br>[0081](5-4) (5-3)中体系每1X10s个细胞加入100μLFCR阻断剂抑制非特异性或FC 受体介导的结合⑶34震荡15s混匀；
[0082] (5-5) (5-4)中体系加入100μL抗⑶34磁珠，震荡15s混匀，并置于4°C冰箱孵育 30min；
[0083] (5-6) (5-5)中体系加入5mLBuffer液吹打混匀，并300Xg离心12miη后弃上 清，用500μLBuffer液重悬单个核细胞；
[0084] (5-7)选择MS+吸附柱置于磁场中，将（5-6)中重悬的单个细胞Buffer液通过磁 场中的吸附柱，未与磁珠结合的CD34-细胞随缓冲液流出，与磁珠结合的CD34+细胞保留在 吸附柱中；
[0085] (5-8)将吸附柱移出磁场后，置于15mL离心管上空，用Buffer缓冲液冲洗吸附柱 即获得纯化的⑶34+细胞；
[0086] (5-9)计数并流式细胞仪检测⑶34+阳性率。
[0087] 本实施例的⑶34+造血干细胞实验结果数据统计表格如下表1所示：
[0088] 表1
[0089]
[0090] 图1为本实施例的表面标志⑶34+的流式检测图；而图2和图3为对应的流式荧 光信号直方图，其中图2为纯化前单个核细胞中CD34+的纯度；图3为纯化后CD34+单个核 细胞中⑶34+的纯度。
[0091] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽 然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人 员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰 为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质，在 本发明的精神和原则之内，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍 属于本发明技术方案的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于，步骤如下： 步骤1 :自体血浆的制备阶段，具体如下： (1-1)抽取病人80ml血液，至抗凝管中； (1-2)将抗凝血1800r/m离心lOmin，血液分层，吸上层澄清液体即自体血衆，于56°C水浴灭活30min后，2500r/m离心lOmin，去除沉淀，放置于2-8°C条件下保存1-7天； 步骤2 :羟乙基淀粉（HES)去红细胞阶段，具体如下： 将离心吸取血浆后剩余的下层血细胞部分，与羟乙基淀粉溶液按1:5的体积比例完全 混匀，使得羟乙基淀粉质量百分比的终浓度为：1. 2%，然后60Xg离心lOmin，取上清液备 用； 步骤3 :单个核细胞的制备，具体如下： (3-1)将步骤2中备用的上清，用胎牛血清、不含Ca2+和Mg2+离子、pH7. 2的磷酸盐缓 冲液（DPBs)按1:2的体积比例稀释并混匀备用； (3-2)吸取20mlFicoll液，加入50ml离心管底部，并使得管壁上不要残留Ficoll液； (3-3)将（3-1)中稀释好的上清液缓慢铺平于Ficoll液面上，Ficoll液与上清液的体 积比例为1:1. 25,平衡后800Xg离心20min; (3-4)吸取白细胞层，用磷酸盐缓冲液（DPBs) 稀释悬浮1600r/m离心5min后去上清； (3-5)用磷酸盐缓冲液（DPBs)悬浮离心后的细胞沉淀1600r/m离心5min洗涤一次； (3-6)用含质量百分比为5%的胎牛血清的RPMI1640培养基洗涤一次，方式同步骤 (3-5)，去上清收集细胞并计数； 步骤4 :单个核细胞（MNC)体外富集培养阶段，具体如下： (4-1)配置造血干细胞培养体系，由此而得造血干细胞培养基： (4-2)用造血干细胞培养基调整细胞浓度为5X106/ml，接种于75cm2的细胞培养瓶中 置于37°C、5%C02培养箱孵育120min; (4-3)收集培养瓶中的非贴壁的细胞悬液，转移至另一 75cm2的培养瓶中置于37°C、 5%C02培养箱培养，即可去除贴壁的细胞； (4-4)采取1/2换液法，每3天用PBS清洗一次细胞并更换一次培养基； (4-5)富集培养7天后，计数并检测CD34+阳性率； 步骤5 :⑶34+造血干细胞的获得阶段，具体如下： (5-1)培养7天后，对步骤4中的单个核细胞计数，并1400r/m离心5min收集单个核细 胞； (5-2)用不含Ca2+和Mg2+离子、pH7. 2的磷酸盐缓冲液（DPBs)清洗一遍，1400r/m离 心5min，弃上清； (5-3)计算细胞浓度，按每1X10s个细胞用300μLBuffer液的比例重悬细胞，不足 1X10s个细胞按1X10 8个计算； (5-4) (5-3)中体系每1X10s个细胞加入100μLFCR阻断剂抑制非特异性或FC受体 介导的结合⑶34震荡15s混匀； (5-5) (5-4)中体系加入100yL抗⑶34磁珠，震荡15s混匀，并置于4°C冰箱孵育 30min； (5-6) (5-5)中体系加入5mLBuffer液吹打混勾，并300Xg离心10min后弃上清，用 500. L Buffer液重悬单个核细胞； (5-7)选择MS+吸附柱置于磁场中，将（5-6)中重悬的单个细胞Buffer液通过磁场中 的吸附柱，未与磁珠结合的CD34-细胞随缓冲液流出，与磁珠结合的CD34+细胞保留在吸附 柱中； (5-8)将吸附柱移出磁场后，置于15mL离心管上空，用Buffer缓冲液冲洗吸附柱即获 得纯化的⑶34+细胞； (5-9)计数并流式细胞仪检测CD34+阳性率。2. 根据权利要求1所述的外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于所述的抗 凝管为肝素钠抗凝管。3. 根据权利要求1所述的外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于所述的 配置造血干细胞培养体系的方法为往頂DM培养基中加入质量百分比为15%的胎牛血清、 60ng/mL的干细胞因子（SCF)、60ng/mL的促血小板生长因子（TPO)、10ng/mL的粒-巨噬细 胞集落刺激因子（GM-CSF)、30ng/mL的白介素6 (IL-6)、30ng/mL的IL-3/GM-CSF融合蛋白 (G3)、10ng/mL粒细胞集落刺激因子（G-CSF)、2μg/mL的咖啡酸苯乙酸酯（CAPE)，由此而得 造血干细胞培养基。4. 根据权利要求1所述的外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于步骤2中 所述的将离心吸取血浆后剩余的下层血细胞部分，与质量百分比为6%的羟乙基淀粉溶液 按1 :6的体积比例完全混匀。5. 根据权利要求1所述的外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于步骤2中 所述的使得羟乙基淀粉质量百分比的终浓度为：1. 0%。6. 根据权利要求1所述的外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于（1-2)中 将抗凝血1800r/m离心lOmin，血液分层，吸上层澄清液体即自体血浆，于56°C水浴灭活 30min后，2500r/m离心lOmin，去除沉淀，放置于-80°C条件下长期保存备用。7. 根据权利要求1所述的外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于所述的 (4-5)中的计数方法为MNC计数方法。8. 根据权利要求1所述的外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于所述的 (4-5)中的检测方法为用流式细胞仪检测CD34+阳性率。9. 根据权利要求1所述的外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于所述的步 骤2中的羟乙基淀粉溶液质量百分比为6%。10. 根据权利要求1所述的外周血中分离富集造血干细胞的方法，其特征在于所述的 (3-1)中的胎牛血清的质量百分比为5%。
【专利摘要】本发明公开了一种外周血中分离富集造血干细胞的方法，步骤如下：步骤1：自体血浆的制备阶段；步骤2：羟乙基淀粉(HES)去红细胞阶段；步骤3：单个核细胞的制备；步骤4：单个核细胞(MNC)体外富集培养阶段；步骤5：CD34+造血干细胞的获得阶段。本发明从简单方便的取材中体外分离数量及纯度高的造血干细胞，以便于后期大量扩增培养，用于造血干细胞移植治疗临床造血系统疾病。
【IPC分类】C12N5/0789
【公开号】CN105420192
【申请号】CN201510657508
【发明人】王泰华
【申请人】王泰华
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年10月12日