专利名称：树突细胞的体内靶向的制作方法
技术领域：
此处描述的本发明一般涉及为了疾病预防或为了治疗目的调节免疫反应而将膜相关抗原(Ag)靶向于树突细胞(DC)的制备物的组合物。更加特别地，本发明涉及修饰含 Ag膜的方法，以实现了靶向分子和免疫调节因子的嫁接(engraftment)和/或掺入，允许经修饰的膜体内靶向子DC，并且有效地诱导或抑制免疫反应。甚至更加特别地，本发明涉及能够用于修饰含Ag膜结构的组合物，例如脂质体或质膜囊泡(PMV)，以实现所述膜体内有效地靶向DC，因而调节免疫性，并且使它们在免疫治疗中能够用作疫苗或疫苗样试剂以预防或治疗人类和动物疾病。背景领域树突细胞(DC)是一个罕见的抗原递呈细胞(APC)群，能够独特地刺激原发免疫反应，它们在癌症免疫治疗中的用途引发了很强的兴趣。1迄今，利用DC刺激有效免疫反应的尝试主要集中在涉及离体(ex vivo)DC操作的过程。这个方法通常要求从患者分离DC，数量扩增，荷载抗原(Ag)(参考文献2-5)，然后重新引入患者。虽然这个过程在原理上很简单，但是有与分离和培养这类罕见细胞群相关的种种困难。6’7显然，体内将Ag直接递送到 DC并且引发适当免疫反应的策略具有巨大的临床潜能。DC源自骨髓中的祖细胞，作为未成熟细胞迁移到外周组织，在那里它们内吞Ag并进行复杂的成熟过程。Ag经由很多表面分子被内吞，包括补体受体(例如，CDllc/CD18)和内吞受体(例如，DEC-205、DC-SIGN和I10Il样受体)。在Ag获得过程中，未成熟DC也接受例如细菌细胞壁脂多糖(LPS)的病原体相关分子形式的“危险信号”，或者经由例如IFN-Y 的细胞因子的炎性刺激。然后DC迁移到次级淋巴器官，成熟成为感受态APC8。受体例如 CDllc/CD18、DEC-205、DC-SIGN和I10Il样受体在Ag捕获和递呈过程中扮演关键角色，并且主要表达在DC上。因此可以想象这些受体也能够用于体内Ag直接靶向DC。与这个观念一致，已经显示由C，当与炎性刺激剂(例如抗CD40抗体)共同给予时诱导T细胞激活9’ 10O相反，在没有这样的炎性刺激剂存在下，经由&FV靶向DC的抗原诱导了 T细胞的无应答性。合成脂质体具有递送大量Ag至DC的潜能(参考文献11)，但是至今在实践中很难完成它们靶向特异性DC表面分子12’13。显然，体内联合脂质体Ag运输能力和分子识别直接靶向DC有或没有“危险信号”的多重Ag的特异性之有效策略将在简化DC免疫治疗特别是对于癌症、感染和自身免疫疾病具有巨大的潜能。国际申请号PCT/AU00/00397(公开号WO 00/64471)中描述了当体内给予修饰的生物或合成膜或脂质体时，为了改变免疫的目的或者为了将药物和其它试剂靶向特异细胞类型或组织而修饰生物或合成膜或脂质体的方法。通过金属螯合基团的掺入或附着完成了所述膜或脂质体的修饰，因而允许拥有金属亲和标记的一个或多个靶向分子的嫁接。然而，通过将Ag靶向DC诱导的免疫反应的性质关键性地依赖于特异性免疫调节因子，例如细胞因子或“危险”信号，的存在，在PCT/AU00/00397中没有公开或提示体内引发合适的免疫反应要求膜的修饰或需要免疫调节因子。
发明概要 本发明的目的，这个申请的主题，是通过修饰所述膜提供将含有Ag的脂质体和 PMV体内靶向DC的组合物，其中所述膜的修饰是经由适当免疫调节因子或“危险信号”的掺入以及能够将修饰膜靶向DC表面受体从而引发适当免疫反应的配体的嫁接。为了增强免疫以预防或治疗例如各种癌症和感染的疾病，或者为了以能够用于治疗或预防移植排斥的方式抑制对特定自体Ag的免疫，或抑制自身免疫疾病例如I型糖尿病、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和多发性硬化症的影响，所述组合物能够用作疫苗或用于免疫治疗。进一步地本发明的目的是提供制备合适的组合物的方法以及利用所述组合物治疗的方法。根据本发明的第一个实施方案，提供了通过将抗原体内靶向于树突细胞调节免疫的组合物，所述组合物包含其表面具有多个金属螯合基团的含抗原膜囊泡或含抗原脂质体的制备物；以及所述树突细胞上受体的配体，所述配体经由所述配体上金属亲和标记连接于所述金属螯合基团；其中，所述含抗原囊泡或脂质体包括免疫调节因子。根据本发明的第二个实施方案，提供了通过将抗原体内靶向于树突细胞制备调节免疫反应的组合物的方法，所述方法包括如下步骤i)制备含抗原膜囊泡或含抗原脂质体；ii)通过至少一种免疫调节因子的掺入修饰所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体；iii)通过两性分子的掺入进一步修饰所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体，其中所述两性分子当掺入于其中时包含处于所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体表面的螯合基团； 以及iv)将步骤(iii)的产物与所述树突细胞上受体的配体接触，其中所述配体包括结合于所述螯合基团的金属亲和标记。根据本发明的第三个实施方案，提供了调节受试者免疫反应的方法，所述方法包括给予所述受试者根据第一个实施方案的组合物。根据本发明的第四个实施方案，提供了预防或治疗受试者肿瘤的方法，所述方法包括给予受试者根据第一个实施方案的组合物，其中包含在所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体内的所述抗原是肿瘤抗原。根据本发明的第五个实施方案，提供了预防或治疗受试者感染的方法，所述方法包括给予受试者根据第一个实施方案的组合物，其中包含在所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体内的所述抗原是来自引起感染的物质(agent)的抗原。根据本发明的第六个实施方案，提供了根据第一个实施方案的组合物制备调节受试者免疫反应的药剂的用途。根据本发明的第七个实施方案，提供了根据第一个实施方案的组合物制备预防或治疗受试者肿瘤的药剂的用途。根据本发明的第八个实施方案，提供了根据第一个实施方案的组合物制备预防或治疗受试者感染的药剂的用途。通过阅读下面本发明的详述，本发明其它的实施方案将显而易见，其中那里的描述将是之后简要描述的附随图例的参考。
图1显示了新型螯合脂质(NTA)3-DTDA的结构。图IB是掺入进由棕榈酰-油酰-磷酸卵磷脂(POPC)和磷脂酰-乙醇胺-聚乙二醇2_(PE-PEG2tlJ组成的含抗原(Ag)隐形脂质体(SL)的(NTA)3-DTDA脂质图示。相似地，图IC是与图IB的那些组成相似但是没有能与荷抗原的肿瘤细胞来源的质膜囊泡(PMV)融合的PE-PEG·的脂质体图示。SL(B)和修饰的PMV(C)两个例子中，也能包括脂质示踪物PC-B0DIPY (未显示)以促进脂质体或修饰的PMV的追踪。(NTA)3-DTDA允许组氨酸标记的抗DEC-205和⑶Ilc的kFv Ab嫁接在脂质体上或修饰的PMV表面，从而，将这些分子靶向DC的表面分子例如DEC-205和⑶11c。图2显示了嫁接了 CDlldcFv和DEC-2054cFv的PMV和SL结合于DC。至于图 2A，源于B16-0VA细胞的PMV与由POPC、(NTA) 3_DTDA和PC-B0DIPY组成的脂质体融合。然后PMV在与LTC-DC孵育和流式细胞仪定量分析细胞结合的BODIPY荧光之前，嫁接对照肽 (PMV-L2)、CDl Ic-ScFv (PMV-CDllc)或 DEC-205-ScFv (PMV-DEC-205)。图 2B 显示了结合于相似嫁接的由POPC、(NTA) 3-DTDA,PE-PEG2000和PC-B0DIPY组成的SL之LTC-DC。每个图谱是三次独立试验得到的代表性图谱。图3显示了引流淋巴结中嫁接了 kFv的PMV靶向DC。小鼠后足垫注射已经嫁接对照蛋白质(PMV-L2)或抗 CDllc (PMV-CDllc)和抗 DEC-205 (PMV-DEC-205)的 kFv 的荧光素标记之PMV。A.注射后取出引流胭淋巴结，用生物素标记的抗⑶lie mAb和PE-抗生物素蛋白链菌素染色分离的淋巴结细胞。流式细胞仪点状图显示双染色，描述了如指出的淋巴细胞的PE荧光(图i、iii和ν)以及相应的FITC荧光(图ii、iv和vi)。B.用生物素标记的抗⑶lie mAb和抗生物素蛋白链菌素-罗丹明染色的淋巴切片相似的试验结果，鉴别出有描述了罗丹明荧光(图像i、ii和ν)和PMV荧光素荧光(图像ii、iv和vi)相应区域的荧光图像的DC。图4显示了将嫁接的PMV和SL靶向DC刺激T细胞增生。A.同系C57BL6脾T细胞与未刺激的DC或与已经用嫁接了 L2、CDlldcFv或DEC-205-ScFv的B16-0VA PMV(左图)、嫁接了 L2、CDlldcFv或DEC-205-ScFv荷SL 的 SIINFEKL-6H(中图)、以及嫁接了 L2、 CDlldcFv或DEC-205-kFv含OVA的SL(右图)刺激的DC孵育。评价[3H]胸苷掺入之前培养细胞4天；结果是cpm士SEM。B. CD4+和CD8+细胞增生的刺激。CFSE标记的同系C57BL6 脾 T 细胞与用嫁接了 DEC-2054cFv 的 PMV(PMV)、嫁接了 DEC_2054cFv 和 SIINFEKL-6H 的 SL(SIINFEKL-SL)以及嫁接了 DEC-2054cFv 含 OVA 的 SL(0VA-SL)刺激的 DC 孵育。细胞培养4天，基于CFSE稀释流式细胞仪评价增生的⑶4+和⑶8+T细胞的相对比例。图5包含了用PMV和SL免疫接种小鼠的结果并显示了 CTL抗肿瘤细胞活性的刺激。A.用Y-照射的B16-0VA细胞刺激4天并且源自仅仅静脉注射了 PBS(PBS)、嫁接了 L2 肽(PMV-U)的 B16-0VA PMV、仅仅嫁接了 DEC-205-ScFv 的 PMV (PMV-DEC-205)或与嫁接与LPS (PMV-LPS-DEC-205)、IFN-y (PMV-IFN-y-DEC-205)或 GM-CSF(PMV-GM-CSF-DEC-205) 联合的DEC-205-ScFv之PMV的小鼠脾细胞之CTL活性。B.来自如下用PMV、含SIINFEKL的 SL和含OVA的SL免疫的小鼠的脾细胞(25 1 E T比率)之CTL活性，如所示每个都嫁接了 L2，CDllcScFv或DEC-205-ScFv。也显示了如所示与嫁接了的PMV和SL掺入的LPS、 IFN- γ和GM-CSF条件下的结果。星号指出了 CTL活性显著高于(η = 6. .，P < 0. 05 .， Ρ<0.01以及..，P <0.001)用相应的嫁接了 L2肽的Ag制备物免疫的小鼠。图A和B 中标准51Cr释放试验评价了在指出E T的比率的特异性裂解。结果表示为比裂解百分比士 SEM。
图6显示了用修饰的PMV和SL的免疫接种引发了肿瘤免疫。不同组的同系 C57BL6 小鼠用嫁接了 L2、CDllc-ScFv 或 DEC-205-ScFv 的 PMV ；嫁接了 SIINFEKL-6H 和 L2、 CDlIc-ScFv 或 DEC-205-ScFv 的 SL 以及嫁接了 L2、CDlIc-ScFv 或 DEC-205-ScFv 的含 OVA 的SL免疫(共三次每周一次)，如所示每个疫苗制备物单独或者与LPS或IFN- γ联合注射。用B16-0VA细胞静脉攻击小鼠，16天后取出肺并检查肺转移。结果显示了每组小鼠肿瘤灶的平均数士SEM。点状线指的是注射了 PBS的对照鼠中肿瘤转移数。图7说明了嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)敲除小鼠的抗肿瘤反应。A.如所示同系C 57BL6小鼠(嗜酸细胞活化趋化因子或C57BL6背景之上的嗜酸细胞活化趋化因子敲除小鼠(嗜酸细胞活化趋化因子+)用PBS或用嫁接了 L2(PMV-L2)或 DEC-205-ScFV (PMV-DEC-205)的含IFN-γ PMV免疫。从小鼠分离脾细胞，与Y照射的天然 B16-0VA细胞共培养。标准51Cr释放试验评价在所指的E T比率的比裂解。结果表示为比裂解百分比士SEM。B.如上免疫小鼠，然后用B16-0VA细胞静脉攻击，16天后取出肺，检查肿瘤转移。结果显示了每组小鼠肿瘤灶平均数士 SEM。图8显示了嫁接了 CDl Ic-SCFV和DEC-205-ScFv的BCG分支杆菌膜囊泡结合于DC。Ni-(NTA)3-DTDA与源自BCG分支杆菌的PMV联合，并用6-(荧光素-5 (和6_) 羧氨基)己酸琥珀酸酯标记。然后在与JAWS-II DC孵育前用对照肽(BCG-Lipo+L2)、 CDlIc-ScFv(BCG-Lipo+CDllc)或 DEC-205-ScFv(BCG_Lipo+DEC205)嫁接 PMV，之后流式细胞仪定量分析细胞结合的荧光。上图显示了 BCG-Lipo+⑶Ilc的结果而下图包含了 BCG-Lipo+DEC205的结果。每个图中，左手痕迹线是JAWS-II细胞单独，中间痕迹线是 BCG-Lipo+L2 对照，而右手痕迹线是 BCG-Lipo+CDllc 或 BCG_Lipo+DEC205。图9描述了来自已经静脉免疫接种嫁接了的BCG制备物的C57/BL6小鼠脾细胞Elispot分析的结果。这些嫁接物是L2肽作为对照(BCG超声处理物+L2)； CDIlc-ScFv (BCG 超声处理物+CDllc)或 DEC_205_ScFv (BCG 超声处理物+DEC205)。用用作制备物载体的PBS免疫接种对照小鼠。发明详述此处使用了下列缩写Ag 抗原APC抗原递呈细胞CTL细胞毒性T淋巴细胞DC树突细胞IFN-Y 干扰素-Y
LPS脂多糖(NTA) 3-DTDA三(次氮基三乙酸)双十四胺OVA卵白蛋白PMV质膜囊泡ScFv单链抗体片段SL隐形脂质体此处使用术语“抗原”表示为了递呈给免疫系统而能够被DC吸收、内化和处理的任何分子。此处使用术语“配体”表示体内能特异性结合于DC表面标记物/受体的任何分子。 术语包括完全抗体和抗体片段例如^Fvs和结构域抗体。此处使用术语“免疫调节因子”表示能调节免疫反应过程或结果的任何“危险信号”、细胞因子或分子。此处使用术语“受体”表示DC表面上的受体分子并且是能与嫁接了脂质体或膜囊泡的配体相互作用的DC表面上的实体。此处使用术语“肿瘤”表示良性和恶性实体肿瘤以及实体和非实体癌症。关于上面定义的第一个实施方案，含抗原的膜囊泡一般是PMV，但是能从任何生物膜或生物结构形成。有利地PMV是肿瘤来源的PMV。PMV也能是淋巴细胞来源的PMV或白细胞来源的PMV。PMV还能是细菌、原生动物、病毒或真菌的膜制备物。关于含抗原的脂质体，这些包括能从脂质不同混合物产生的隐形脂质体(SL)。能如参考文献14、16、17和观所述地制备这样的囊泡和脂质体，此处通过交叉引用引入全部内容作为交叉参考。组合物的抗原能够是期望的免疫反应所抵抗的任何抗原或编码抗原的DNA。组合物包含相同或不同来源的多个不同抗体。就是说包含肿瘤抗原的组合物可以包括来自不同肿瘤的抗原。囊泡和脂质体表面上的金属螯合基团作为组成囊泡和脂质体的磷脂和/或脂质内存在的两性分子首基存在。两性分子有利地是次氮基三乙酸双十四胺(NTA-DTDA)或次氮基三乙酸磷脂酰乙醇胺(PE-NTA)，但是组合物包括含有能掺入脂质膜的任何金属结合或螯合基团的任何分子。组合物还能进一步包含两性分子的混合物。如将在下面更详细解释地，优选的两性分子是(NTA)3-DTDA (三(次氮基三乙酸) 双十四胺)。国际申请号PCT/AU00/00397(公开号W000/64471)中更详细地描述了相关分子NTA-DTDA以及其它两性分子和含有相同分子的囊泡和脂质体，此处通过交叉引用引入全部内容作为参考。连接于膜囊泡和脂质体上金属螯合基团的配体是能够特异性结合于任何DC表面标记物的任何金属亲和标记的分子。优选的金属亲和标记是六组氨酸。下面的实施例中， 使用了抗DC表面分子CDl Ic和DEC-205 (0)20 的六组氨酸标记形式的kFv。其它的实施例包括任何组氨酸标记的配体，例如能结合于DC表面标记物例如DC-SIGN(⑶209)、⑶206 和⑶207的抗体或抗体片段。组合物能够包括DC上不同标记物/受体的多个配体。例如，组合物能够包含作为配体的抗DEC-205的kFv联合抗DC-SIGN的kFv。如上所示，配体的金属亲和标记一般是共价连接在配体上方便位点的六组氨酸基团。例如，六组氨酸能连接于蛋白质抗原N或C末端。其它金属亲和标记包括能螯合金属并能共价附着于配体上方便位点的任何基团或氨基酸序列。根据第一个实施方案的组合物的免疫调节因子包括能增强或修饰DC对抗原的反应的化合物或分子。这样的化合物包括“危险信号”(例如，细菌脂多糖)、细胞因子(例如， 干扰素_ Y、白细胞介素_2、白细胞介素_4、白细胞介素-10、白细胞介素-12和转化生长因子-β )，以及化学因子、激素和生长因子样分子或编码这样分子的DNA。组合物能 包括多于一个的免疫调节因子。关于本发明的第二个实施方案，在上面参考的国际申请(No. PCT/AU00/00397)中描述了制备有配体捕获在其上的膜囊泡或脂质体的合适方法。关于第二个实施方案方法的步骤(i)，膜囊泡一般是PMV但是能从任何生物膜或生物结构形成。脂质体包括SL。膜囊泡和脂质体的Ag能是将要递送到DC的蛋白质、糖蛋白、肽或多糖或编码抗原的DNA或它们的联合。第二个实施方案方法的步骤(ii)中，与第一个实施方案组合物一起，免疫调节因子能是“危险信号”(例如，细菌脂多糖)、细胞因子(例如，干扰素_ Y、白细胞介素_2、白细胞介素_4、白细胞介素-10、白细胞介素-12和转化生长因子-β )或编码这样因子的DNA。根据第三个实施方案的方法的免疫反应调节在包括移植排斥或自体免疫疾病例如I型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和多发性硬化症的病变的预防或治疗中有应用。在移植患者的情况下，这个涉及来自靶向移植受者的供者白细胞的PMV的给予。这个例子中免疫调节因子能够是例如细胞因子例如白细胞介素-10和转化生长因子- β。然而，免疫调节因子能够是具有能力产生耐受原性DC的任何分子。第四个实施方案的方法能够用于任何肿瘤的治疗，包括但不限于黑素瘤以及前列腺、肠、乳腺和肺的癌症。所述方法也能用于白血病和淋巴瘤的治疗。所述方法能用于治疗任何哺乳动物的肿瘤，但是特别适合治疗人类肿瘤。鉴于接受治疗的肿瘤，临床医生在对受试者评价后能够确立递送给受试者修饰的含Ag膜囊泡或脂质体的量以及给予方案。本领域的那些技术人员将立即认识到根据第四个实施方案的方法提供了体外操纵DC有效的替代以用于癌症免疫治疗。关于第五个实施方案，为了增强对造成感染的物质的免疫和/或用于感染的治疗所述方法能用于预防或治疗任何感染，包括细菌、分枝杆菌、病毒和真菌造成的感染。以与上面给出的移植排斥预防的实施例相似的方法，提供有效的方法所要求的就是制备包括来自传染物至少一个抗原的PMV或脂质体。那个抗原是例如病毒(例如HIV、B和C型肝炎) 的包膜蛋白或细菌(例如分支杆菌)的细胞壁成分、真菌(念珠菌)和原生动物(例如疟疾)。与本发明第三至第五个实施方案一致地能够通过本领域技术人员已知的任何方法将组合物给予受试者。一般静脉或皮下给予组合物。第三至第五个实施方案的方法的受试者一般是哺乳动物。所述方法特别适合用于人。本领域技术人员将理解根据本发明第六至第八个实施方案的药剂也将包括组合物的至少一个载体。所述载体是与PMV和脂质体相容的任何溶液。一般的载体是生理盐水和缓冲盐水例如PBS。药剂还包括与药剂预期用途相符的活性剂。例如，根据第七个实施方案的药剂包括其它抗肿瘤试剂，而根据第八个实施方案的药剂包括以抗细菌、抗原生动物、抗病毒或抗真菌活性作为适当靶感染的其它试剂。这样额外的试剂对于本领域技术人员将是已知的。原型研究原型研究中，本发明者发现为了靶向DC，螯合剂-脂质(NTA)3-DTDA能够用于将 His标记的kFv锚定在肿瘤来源的质膜囊泡(PMV)或在含肿瘤抗原的隐形脂质体上。以这种方式将Ag直接靶向DC引发了很强的抗肿瘤反应。脂质体因为具有很高的治疗潜能而很受欢迎，但是缺乏靶向分子附着的简单方法阻碍了它们的用途。13新型螯合剂-脂质(NTA)3-DTDA(图1A)当掺入入SL或肿瘤细胞来源PMV(B16-0VA)时，实现了靶向DC上表面分子的六组氨酸标记WkFv之稳定嫁接(图IB 和图1C)。嫁接了特异于DC标记物CDllc和DEC-205的ScFv的PMV和SLs体外特异性结合于DC，并且基于流式细胞仪和共聚焦显微镜研究，体内相关Ags能直接靶向DC(图2和 3)。最初，检查了 DC引发的Ag递呈试验中嫁接的PMV和SL刺激功能性反应的能力。 我们的研究显示嫁接了 ^Fv的PMV和含Ag的SL比对照PMV和SLs更加显著有效地诱导 DC刺激T细胞增生(图4A)。PMV刺激了⑶4+和⑶8+T细胞的增生。PMV具有刺激对肿瘤细胞囊泡中存在的抗原决定簇有反应性的所有可能T细胞克隆介导的反应之潜能。相似地，嫁接了 ^Fv的含OVA蛋白质的SL可以刺激OVA特异性⑶4+和⑶8+T细胞；但是期待含有OVA中优势免疫CTL抗原决定簇SIINFEKL的SL只产生⑶8+T细胞反应。与这个相符合，我们的数据显示了嫁接的PMV靶向的DC产生了大约相等比例的CD4+和CD8+T细胞，而含SIINFEKL的SL靶向的DC比含OVA的那些更小程度地主要产生了⑶8+T细胞(图4B)。证据显示“危险”信号在Ag暴露后对于DC的成熟和迁移很重要，并且能够避免诱导对递呈的Ag的耐受性。9’1(1’18值得注意地，“危险”信号在体内Ag递呈试验中不是必需的 (图4)，推测是因为在分离过程中DC被“干扰”或激活。已知LPS和象GM-CSF和IFN-γ的细胞因子影响DC吸附Ag和成熟的能力。8’19_21所以对于动物研究，我们在PMV和SL之内掺入了 LPS、IFN- γ或GM-CSF，因而提供了同时递送Ag和危险信号至DC的方法。对嫁接了 kFv的PMV和含Ag的SL诱导DC以引发CTL反应的能力的检查揭示， 与对照细胞相比，来自用嫁接了 ^Fv的PMV或荷SL的抗原免疫的动物之T细胞在体外再刺激之后，体外展现了增加的裂解B16-0VA靶细胞的能力(图5)。重要地，结果显示了体内启动细胞裂解活性依赖于“危险”信号的存在，LPS和IFN-Y刺激了最大的反应(图5)。 异种OVA蛋白质和六组氨酸标记形式的SIINFEKL为了经由嫁接的kFv靶向而与SL相连。 因Ag递呈和CTL试验证明以这个方法将嫁接了 kFv的PMV和荷SL的Ag靶向DC能够有效刺激抗肿瘤反应，并且强调了“危险”信号诱导免疫反应的重要性(图4&5)。而且，嫁接了 ScFv的含SINFEKL-6H的SL能够诱导显著细胞毒性反应的发现，证明了使用含(NTA) 3_DTDA 的SL的方法是体内将任何His标记的肽Ag靶向DC的有效策略。这个工作中最最重要的发现是我们观察到用嫁接了 CDlldcFv和DEC-205-kFv 的PMV免疫的同种动物在用B16-0VA黑色素瘤攻击后与对照相比具有显著低数量的肺肿瘤转移。相似地，用嫁接了 SvFv含OVA的SL和LPS或IFN-γ免疫的同种动物具有更低数量的转移(图6)。结果进一步地显示肿瘤免疫完全依赖于”危险信号”、LPS和IFN- γ (图5 和6)。所以用嫁接了 CDl Ic-ScFv-和DEC-205-ScFv的PMV和荷SL的Ag免疫小鼠将相关 Ag靶向DC，然后DC处理和递呈Ags至T细胞诱导Ag特异性T细胞激活，并且在体内引发很强的B16-0VA肿瘤生长和转移的抑制。进一步有意义的发现是如下的事实不像所有都发展了严重肺转移的对照小鼠，已经接种嫁接了 DEC-205-ScFv的含IFN- y PMV的小鼠在用 B16-0VA肿瘤细胞攻击之后随后不显示任何迹象的肿瘤发展，指出DC靶向疫苗具有治疗活性。
这个研究特别引人的方面是抗B16-0VA黑素瘤的CTL活性的显著产生与肿瘤保护无关。这点在期待只产生抗B16-0VA肿瘤细胞产生的OVA的⑶8+CTL反应之SIINFEKL-SL 疫苗特别明显。尽管所述疫苗诱导很强的体外抗B16-0VA肿瘤细胞的回忆CTL反应，免疫并没有提供抗肿瘤的体内保护。已知B16-0VA黑色素瘤系表达非常低水平的I型MHC，因此对 CTL裂解有抗性，除非使用高活性CTL。14用DC靶向的PMV或SL制备物免疫的小鼠脾细胞在体外用肿瘤细胞刺激后能够裂解B16-0VA肿瘤细胞的事实暗示能够产生抗这个肿瘤细胞系的高亲合力的CTLs。推测，不能产生这样的CTL，或者这样的CTLs体内无效。事实上， 前面的研究指出⑶4+而不是⑶8+T细胞抗B16-0VA转移有效，有T辅助2 (Th2)细胞的细胞因子谱的CD4+细胞特别有效。14而且，要观察到肿瘤退化将嗜酸性细胞嗜酸细胞活化趋化因子依赖性地招募到肿瘤是必须的。14为了探查CD4+T细胞介导的嗜酸性细胞的招募在本研究中观察到的抗肿瘤效果中可能的作用，用嫁接了 ScFv的PMV免疫嗜酸细胞活化趋化因子敲除小鼠。我们的结果显示与对照相比，嗜酸细胞活化趋化因子敲除小鼠展现了显著降低的抑制B16-0VA肿瘤生长和转移的能力(图7A)。嗜酸细胞活化趋化因子是很强的嗜酸细胞趋化因子，所以，这些发现与将嗜酸细胞招募至肿瘤组成抗肿瘤反应重要部分相符合。与使用DC进行肿瘤免疫治疗的现行策略比，此处描述的修饰的PMV和SL系统提供了许多优点。首先，所述系统能体内直接递送Ags至DC，因而取消了从患者分离DC和为了用于免疫治疗体外操纵细胞的需要。其次，靶向或活性脂质体介导的Ag递送到DC具有同时递送更多Ag和/或一些不同Ags的潜能，很可能刺激更加有效的免疫反应。相同的方法很可能能递送任何Ag或免疫调节剂至DC，例如“危险”信号、RNA、DNA和细胞因子或它们的联合，这个通过使用融合于DC靶向蛋白质的Ags不能很容易地完成。9a°第三，所述方法是多用途的，将很方便地用于临床因为为了增强患者肿瘤免疫很可能拥有组氨酸标记的任何DC靶向蛋白质能被嫁接到修饰的PMV或SL以递送特异性肿瘤Ags或其它物质。在前面原型研究中已经广泛地描述了本发明及其特别应用，现在在此处使用的材料和方法之后将给出具体实施例。本领域技术人员将理解这些实施例只用于举例目的，在任何方面都不限制本发明的范围。材料和方法试剂[3H]-胸苷和 51Cr (Na51CrO4)得自 Amersham(Buckinghamshire，英国)。棕榈酰-油酰-磷脂酰胆碱(POPC)、OVAdI级，FPLC纯化的)、LPS (来自大肠杆菌血清型0111 :B4)、 Isopaque、Ficoll 和 β -巯基乙醇由 Sigma-Aldrich(Castle Hill, New South Wales，澳大利亚)供应。磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-2000 (PE-PEG2tlJ得自Avanti Polar Lipids公司(Alabaster)。2_(4，4_ 二氟-5-辛酰基 ~4~ 硼 _3a，4a_ 二氮杂-s-indacene-3-戊酰基)-1-十六酰基-sn-甘油3-磷酸胆碱(PC-B0DIPY)和5-(和-6) - 二乙酸羧基荧光素、琥珀酸酯、混合异构体(CFS^购自分子探针(Eugene，Oregon)。基本上如所述27合成由共价连接于两个双十四胺(DTDA)的三个次氮基三乙酸(NTA)首基组成的螯合-脂质(NTA)3-DTDA, 但是有额外的步骤将NTA基团共价偶联于NTA-DTDA的每个羧基基团以产生(NTA)3_DTDA。 对于缓冲液中所有Ni2+的加入使用NiS04。单克隆单体和蛋白质小鼠⑶56 (克隆42. 18，大鼠IgG^i)mAb来自第六届人NK细胞工场，鼠⑶3mAb (克隆 145-2C11，亚美尼亚仓鼠 IgG)购自 PharMingen (San Diego，California)。重组鼠 IFN-γ 和GM-CSF由P印roTech公司(Rockey Hill,New Jersey)提供。使用杆状病毒蛋白质表达系统产生重组^Fv抗体N418 (抗⑶lie)和NLDC145 (抗-DEC-205)，每个在羧基末端有六组氨酸(6H)标记并分别表示为CDlldcFv和DEC-205-kFv，并且如所述进行纯化。“5’28 肽由John Curtin医学研究学校(JCSMR)，ANU, Canberra生物分子资源实验室合成。常规地使用在血浆蛋白质富含组氨酸的糖蛋白质中发现的10个氨基酸序列L2肽(GHHPHGHHPH) 嫁接对照PMV和SL，因为它结合于有高亲合力的Ni- (NTA) 3_DTDA并能阻断其非特异性结合于细胞。使用代表H-2b小鼠OVA优势免疫CTL抗原决定簇(0VA残基257464)的有六组氨酸标记附着的肽SIINFEKL-6H而将肽Ag递送至DC。小鼠和细胞系6-8周龄的雌性或雄性C57BL6小鼠(H_2b)由动物培育公司(JCSMR，ANU)提供， C57BL6嗜酸细胞活化趋化因子敲除小鼠(H-2b)(嗜酸细胞活化趋化因子-/-)是生化和分子生物系(JCSMR)Paul !^ster博士的礼物，并用于获得用于体外试验和肿瘤生长体内研究的淋巴细胞。分泌OVA的肿瘤细胞系高转移鼠B16-0VA黑色素瘤[C57BL6 (H-2b)]培养在含有10%胎牛血清(FCS，Trace生物科学，诺贝尔公园，Victoria，澳大利亚)和0. 5mg/mL 遗传霉素Qnvitrogen)的RPMI1640培养基(Gibco-BRL，hvitrogen，墨尔本，澳大利亚) 中在37°C 5% CO2大气环境下。鼠胚胎皮肤树突细胞(FSDC) [C57BL6-DBA/2J Fl (H-2b/d)] 培养在相同的培养基中但是没有遗传霉素。如所述”分离和培养的鼠长期培养的树突细胞 (LTC-DC) [B10.A(2R) (H-2k/b)]是H. 0，Neill博士 (生化和分子生物学学院，ANU)的礼物。树突细胞和T细胞的分离从C57BL/6小鼠脾分离鼠DC和T细胞。简而言之，用胶原酶IV(Boerhringer Mannheim)消化分离脾细胞，接着使用Isopaque-Ficoll梯度的密度梯度离心分离低密度脾细胞。如所述31通过可塑性粘附分离DC，然后悬浮在含10%FCS、5X10_5M β-巯基乙醇、100IU/ml青霉素、ΙΟΟμ g/ml新霉素和IOmM HEPES的完全RPMI1640生长培养基。为了 T细胞的分离，脾脏分裂为单个细胞悬浮液，低张裂解去除红细胞后，使用尼龙绒毛柱分离 T细胞。32质膜囊泡和隐形脂质体蔗糖梯度离心制备培养细胞的PMV，3°并且基本如总结地进行修饰。“5’17如下制备用于修饰PMV的脂质体混合POPC, (NTA) 3-DTDA、LPS和PC-B0DIPY (摩尔比例 94 2 2 2)的乙醇溶液或 P0PC、(NTA)3-DTDA 和 PC-B0DIPY (摩尔比例 96 2 2)的乙醇溶液，N2气流下干燥，然后在含有60 μ M Ni2+的100 μ 1 PBS中再水化。在有指出的的地方，作为LPS的替代，再水化缓冲液中包括IFN- γ或GM-CSF (50ng)。使用T0SC0 IOOff超声粉碎机(测量和科学有限公司，伦敦，英国)在最大振幅对含水混合物进行超 声处理(三次，15秒)。加入15% PEG4qq和用PBS稀释10倍之前，脂质体(100 μ 1)与100 μ 1 B16-OVA 细胞来源的PMVaxiO8个细胞等同物)混合。用合适的ScFv嫁接之前，通过容量排除色谱纯化含(NTA)3-DTDA和细胞因子的PMV。17如下制备隐形脂质体(SL)溶于乙醇的POPC、(NTA)「DTDA、PE-PEG2000LPS 禾口 PC-B0DIPY (摩尔比例 96 1 1 1 1)或 POPC、(NTA) 3-DTDA、PE-PEG2000 禾口 PC-B0DIPY (摩尔比例97 1 1 1)在N2气流下干燥，然后在含有30 μ M Ni2+的100 μ 1 PBS中再水化(总脂质ImM)。对于缺乏LPS的混合物，IFN-γ或GM_CSF(50ng)包括在 PBS中。超声脂质混合物并纯化SL(如上)。对于功能性研究，所有脂质混合物中省略 PC-B0DIPY。试图将OVA蛋白质的优势免疫抗原决定簇SIINFEKL封装在SL内，但是很困难， 因为这个肽在用于生产SL并嫁接组氨酸标记的ScFv的pH(pH 7.4)有很低的溶解度。 然而，所述肽的六组氨酸标记形式SIINFEKL-6H允许有效的封装和/或所述肽嫁接到含 (NTA) 3-DTDA的SL上。使用FACS分析的结合研究显示嫁接了 CDl Ic-ScFv-或DEC-205-ScFv 的含SIINFEKL-6H的SL体外能够有效地靶向DC上的受体(未显示)。因而，在有指出的地方，包括SIINFEKL-eHOyM)同时与ScFv嫁接。将干燥的脂质混合物在含0. Img OVA (Img/ ml)的PBS中再水化接着短暂超声将OVA有效地封装在含POPC、(NTA)3-DTDA和PE_PEG2_ 的SL中。室温下与合适的ScFv (200 μ g/ml)孵育1小时嫁接含(NTA) 3_DTDA的PMV和SL。 如前所述地通过流式细胞仪评价嫁接的PMV和SL与DC的结合。17DC的体内靶向为了获得用于跟踪研究的高度荧光的PMV，PMV与异硫腈酸荧光素(FITC，分子探针)反应，与L2或ScFv嫁接，然后注射到小鼠后足垫。16小时后，收集每个动物的引流胭淋巴结并用于淋巴结细胞分离以在用生物素化⑶lie mAb和抗生物素蛋白链菌素-藻红蛋白(抗生物素蛋白链菌素-PE)染色后进行双色流式细胞仪分析或者用于共聚焦荧光成像。 为了成像，淋巴结在10%福尔马林中固定，然后石蜡包埋，切成切片；然后切片粘附到载玻片上并去除石蜡。载玻片与PBS加20%羊血清(PBS-羊血清)中的抗⑶Ilc的mAb N418 室温下孵育1小时之前，与PBS-羊血清室温孵育30分钟以阻断。然后水中彻底清洗切片， 用抗生物素蛋白链菌素_罗丹明在PBS-羊血清中染色。进一步清洗之后，使用Radiance 2000荧光共聚焦显微镜(Bio-Rad，Richmond，加利福尼亚)分析载玻片的荧光素和罗丹明荧光。用Kalman平均30个连续激光扫描获得图像，并使用Bio-Rad图像软件进行处理。抗原递呈试验在37°C完全培养基中DC与修饰的PMV或SL孵育4个小时，然后清洗以去除未结合的PMV或SL，Y-照射(5000拉德)，在生长培养基中分装到96孔平底平板(2 X IO4个细胞/200 μ 1/孔)。加入同种T细胞(2 X IO4个细胞)，通过测量[3H]-胸苷的掺入评价增生 14之前细胞共培养4天。通过如所述地33在与DC共培养之前用CFSE (5 μ Μ)标记T细胞评价Ag递呈试验中增生的⑶4+和⑶8+Τ细胞的比例。4天后，清洗共培养的细胞，用抗小鼠 CD4 (克隆 L3T4) -Cy-Chrome (10 μ g/ml)和抗小鼠 CD8 (克隆 Ly-2) -PE (10 μ g/ml)染色， 通过流式细胞仪分析CFSE、Cy-Chrome和PE荧光。细胞毒性试验
如描述的那些相似地进行細特异性CTL试验。34同种C57BL6小鼠静脉注射(i. v.) PBS (对照)或嫁接了 kFv的源于B16-0VA细胞的PMV或荷抗原的SL(如指出地)进行免疫。免疫14天后，取出脾脏，如上分离T淋巴细胞(效应T细胞)。然后T细胞悬浮于完全培养基并IX IO5个细胞/孔的浓度分装到M孔平底平板(ICN生物医学)中与IX IO5个 Y照射(5000拉德)的B16-0VA细胞共培养。共培养5天后，如所述地用标准51Cr释放试验评价T细胞的细胞裂解活性。“5动物免疫和体内肿瘤攻击每周i. v.尾静脉注射PBS (对照)或者都悬浮在200 μ 1体积PBS中嫁接了 kFv 的816-0￥々细胞来源的？1^0\105细胞等同物)或荷相关抗原( 0. 2yg OVA或 0. 8ng SIINFEKL-6H)的SL( 0. 16 μ g总脂质)免疫小鼠三次。最后一次注射两周后，静脉注射3X105个B16-0VA细胞攻击小鼠。在第16天，取出肺脏，在解剖显微镜下计数可见的肿瘤灶的数量。或者，在静脉注射1. 5X IO5个B16-0VA细胞3、6和9天后用嫁接了 kFv的 B16-0VA PMV免疫小鼠。实施例1体外和体内脂质体都能够用于将肿瘤抗原靶向DC两种类型的脂质体制备物用于将肿瘤Ag靶向DC(见下面图1)。第一个限定了肿瘤细胞来源的通过靶向DC的kFv的嫁接修饰的PMV粗制备物之用途，第二个是也嫁接了 DC靶向的kFv的含Ag隐形脂质体的制备物。隐形脂质体(SLs)是合成的脂质结构，它们通过包含例如PE-PE(i2_的脂质而立体稳定，并且由于它们逃脱网状内皮系统非特异性清除的能力，在它们静脉给予后它们能够保留在血循环中数天。14描述了螯合脂质NTA-DTDA 修饰肿瘤细胞和肿瘤细胞来源的PMV以用于T细胞共刺激分子的嫁接的用途。15’16最近我们生产了新型脂质，(NTA) 3"DTDA(图1A)，它与NTA-DTDA相关，但是通过获得更高局部密度的NTA首基，允许组氨酸标记的蛋白质更加稳定地锚定到PMV和SL上(未显示)。因而，脂质体经由(NTA)3-DTDA附着于组氨酸标记的抗DC标记物例如⑶Ilc和DEC-205的kFv允许脂质体有效地靶向DC (图1B)。为了确定这种方式制备的脂质体是否能用于将肿瘤抗原靶向DC，我们首先探究了这个系统体外将Ag靶向DC的能力。这个研究中，我们使用了高度转移的黑色素细胞系B16-0VA，因为这个细胞系分泌低水平的能用作替代分泌的肿瘤特异性Ag的OVA(参考文献17)，实现了 OVA特异性免疫反应的评价。B16-0VA肿瘤系大多对OVA特异性CTLs 有抗性，除非使用高亲合力的CTL。17能够修饰(B16-0VA来源的)PMV以通过与由P0PC、 (NTA)3-DTDA和PC-B0DIPY(摩尔比例96 2 2)组成的合成脂质的融合而含有掺入的 (NTA) 3-DTDA。并且，从合适的脂质混合物 POPC、PE-PEG2000, (NTA) 3_DTDA 和 PC-B0DIPY (摩尔比例96 :2:1: 1)生产含(NTA)3-DTDA的SL。能够制造含有OVA或OVA CTL抗原决定簇SIINFEKL的SLs制备物。含(NTA)3-DTDA的PMV和SLs与对照含六组氨酸的分子(L2 肽)或六组氨酸标记的抗⑶Ilc或DEC-205的kFv嫁接。因为修饰的膜也含有作为荧光追踪物的PC-B0DIPY，通过流式细胞仪能评价它们对DC的靶向。长时间培养的DC(LTC-DC)与对照修饰的PMV(PMV-L2)的孵育稍微增加了细胞的荧光强度(背景之上 2倍)，但是它们的荧光在与嫁接了⑶IldcFv(PMV-OTllc) 或DEC-205-kFv (PMV-DEC-205)的PMV孵育后比对照细胞高4_8倍(图2A)。与嫁接了CDlIc-ScFv 的 SL(SL-CDIIc)和嫁接了 DEC-205-ScFv 的 SL(SL-DEC-205)孵育的 LTC-DC 与对照细胞比也展现了显著增加的结合(3-6倍)(图2B)。相似地，与对照细胞相比，表达 ⑶Ilc的胚胎皮肤DC(FSDC)与嫁接了⑶llc-ScFv的PMV或SL孵育基本上导致了荧光的增加(未显示)。使用阻断mAbs能够测试嫁接了的PMV和SL的结合特性。因而，同型匹配的对照mAb与DC的预孵育没有显著降低嫁接了 CDllc-ScFv或DEC-205-ScFv的PMV或SL与 DC的结合，但是它们与抗⑶lie mAb N418或抗DEC-205mAb NLDC145的预孵育抑制 了各自嫁接了 ScFv的SL或PMV大约90%的结合(未显示)。这个证实了所述结合是嫁接的ScFv 特异性的。为了确立嫁接了 ScFv的PMV能够体内靶向DC，我们皮下注射荧光素标记的嫁接了 ScFv的PMV至小鼠后足垫，然后流式细胞仪检查了从引流胭淋巴结分离的细胞的荧光素荧光，或者在每个切片用CDllc mAb作为DC标记物PE染色后共聚焦扫描激光显微镜检查引流淋巴结的切片。通过FACS分析和荧光显微镜(图3A和B，图i、iii和ν)结果都显示小鼠注射嫁接了 L2、CDlIc-SCFV或DEC-205-ScFv的PMV导致了相对较小的淋巴细胞群 (2-2.5%)中高水平的⑶Ilc特异性荧光，因而鉴定它们是DC。重要地，与注射嫁接了 L2 的PMV的小鼠相比，注射嫁接了 ScFv的PMV的小鼠的淋巴结中观察到了 CDllc阳性细胞中更大的荧光素标记的细胞群( 1. 7% )(图3A和B，图iv和vi)。这些发现显示嫁接了 ScFv的PMV能够体内靶向DC。表1脂质体和修饰的质膜囊泡制备物
权利要求
1.一种通过抗原体内靶向于树突细胞调节免疫的组合物，所述组合物包含在其表面上具有多个金属螯合基团的含抗原膜囊泡或含抗原脂质体的制备物；以及所述树突细胞上受体的配体，所述配体经由所述配体上金属亲和标记连接于所述金属螯合基团；其中，所述含抗原囊泡或脂质体包括免疫调节因子。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述含抗原膜囊泡选自肿瘤衍生的质膜囊泡、淋巴细胞衍生的质膜囊泡、白细胞衍生的质膜囊泡以及细菌、原生动物、病毒或真菌的膜制备物。
3.根据权利要求1的组合物，其中所述含抗原脂质体是隐性脂质体。
4.根据权利要求1的组合物，其中所述含抗原的膜囊泡或脂质体的抗原包含多个不同抗原。
5.根据权利要求1的组合物，其中所述配体选自抗体、抗体片段和结构域抗体。
6.根据权利要求5的组合物，其中所述抗体片段是单链抗体片段。
7.根据权利要求1的组合物，其中所述配体上的所述金属亲和标记是六组氨酸。
8.根据权利要求1的组合物，其中所述免疫调节因子选自危险信号、细胞因子、趋化因子、激素或生长因子样分子以及编码前述任何分子的DNA。
9.根据权利要求8的组合物，其中所述危险信号是细菌脂多糖。
10.根据权利要求8的组合物，其中所述细胞因子选自干扰素-Y，白细胞介素-2、白细胞介素_4、白细胞介素-10、白细胞介素-12和转化生长因子-β。
11.制备通过抗原体内靶向于树突细胞调节免疫反应的组合物的方法，所述方法包含如下步骤i)制备含抗原膜囊泡或含抗原脂质体； )通过至少一种免疫调节因子的掺入修饰所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体；iii)进一步通过两性分子的掺入修饰所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体，其中所述两性分子包括当掺入在其中时处于所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体表面的螯合基团；以及iv)将步骤(iii)的产物与所述树突细胞上受体的配体接触，其中所述配体包括用于结合于所述螯合基团的金属亲和标记。
12.根据权利要求11的方法，其中步骤(i)中制备的所述含抗原膜囊泡选自肿瘤衍生的质膜囊泡、淋巴细胞衍生的质膜囊泡、白细胞衍生的质膜囊泡以及细菌、原生动物、病毒或真菌的膜制备物。
13.根据权利要求11的方法，其中步骤(i)中制备的所述含抗原脂质体是隐性脂质体。
14.根据权利要求11的方法，其中所述含抗原膜囊泡和含抗原脂质体的所述抗原选自蛋白质、糖蛋白、肽、多糖和编码前述任何分子的DNA。
15.根据权利要求11的方法，其中步骤(ii)中掺入的免疫调节因子选自危险信号、细胞因子、趋化因子、激素或生长因子样分子和编码前述任何分子的DNA。
16.根据权利要求15的方法，其中所述危险信号是细菌脂多糖。
17.根据权利要求15的方法，其中所述细胞因子选自干扰素-Y，白细胞介素_2、白细胞介素_4、白细胞介素-10、白细胞介素-12和转化生长因子-β。
18.根据权利要求11的方法，其中步骤(iii)中掺入的所述两性分子选自次氮基三乙酸双十四胺、三(次氮基三乙酸)双十四胺或次氮基三乙酸磷脂酰乙醇胺。
19.根据权利要求11的方法，其中与步骤(iii)的产物接触的所述配体选自抗体、抗体片段和结构域抗体。
20.根据权利要求19的方法，其中所述抗体片段是单链抗体片段。
21.根据权利要求11的方法，其中所述配体是选自⑶11c、DEC-205(⑶205)、 DC-SIGN(CD209)、CD206 和 CD207 的受体的配体。
22.根据权利要求11的方法，其中所述配体上的所述金属亲和标记是六组氨酸。
23.调节受试者免疫反应的方法，所述方法包括给予所述受试者根据权利要求1的组合物。
24.根据权利要求23的方法，其中所述免疫反应的调节是为了移植排斥或自身免疫疾病的预防或治疗。
25.根据权利要求24的方法，其中所述自身免疫疾病是I型糖尿病、类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮或多发性硬化症。
26.预防或治疗受试者肿瘤的方法，所述方法包括给予受试者根据权利要求1的组合物，其中包含在所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体中的所述抗原是肿瘤抗原。
27.根据权利要求26的方法，其中所述肿瘤是黑色素瘤或者前列腺、肠、乳腺或肺的癌症。
28.预防或治疗受试者感染的方法，所述方法包括给予受试者根据第一个实施方案的组合物，其中包含在所述含抗原膜囊泡或含抗原脂质体中的所述抗原是来自造成感染的物质的抗原。
29.根据权利要求28的方法，其中所述感染的致病物质是细菌、分枝杆菌、病毒或真菌。
30.根据权利要求23至29任一项的方法，其中所述受试者是人受试者。
全文摘要
本发明提供了通过抗原体内靶向于树突细胞调节免疫的组合物。组合物包含在其上具有多个金属螯合基团的含抗原膜囊泡或含抗原脂质体的制备物；以及树突细胞上受体的配体，经由配体上金属亲和标记连接于金属螯合基团的配体。组合物进一步包含免疫调节因子。也提供制备组合物的方法。本发明进一步提供了调节免疫紊乱的方法和治疗肿瘤和感染的方法。
文档编号A61P37/02GK102172397SQ20111005029
公开日2011年9月7日 申请日期2004年8月23日 优先权日2003年8月21日
发明者C·R·帕里什, J·奥尔廷 申请人:利普泰克有限公司