专利名称：一种黏性末端接头应用于侧翼序列分离的方法
技术领域：
本发明涉及一种侧翼序列分离的方法，尤其是涉及一种基于同尾酶设计的黏性末端接头应用于侧翼序列分离的方法
背景技术：
目前应用于侧翼序列分离的方法主要有SON-PCR、TAIL-PCR及接头-PCR。SON-PCR和TAIL-PCR是基于热不对称原理发明的PCR方法，这两种方法由于第二链合成的随机性，以及转基因株系大多不是单拷贝的缘故，造成引物匹配混乱，导致获得有用片段的效率不高。接头-PCR方法可以大大提高有效片段的获得，现已公布了三种接头-PCR获得侧翼序列的方法，但都存在一些缺点，如有的方法采用平端连接接头，使得连接效率低，不利于后期的PCR扩增；有的方法虽然使用黏性末端接头，提高了连接效率，但可供选择的酶的种类有限，适用范围不广，通用性不高；并且这几种方法接头合成费用都很高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中连接效率和通用性不能兼容，成本高的不足，提供一种连接效率高，通用性高，成本低的黏性末端接头应用于侧翼序列分离的方法。本发明解决所述技术问题所采用的技术方案是，一种黏性末端接头应用于侧翼序列分离的方法，包括如下步骤
1)提取待测基因组DNA;
2)分析已知序列的酶切位点分布情况，选择一组在已知序列中没有酶切位点的同尾酶；设计并合成该组同尾酶对应的连接接头；
3)在同一反应体系中，用该组同尾酶酶切待测基因组；或在不同的反应体系中，分别用同尾酶酶切基因组，形成具有相同的黏性末端的DNA片段；
4)电泳检测酶切质量，纯化后定量DNA片段浓度；将所述接头与基因组酶切产物(即同尾酶消化的DNA片段)连接，形成“接头-酶切片段(即同尾酶消化的DNA片段)-接头”的DNA片段；
5)纯化“接头-酶切片段(即同尾酶消化的DNA片段)-接头”的DNA片段，用已知序列的特异引物SI和S2与接头序列设计的引物Al和A2对步骤2)所得“接头-酶切片段-接头”的DNA片段进行PCR扩增；
6)回收步骤3)获得的片段并测序；
7)分析测序结果，获得已知序列的未知侧翼序列；
8)未知侧翼序列的验证。步骤I)中的一组同尾酶指
a 同尾酶 BamHI，Bell, BglII, Bspl43I, MboI, PsuI ；b 同尾酶 NcoI, PscI, BtgI, Ecol30I, FatI, PagI ；C 同尾酶 PstI, Alw21I, BseSI, Mphll03I, SdaI, SduI ；d 同尾酶 NdeI, Csp6I, FspBI, Trull, VspI ；e 同尾酶 NotI, Bspl20I, CfrI, Eco52I ；f 同尾酶 XhoI, BauI, Eco88I, Sail, SmoI ；g 同尾酶 XbaI, BcuI, Ecol30I, NheI, XmaJI ；h 同尾酶 SphI，Xcel，HinlII ；i 同尾酶 EcoRI, Muni, TasI, XapI ；j 同尾酶 Tati, Acc65I, BshNI, Bspl407I, Pfl23II ；k 同尾酶 BshTI, Bsaffl, Cfr9I, CfrlOI, Kpn2I, NgoMIV, SgrAI ；I 同尾酶 Hinll，Bspll9I, Bsul5I, Hin6I, HpaII, MaeII, MspI, NarI, Pspl406I,SsiI, TaqI, XmiI ；
m 同尾酶 MauBI, MluI, Paul, SgsI ；n 同尾酶 Pacl, BstKTI, SfaNI (即 AsiSI), PvuI ；
o同尾酶 SacI，Alw21I, Eco24I, SduI ；p 同尾酶 SspDI，BshNI ；q 同尾酶 Tail, AatII ；
步骤2)中所述接头由两条单链互补配对形成，形成的双链能与一组同尾酶消化的所有片段连接；两条单链长度都为48-52bp，形成双链后一端为平端，一端带有同一组同尾酶的互补序列；黏性端的5’端碱基磷酸化。步骤3)中，特异引物SI和特异引物S2是根据已知序列设计的嵌套引物，特异引物SI在特异引物S2的外侧；特异引物SI和特异引物S2的退火温度为70°C ±2°C。步骤3)中，引物Al和引物A2是根据接头序列设计的两条同向嵌套引物，与待测基因组的同源性不超过40%，引物Al在引物A2的外侧；引物Al的退火温度为60°C ±2°C，引物A2的退火温度为70°C ±2°C。步骤3)中，所述PCR扩增包括两轮反应，第一轮反应的引物为特异引物SI与引物Al，第二轮反应的引物为特异引物S2与引物A2 ;第一轮反应模板为酶切连接产物(即“接头-酶切片段-接头”片段)，反应程序为①98°C预变性3min ;②5循环(98°C 10s,70°C5-10min) ;25 循环(98°C 10s,60°C 30s, 72°C 5-lOmin)③最后延伸 72°C IOmin 4°C保存；第二轮反应模板为第一轮反应产物，反应程序为①98°C预变性3min;②35循环(980C 10s，70°C 5-10min);③延伸72°C IOmin ； 4°C保存；所用PCR酶为扩增长片段的DNA聚合酶。步骤4)中，当回收片段浓度> 20ng/yl时，将回收片段直接送交测序，测序引物为特异引物S2和引物A2 ;当回收片段浓度<20ng/yl时，先连到T载体，然后再测序。步骤6)中所述侧翼序列的验证方法为PCR方法，模板为待测基因组DNA ;上游引物根据已知序列的一端设计，下游引物根据所测侧翼序列的一端设计，PCR产物大小为300-800bp ;进行普通PCR后能扩增出预期大小片段，则证明分离得到的侧翼序列正确。所述引物Al 的序列为5’ - GTACAACGTGTCACTCTGGAGCAC - 3’，引物 A2 的序列为5’ - CTGGAGCACCTCTGCACGACGACCTGCGC - 3'；
特异引物SI和特异引物S2，由实验者根据其所得已知序列设计，不同的实验所用的特异引物不同。本发明所釆用的限制性内切酶全部为产生黏性末端的限制性内切酶，共有17组同尾酶，84种限制性内切酶(见表1)，几乎可以应用于所有物种的基因组侧翼序列的分析。为了增加所获得侧翼序列的可信度，通过几种同尾酶之间的组合，可以对同一位点的侧翼序列进行验证，也可以获得不同位点的侧翼序列。
表I 17组同尾酶及其匹配接头
权利要求
1.一种黏性末端接头应用于侧翼序列分离的方法，其特征在于，包括以下步骤 .1)提取待测基因组DNA; .2)分析已知序列的酶切位点分布情况，选择一组在已知序列中没有酶切位点的同尾酶；设计并合成该组同尾酶对应的连接接头； .3)在同一反应体系中，用该组同尾酶酶切待测基因组；或在不同的反应体系中，分别用同尾酶酶切基因组，形成具有相同的黏性末端的DNA片段； .4)电泳检测酶切质量，并定量DNA片段浓度；将所述接头与基因组酶切产物连接，形成“接头-酶切片段-接头”的DNA片段； .5)纯化“接头-酶切片段-接头”的DNA片段，用已知序列的特异引物SI和S2与接头序列设计的引物Al和A2对步骤2)所得“接头-酶切片段-接头”的DNA片段进行PCR扩增； .6)回收步骤3)获得的片段并测序； .7)分析测序结果，获得已知序列的未知侧翼序列； .8)未知侧翼序列的验证。
2.根据权利要求I所述的黏性末端接头应用于侧翼序列分离的方法，其特征在于，步骤I)中的一组同尾酶指a 同尾酶 BamHI，Bell, BglII, Bspl43I, MboI, PsuI ；b 同尾酶 NcoI, PscI, BtgI, Ecol30I, FatI, PagI ；c 同尾酶 PstI, Alw21I, BseSI, Mphll03I, SdaI, SduI ；d 同尾酶 NdeI, Csp6I, FspBI, Trull, VspI ；e 同尾酶 NotI, Bspl20I, CfrI, Eco52I ；f 同尾酶 XhoI, BauI, Eco88I, Sail, SmoI ；g 同尾酶 XbaI, BcuI, Ecol30I, NheI, XmaJI ； h 同尾酶 SphI，Xcel，HinlII ；i 同尾酶 EcoRI, Muni, TasI, XapI ；j 同尾酶 Tati, Acc65I, BshNI, Bspl407I, Pfl23II ；k 同尾酶 BshTI, Bsaffl, Cfr9I, CfrlOI, Kpn2I, NgoMIV, SgrAI ；I同尾酶 Hinll，Bspll9I, Bsul5I, Hin6I, HpaII, MaeII, MspI, NarI, Pspl406I,SsiI, TaqI, XmiI ；m 同尾酶 MauBI, MluI, Paul, SgsI ；n 同尾酶 Pacl, BstKTI, SfaNI, PvuI ；o 同尾酶 SacI，Alw21I, Eco24I, SduI ；p 同尾酶 SspDI，BshNI ；q 同尾酶 Tail, AatII0
3.根据权利要求I或2所述的黏性末端接头应用于侧翼序列分离的方法，其特征在于，步骤2)中所述接头由两条单链互补配对形成，形成的双链能与一组同尾酶消化的所有片段连接；两条单链长度为48-52bp，形成双链后一端为平端，一端带有同一组同尾酶的互补序列；黏性端的5’端碱基磷酸化。
4.根据权利要求I或2所述的黏性末端接头应用于侧翼序列分离的方法，其特征在于，步骤3)中，特异引物SI和特异引物S2是根据已知序列设计的嵌套引物，特异引物SI在特异引物S2的外侧；特异引物SI和特异引物S2的退火温度为70°C ±2°C。
5.根据权利要求I或2所述的黏性末端接头应用于侧翼序列分离的方法，其特征在干，步骤3)中，引物Al和引物A2是根据接头序列设计的两条同向嵌套引物，与待测基因组的同源性不超过40%，引物Al在引物A2的外侧；引物Al的退火温度为60°C ±2°C，引物A2的退火温度为70°C ±2°C。
6.根据权利要求I或2所述的黏性末端接头应用于侧翼序列分离的方法，其特征在于，步骤3)中，所述PCR扩增包括两轮反应，第一轮反应的引物为特异引物SI与引物 Al，第二轮反应的引物为特异引物S2与引物A2 ;第一轮反应模板为酶切连接产物，反应程序为① 98°C预变性 3min ;② 5 循环(98°C 10s, 70°C 5-lOmin) ;25 循环(98°C 10s, 60°C30s, 72 °C 5-10min)③最后延伸72°C IOmin 4°C保存；第二轮反应模板为第一轮反应产物，反应程序为①98°C预变性3min;②35循环(98°C 10s，70°C 5-10min);③延伸72 °C IOmin 4°C保存；所用PCR酶为扩增长片段的DNA聚合酶。
7.根据权利要求I或2所述的黏性末端接头应用于侧翼序列分离的方法，其特征在干，步骤4)中，当回收片段浓度> 20ng/yl时，将回收片段直接送交测序，测序引物为特异引物S2和引物A2 ;当回收片段浓度< 20ng/y I时，先连到T载体，然后再测序。
8.根据权利要求I或2所述的黏性末端接头应用于侧翼序列分离的方法，其特征在干，步骤6)中所述侧翼序列的验证方法为PCR方法，模板为待测基因组DNA ;上游引物根据已知序列的一端设计，下游引物根据所测侧翼序列的一端设计，PCR产物大小为300-800bp ；进行普通PCR后能扩增出预期大小片段，则证明分离得到的侧翼序列正确。
全文摘要
一种黏性末端接头应用于侧翼序列分离的方法，包括以下步骤1)提取待测基因组DNA；2)选择同尾酶；设计并合成对应的连接接头；3)用同尾酶酶切基因组，形成具有相同的黏性末端的DNA片段；4)电泳检测酶切质量，并定量DNA片段浓度；将所述接头与基因组酶切产物连接，形成“接头-酶切片段-接头”的DNA片段；5)纯化“接头-酶切片段-接头”的DNA片段，PCR扩增；6)回收步骤3)获得的片段并测序；7)分析测序结果，获得已知序列的未知侧翼序列；8)未知侧翼序列的验证。本发明之侧翼序列分离的方法，连接效率高，通用性高，成本低。
文档编号C12N15/10GK102634506SQ20121009739
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者余东, 刘瑞芬, 孙学武, 孙志忠, 段美娟, 袁光杰, 袁定阳, 袁贵龙, 袁隆平, 谭炎宁, 赵炳然 申请人:湖南杂交水稻研究中心