磁珠结合的CD34-细胞随缓冲液流出，与磁珠结合的CD34+细胞保留在 吸附柱中；
[0035] (5-8)将吸附柱移出磁场后，置于15mL离心管上空，用Buffer缓冲液冲洗吸附柱 即获得纯化的⑶34+细胞；
[0036] (5-9)计数并流式细胞仪检测⑶34+阳性率。
[0037] 所述的抗凝管为肝素钠抗凝管。
[0038] 所述的配置造血干细胞培养体系的方法为往頂DM培养基中加入质量百分比为 15%的胎牛血清、60ng/mL的干细胞因子（SCF)、60ng/mL的促血小板生长因子（ΤΡ0)、10ng/ mL的粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)、30ng/mL的白介素6 (IL-6)、30ng/mL的IL-3/ GM-CSF融合蛋白（G3)、10ng/mL粒细胞集落刺激因子（G-CSF)、2μg/mL的咖啡酸苯乙酸酯 (CAPE)，由此而得造血干细胞培养基。
[0039] 步骤2中所述的将离心吸取血浆后剩余的下层血细胞部分，与质量百分比为6% 的羟乙基淀粉溶液按1:6的体积比例完全混匀。
[0040] 步骤2中所述的使得羟乙基淀粉质量百分比的终浓度为：1. 0%。
[0041] (1-2)中所述的将抗凝血1800r/m离心lOmin，血液分层，吸上层澄清液体即自体 血浆，于56°C水浴灭活30min后，2500r/m离心lOmin，去除沉淀，放置于-80°C条件下长期 保存备用。
[0042] 所述的（4-5)中的计数方法为MNC计数方法。
[0043] 所述的（4-5)中的检测方法为用流式细胞仪检测⑶34+阳性率。
[0044] 所述的步骤2中的羟乙基淀粉溶液质量百分比为6%。
[0045] 所述的（3-1)中的胎牛血清的质量百分比为5%。
[0046] 本发明的取材方面：从目前三种来源以外的来源即非动员的外周血中提取造血干 细胞，即避免了给病人造成极大痛苦、创伤及副作用，又不存在来源控制，解决了取材不便 的问题。
[0047] 技术方面：本发明解决了目前的技术从非动员的外周血中提取造血干细胞的纯度 不高，提取数量偏少不利于后期扩增的问题。
[0048] 因此本发明重在研究从简单方便的取材中体外分离数量及纯度高的造血干细胞， 以便于后期大量扩增培养，用于造血干细胞移植治疗临床造血系统疾病。
【附图说明】
[0049] 图1为本发明的实施例的表面标志⑶34+的流式检测图；
[0050] 图2为本发明的纯化前单个核细胞中⑶34+的纯度；
[0051] 图3为本发明的纯化后单个核细胞中⑶34+的纯度。
【具体实施方式】
[0052] 本发明即从非动员的外周血中提取HSC，避免了现有技术中的问题，开辟了新的来 源。
[0053] 近年来，HSC表面标志研究的发展丰富了干细胞分离纯化的手段。根据HSC的表 面标志，可通过免疫细胞化学、流式细胞仪、分子杂交和PCR等多种细胞生物学和分子生物 学手段来检测造血干细胞。正如上述所提及的，现大多仍然基于对CD34+细胞的富集来筛 选造血干细胞。如焚光激活细胞分选（fluorescenceactivatedcellsorting,FACS)纯 度可达到95%，但是，成本较高，仪器也较贵，因此本发明使用免疫吸附系统一免疫磁珠分 离CD34+细胞，免疫磁珠分离系统分离量大，分离纯度和细胞质量均可用于后期大量扩增 培养。
[0054] -般来说，HSC大部分在骨髓里，而外周血液中含有少量的HSC，因此从非动员的 外周血中分离HSC有一定困难，本发明先采用特殊培养体系富集培养，再分离HSC，突破了 从非动员的外周血中分离HSC数量较少，纯度不高的问题，可用于大规模分离HSC并用于后 期大量培养扩增，以便于临床使用。
[0055] 造血干细胞在临床应用的深远意义已毋庸置疑。HSC是首先被应用于临床治疗的 一群干细胞。由于它们具有自我更新、多向分化、来源相对广泛、采集和体外处理容易等特 点，使它们具有广阔的应用前景。临床治疗中，造血干细胞移植（hematopoieticstemcell transplantation)技术已经逐渐成熟并且得到广泛的应用，已经成为治愈恶性血液病和 实体瘤（如淋巴瘤，生殖细胞瘤，乳腺癌，小细胞肺癌）等疾病的可靠选择，成为干细胞研究 和应用的成功范例。
[0056] 下面结合实施例对本发明做进一步说明：
[0057] 外周血中分离富集造血干细胞的方法，步骤如下：
[0058] 步骤1 :自体血浆的制备阶段，具体如下：
[0059] (1-1)抽取病人80ml血液，至肝素钠抗凝管中；
[0060] (1-2)将抗凝血1800r/m离心10min，血液分层，吸上层澄清液体即自体血衆，于 56°C水浴灭活30min后，2500r/m离心10min，去除沉淀，放置于2-8°C保存1-7天或-80°C 长期保存备用；
[0061] 步骤2:轻乙基淀粉（HES)去红细胞阶段，具体如下：
[0062] 将离心吸取血浆后剩余的下层血细胞部分，与质量百分比为6%的羟乙基淀粉溶 液按1:5或者1:6的体积比例完全混匀，使得羟乙基淀粉质量百分比的终浓度为：1.2%或 者1.0%，然后60Xg离心lOmin，取上清液备用；
[0063] 步骤3 :单个核细胞的制备，具体如下：
[0064] (3-1)将步骤2中备用的上清，用含质量百分比为5%的胎牛血清、不含Ca2+和 Mg2+离子、pH7. 2的磷酸盐缓冲液（DPBs)按1:2的体积比例稀释并混匀备用；
[0065] (3-2)吸取20mlFicoll液，加入50ml离心管底部，并使得管壁上不要残留Ficoll 液；
[0066] (3-3)将（3-1)中稀释好的上清液缓慢铺平于Ficoll液面上，Ficoll液于上清液 的体积比例为1:1. 25,平衡后800Xg离心20min;
[0067] (3-4)吸取白细胞层，用磷酸盐缓冲液（DPBs)稀释悬浮1600r/m离心5min后去上 清；
[0068] (3-5)用磷酸盐缓冲液（DPBs)悬浮离心后的细胞沉淀1600r/m离心5min洗涤一 次；
[0069] (3-6)用含质量百分比为5%的胎牛血清的RPMI1640培养基洗涤一次，方式同步 骤（3-5)，去上清收集细胞并计数；
[0070] 步骤4:单个核细胞（MNC)体外富集培养阶段，具体如下：
[0071] (4-1)配置造血干细胞培养体系：
[0072] 往IMDM培养基中加入质量百分比为15%的胎牛血清、60ng/mL的干细胞因 子（SCF)、60ng/mL的促血小板生长因子（TPO)、10ng/mL的粒-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、30ng/mL的白介素6(IL-6)、30ng/mL的IL-3/GM-CSF融合蛋白（G3)、10ng/mL粒 细胞集落刺激因子（G-CSF)、2μg/mL的咖啡酸苯乙酸酯（CAPE)，由此而得造血干细胞培养 基；
[0073] (4-2)用造血干细胞培养基调整细胞浓度为5X106/ml，接种于75cm2的细胞培养 瓶中置于37°C、5%C02培养箱孵育120min;
[0074] (4-3)收集培养瓶中的非贴壁的细胞悬液，转移至另一 75cm2的培养瓶中置于 37°C、5%C02培养箱培养，即可去除贴壁的细胞。
[0075] (4-4)采取1/2换液法，每3天用PBS清洗一次细胞并更换一次培养基；
[0076] (4-5)富集培养7天后，MNC计数并流式细胞仪检测⑶34+阳性率；
[0077] 步骤5:⑶34+造血干细胞的获得阶段，具体如下：
[0078] (5-1)培养7天后，对步骤4中的单个核细胞计数，并1400r/m离心5min收集单个 核细胞；
[0079] (5-2)用不含Ca2+和Mg2+离子、ρΗ7· 2的磷酸盐缓冲液（DPBs)清洗一遍，1400r/ m离心5min，弃上清；
[0080] (5-3)计算细胞浓度，按每1X10s个细胞用300μLBuffer液的比例重悬细胞，不 足1X10s个细胞按1X108个计算；<