一种人外周血间充质干细胞的培养方法以及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，公开了一种人外周血间充质干细胞的培养方法以及应用。本发明所述培养方法先采集外周血，分离出血浆和外周血单个核细胞；将外周血单个核细胞用含所述血浆的M199培养基进行重悬，然后加入EGF因子培养3-5天；去掉未贴壁的悬浮细胞，更换前述添加了血浆和EGF因子的M199培养基继续培养；当细胞达到80％-90％融合时，消化细胞，获得培养后的PB-MSC。本发明将从外周血分离出的外周血单个核细胞以有别于传统方式的不同培养基进行有效培养，避免采用动员剂，保证了培养后的PB-MSC数量，同时提供了PB-MSC在抗皮肤衰老中的应用。
【专利说明】—种人外周血间充质干细胞的培养方法以及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体的说是涉及一种人外周血间充质干细胞的培养方法以及应用。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。在特定的机体外分化环境下，能够诱导分化为神经、心脏、肝脏、骨、软骨、肌腱、脂肪、上皮等多种组织细胞，被认为是细胞治疗技术的最有希望的来源细胞之一，是近期研究的热点。大量研究证实，MSC可以从骨髓分离得到，但也存在于其他不同组织和脏器，如肌肉、脂肪组织、脐血、胎盘、血管等，不同来源的MSC在生物活性和作用原理上上都存在或多或少的差巳
[0003]外周血间充质干细胞(PB-MSC)是从人外周血中分离得到的间充质干细胞。它们的形态、表面标记及其分化潜能与骨髓间充质干细胞(BM-MSC)相似。目前对MSC的研究主要集中在骨髓、脂肪、脐带、脐血等方面，但是其应用于临床最大的瓶颈是取材过程中会使供者产生创伤性，存在并发症、得到的MSC的数量也较少(I X 104cellS/ml-5X 14ceIls/ml)，并且BM-MSC在体外培养时其生物学特性会发生一定程度的改变和转化。
[0004]对于外周血中MSC来说，相对研究的较少，这主要是因为PB-MSC在外周血中的含量少，分离提取和纯化培养相对困难，且对操作和实验室条件都有一定的要求。但是相比骨髓、脂肪组织、胎盘等这些创伤较大的MSC来源，外周血中的MSC采集简单，创伤小，不受时间的限制，且具有多向分化的能力。如果能建立起有效的分离和扩增体系，外周血作为一种可供选择的MSC来源，用于细胞治疗和再生医学领域，将具有非常广阔的临床应用前景。
[0005]为了解决PB-MSC含量少的问题，有采用G-CSF来提高PB-MSC在外周血中的含量。G-CSF，人类粒细胞集落刺激因子，它是一个膜转运蛋白，通过影响骨髓基质微环境的粘附分子表达或功能状态，降低干细胞与骨髓基质的粘附作用，使干细胞脱离骨髓，进入外周血循环。
[0006]现有技术中，血液采集前需对供者注射G-CSF动员剂进行动员，连续5天动员后再采集血液，采用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，分离人外周血单个核细胞(PBMC)，再用DMEM/F12培养基加上10%的胎牛血清培养PB-MSC，贴壁培养I?2天后即去掉悬浮细胞得到贴壁细胞。尽管动员后会得到相对较多的PB-MSC，但是同时也将得到更多的其他血系细胞，PB-MSC的分离和纯化带来新的问题和挑战，且经过培养后得到的贴壁细胞中只有很少比例的PB-MSC，一般为5%?30%。且使用动员剂后，对供者的副作用明显，因此不是最佳的采集和培养PB-MSC的方法。
【发明内容】
[0007]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人外周血间充质干细胞的培养方法以及应用，使得所述培养方法在不使用动员剂的前提下提高PB-MSC的数量，同时可以应用到抗皮肤衰老的美容中。
[0008]为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
[0009]一种人外周血间充质干细胞的培养方法，包括:
[0010]步骤1、采集外周血，分离出血浆和外周血单个核细胞；
[0011 ] 步骤2、将外周血单个核细胞用含步骤1所述血浆的M199培养基进行重悬，然后加入EGF因子培养3-5天；
[0012]步骤3、去掉未贴壁的悬浮细胞，更换步骤2所述的添加了血浆和EGF因子的M199
培养基继续培养，此后每2天更换一次新鲜培养基；
[0013]步骤4、当细胞达到80% -90%融合时，消化细胞，获得培养后的PB-MSC。
[0014]将培养后的PB-MSC进行表面标记鉴定，结果显示，其表达⑶29和⑶44，而不表达⑶45和MHC2，与当下的BM-MSC表面标记鉴定结果一致。同时经过诱导分化，所获得的PB-MSC能够进行成脂分化和成骨分化。
[0015]针对现有的采用动员剂获得PB-MSC的方法的缺陷，本发明避免采用动员剂，采用将从外周血分离出的PB-MSC进行有效培养的方式，获得了数量较多的PB-MSC。
[0016]其中，作为优选，步骤1为:
[0017]采集外周血，离心，分离出上层血浆备用，然后将下层血细胞用等体积的生理盐水稀释后，缓慢加到装有淋巴细胞分离液的液面上，离心，离心后吸取外周血单个核细胞层，获得外周血单个核细胞。更优选地，稀释后的血细胞:淋巴细胞分离液的体积比为2:1。
[0018]在分离PB-MSC时，离心后从管底到液面分为4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、外周血单个核细胞层(包含PBMC)、血浆层。
[0019]作为优选，所述血浆的体积百分含量为10%。
[0020]作为优选，所述EGF因子的浓度为5?30ng/ml。
[0021]作为优选，所述培养的环境条件为37°C、5% C02。
[0022]作为优选，步骤2所述外周血单个核细胞的细胞培养密度为IX 106cellS/ml。
[0023]作为优选，所述消化细胞以0.25%胰酶/0.02% EDTA消化细胞。
[0024]此外，本发明所述培养方法还包括将培养获得的PB-MSC按1:3进行传代的步骤。
[0025]按照本发明所述培养方法获得的PB-MSC数量为5X105cells/ml-10X105cells/ml,占整个贴壁细胞的90-95%，相对于来源于骨髓的BM-MSC细胞数量提高了一个数量级，同采用动员剂的方法获得的PB-MSC纯度相比也有很大提升。
[0026]将培养后获得PB-MSC以紫外线损伤小鼠为模型进行抗皮肤光老化试验，为实验组小鼠注射PB-MSC，为模型组小鼠注射生理盐水，为阳性对照组注射维生素C(本实验采用维生素C作为阳性对照组的注射药物)，阴性对照组则不对小鼠进行紫外照射和制剂注射。结果显示，模型组小鼠的皮肤很粗糙，没有光泽，呈现明显的皮肤老化现象，而阳性对照组的皮肤虽然要好于模型组，但是整体上较实验组皮肤粗糙、缺乏光泽，有一定的老化现象。实验组组小鼠的皮肤厚度没有明显的变化，表面比较红润，没有出现粗深皱纹、红斑等光老化现象，比较接近阴性对照组。
[0027]基于此，本发明提供了 PB-MSC在抗皮肤衰老中的应用，优选地，所述述抗皮肤衰老为抗皮肤光老化。
[0028]由以上技术方案可知，本发明将从外周血分离出的外周血单个核细胞接种到含血浆和EGF因子的M199培养基中进行有效培养，避免采用动员剂，保证了培养后的PB-MSC数量，同时提供了 PB-MSC在抗皮肤衰老中的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1所示为从外周血分离出的包含PB-MSC的外周血单个核细胞形态图；
[0030]图2所示为培养24小时后的包含PB-MSC的外周血单个核细胞形态图；
[0031]图3所示为去掉未贴壁的悬浮细胞后的PB-MSC形态图；
[0032]图4所示为达到80% -90%融合状态的PB-MSC形态图；
[0033]图5所示为模型组小鼠皮肤组织切片图；
[0034]图6所示为实验组小鼠皮肤组织切片图；
[0035]图7所示为阴性对照组小鼠皮肤组织切片图；
[0036]图8所示为阳性对照组小鼠皮肤组织切片图。
【具体实施方式】
[0037]本发明实施例公开了一种人外周血间充质干细胞的培养方法以及应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0038]为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种人外周血间充质干细胞的培养方法以及应用进行详细说明。
[0039]实施例1:分离培养PB-MSC
[0040]米集外周血20ml,转移到50mL离心管中，2000rpm/min离心5min。收集上层血衆，4°C保存备用；下层血细胞采用Ficoll淋巴分离液(深圳市达科为生物技术有限公司；货号:AS1114546)分离得到外周血单个核细胞(包含PB-MSC，见图1)。
[0041]将外周血单个核细胞用含10%上述分离出的血浆的M199培养基(Gibco，供应商为广州速研生物科技有限公司；货号:C11150500BT)进行重悬，按照I X 106cells/ml的密度接种于培养瓶中，补加终浓度为20ng/ml的EGF因子。24h后看到有成纤维状的细胞贴壁(见图2)，放在37°C、5% CO2的细胞培养箱中，静置培养3天。
[0042]3天后，去掉未贴壁的悬浮细胞(见图3)，加入含10%分离出的血浆的M199培养基继续培养，并添加终浓度为20ng/ml的EGF因子，以后每隔2天更换一次新鲜培养基。
[0043]当细胞达到80%-90%融合(见图4)时，用0.25%胰酶/0.1 % EDTA消化细胞获得培养后的PB-MSC，细胞数量为106cellS/ml，占贴壁细胞百分比93.7%，传代以1:3传代。
[0044]实施例2:分离培养PB-MSC
[0045]米集外周血20ml,转移到50mL离心管中，2000rpm/min离心5min。收集上层血衆，4°C保存备用；下层血细胞采用Ficoll淋巴分离液(深圳市达科为生物技术有限公司；货号:AS1114546)分离得到外周血单个核细胞(包含PB-MSC，参照图1)。
[0046]将外周血单个核细胞用含10%上述分离出的血浆的M199培养基(Gibco，供应商为广州速研生物科技有限公司?’货号:C11150500BT)进行重悬，按照1 X 106cells/ml的密度接种于培养瓶中，补加终浓度为20ng/ml的EGF因子。24h后看到有成纤维状的细胞贴壁(参照图2)，放在37°C、5% C02的细胞培养箱中，静置培养3天。
[0047]3天后，去掉未贴壁的悬浮细胞(参照图3)，加入含10%分离出的血浆的M199培养基继续培养，并添加终浓度为20ng/ml的EGF因子，以后每隔2天更换一次新鲜培养基。
[0048]当细胞达到80% -90%融合(参照图4)时，用0.25%胰酶/0.02% EDTA消化细胞获得培养后的PB-MSC，细胞数量6X105cells/ml，占贴壁细胞百分比94.9%，传代以1:3传代。
[0049]实施例3:分离培养PB-MSC
[0050]米集外周血20ml,转移到50mL离心管中，2000rpm/min离心5min。收集上层血衆，4°C保存备用；下层血细胞采用Ficoll淋巴分离液(深圳市达科为生物技术有限公司?’货号:AS1114546)分离得到外周血单个核细胞(包含PB-MSC，参照图1)。
[0051]将外周血单个核细胞用含10%上述分离出的血浆的M199培养基(Gibco，供应商为广州速研生物科技有限公司；货号:C11150500BT)进行重悬，按照1 X 106cells/ml的密度接种于培养瓶中，补加终浓度为20ng/ml的EGF因子。24h后看到有成纤维状的细胞贴壁(参照图2)，放在37°C、5% C02的细胞培养箱中，静置培养3天。
[0052]3天后，去掉未贴壁的悬浮细胞(参照图3)，加入含10%分离出的血浆的M199培养基继续培养，并添加终浓度为20ng/ml的EGF因子，以后每隔2天更换一次新鲜培养基。
[0053]当细胞达到80% -90%融合(参照图4)时，用0.25%胰酶/0.02% EDTA消化细胞获得培养后的PB-MSC，细胞数量5X105cellS/ml，占贴壁细胞百分比92.4%，传代以1:3传代。
[0054]实施例4:分离培养PB-MSC
[0055]米集外周血20ml,转移到50mL离心管中，2000rpm/min离心5min。收集上层血衆，4°C保存备用；下层血细胞采用Ficoll淋巴分离液(深圳市达科为生物技术有限公司；货号:AS1114546)分离得到外周血单个核细胞(包含PB-MSC，参照图1)。
[0056]将外周血单个核细胞用含10%上述分离出的血浆的M199培养基(Gibco，供应商为广州速研生物科技有限公司；货号:C11150500BT)进行重悬，按照1 X 106cells/ml的密度接种于培养瓶中，补加终浓度为2ng/ml的EGF因子。24h后看到有成纤维状的细胞贴壁(参照图2)，放在37°C、5% C02的细胞培养箱中，静置培养3天。
[0057]3天后，去掉未贴壁的悬浮细胞(参照图3)，加入含10%分离出的血浆的M199培养基继续培养，并添加终浓度为20ng/ml的EGF因子，以后每隔2天更换一次新鲜培养基。
[0058]当细胞达到80% -90%融合(参照图4)时，用0.25%胰酶/0.02% EDTA消化细胞获得培养后的PB-MSC，细胞数量9X105cells/ml，占贴壁细胞百分比90.3%，传代以1:3传代。
[0059]实施例5:PB-MSC抗皮肤光老化作用研究实验
[0060]紫外线照射皮肤，表面皮肤会有红斑出现，皮肤老化初期，皮肤厚度增加，随着老化程度的加深，真皮层和表皮层的厚度都会变薄，皮肤变得很粗糙，皱纹加深等。其原因主要是真皮层的胶原纤维不断分解，胶原纤维之间的排列紊乱，胶原蛋白含量下降等因素引起的。
[0061]本实验模拟日光中紫外线含量，采用UVA(长波紫外线)+UVB(中波紫外线)的紫外线损伤小鼠皮肤，UVA强度为6.0mff/cm2, UVB强度为0.48mW/cm2。为实验组小鼠注射经生理盐水重悬的PB-MSC，为模型组小鼠注射生理盐水，阴性对照组则不对小鼠进行紫外照射和制剂注射(I次/天，细胞数量I X 106cells/ml)，为阳性对照组注射维生素C溶液，经过14天后观察。
[0062]外观观察结果显示，模型组小鼠的皮肤很粗糙，没有光泽，呈现明显的皮肤老化现象；而实验组组小鼠的皮肤厚度没有明显的变化，表面比较红润，没有出现粗深皱纹、红斑等光老化现象，与阴性对照组很接近；而阳性对照组的皮肤虽然要好于模型组，但是整体上较实验组皮肤粗糙、缺乏光泽，有一定的老化现象。
[0063]皮肤组织切片HE(苏木素依红)染色后，可以从皮肤的结构改变看出皮肤的老化程度。模型组小鼠皮肤组织切片与阴性对照组(图7)相比，表皮厚度明显增加，真皮厚度急剧减少，棘细胞异常增多，胶原纤维异常增产且排列紊乱，皮肤附件也出现明显的增生，呈现出皮肤初期老化的明显特征(图5)。而实验组小鼠皮肤组织HE染色显示，皮肤结构完整且清晰，表皮及真皮层均未见明显增厚，表皮非常光滑，横纹肌与真皮之间的未见异常增生的胶原纤维说明富有弹性，未见炎症细胞浸润等现象，没有明显的老化迹象(图6);阳性对照组表皮厚度开始增加，真皮厚度开始减少，棘细胞开始增多，胶原纤维开始出现异常，皮肤附件也出现增生迹象，呈现出皮肤初期老化的一些迹象(图8)。
[0064]实施例6 =PB-MSC脸部皮肤抗衰老实验
[0065]受试者使用经生理盐水重悬后的PB-MSC进行脸部抗衰老，一个月后对其进行回访，发现受试者的脸部皮肤相对使用制剂之前有了明显的改善，且没有任何不适感。受试者的皮肤变得细腻而有光泽，眼袋明显消失了，两边的法令纹也变淡了许多。实验证明了PB-MSC抗衰老制剂的有效性和安全性。
[0066]以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
【权利要求】
1.一种人外周血间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括: 步骤1、采集外周血，分离出血浆和外周血单个核细胞； 步骤2、将外周血单个核细胞用含步骤I所述血浆的M199培养基进行重悬，然后加入EGF因子培养3-5天； 步骤3、去掉未贴壁的悬浮细胞，更换步骤2所述的添加了血浆和EGF因子的M199培养基继续培养，此后每2天更换一次新鲜培养基； 步骤4、当细胞达到80% -90%融合时，消化细胞，获得培养后的PB-MSC。
2.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，步骤I为: 采集外周血，离心，分离出上层血浆备用，然后将下层血细胞用等体积的生理盐水稀释后，缓慢加到装有淋巴细胞分离液的液面上，离心，离心后吸取外周血单个核细胞层，获得外周血单个核细胞。
3.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述血浆的体积百分含量为10%。
4.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述EGF因子的浓度为5-30ng/ml。
5.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述培养的环境条件为37°C、5%C02。
6.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，还包括将培养获得的PB-MSC按1:3进行传代的步骤。
7.根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，步骤2所述外周血单个核细胞的细胞培养密度为 lX106cells/ml。
8.PB-MSC在抗皮肤衰老中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述抗皮肤衰老为抗皮肤光老化。
【文档编号】A61P17/16GK104388385SQ201410690907
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 陈洁鸿, 王小燕, 罗二梅 申请人:广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司