胞仪分析细胞表面分子的结果，显示所述 hUC-MSC 表达 CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC，阳性比例大于 99.0% ;不表达CD45、CD34、HLA-DR，阳性比例小于 1.0%。
[0086]图4为V1-Cell细胞活力分析仪对获得的hUC_MSC的细胞活力、生长特性分析，其中图4A为hUC-MSC的实时活力分析，图4B为hUC-MSC的生长曲线，图4C为hUC-MSC的直径分布图，图4D为hUC-MSC的消化后圆度分布图。结果表明hUC-MSC的活性在99.7%以上，细胞直径分布在9-15 μ m，并且具有潜伏期、对数增长期、平台期的增殖特性。
[0087]图5为获得的hUC-MSC向成骨细胞的定向诱导分化，其中图5A为茜素红与成