专利名称：肺癌细胞特异靶向多肽、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种癌细胞靶向性多肽及其制备方法和应用，尤其涉及一种对肺癌细胞具有特异靶向性的多肽及其制备方法和应用，属于生物、医药技术领域。
背景技术：
肺癌是全球高发肿瘤之一，据统计肺癌已经超过肝癌成为我国首位恶性肿瘤死亡原因，占全部恶性肿瘤死亡的22. 7%，且发病率和死亡率仍在继续迅速上升。现代医学对肺癌科学研究已经取得了不少进展，但是肺癌的早期诊断和有效治疗仍然是诊断治疗过程中的难题。如何能提高早期诊断的灵敏度和治疗的精准性，成为肺癌治疗研究的目标。近些年出现的分子靶向治疗技术以其低剂量、高效率、低毒副反应的特点，逐渐成为癌症药物治疗的新方向。分子靶向治疗指以癌症相关的特异性分子或者表达异常的分子为靶点，将药物、抗体等有效成分靶向定位于癌细胞及相关成分并进行清除，从而达到癌症诊断及治疗的目的，而实现该目标的关键是要得到特异性的靶向分子。近年来出现的表面展示技术为确定癌细胞表面靶点提供了新的思路。表面展示技术是利用基因工程手段实现外源肽段(或蛋白质结构域)以融合蛋白形式在微生物表面进行展示的新型基因工程技术，被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性。应用较多的展示技术有噬菌体展示、细菌表面展示、酵母展示和体外的核糖体展示等。细菌表面展示技术结合流式细胞分选技术以快速、高通量的特点成为展示技术领域中应用的热点，虽然国内外的研究者对肺癌的靶向研究正在不断深入，但到目前为止国内外尚未见可以特异性靶向肺癌细胞的靶向分子及特异性检测肺癌细胞方法的报道。
发明内容
本发明的目的之一在于提出一种肺癌细胞特异靶向多肽，以克服现有技术中的不足。为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案
一种肺癌细胞特异靶向多肽，其特征在于它具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。本发明的另一目的在于提供一种肺癌细胞特异靶向多肽的制备方法，该方法是通过细菌随机多肽库体外展示方法和流式细胞分选方法在人肺癌细胞表面筛选出与人肺癌细胞特异性结合的目标产物。本发明的又一目的在于提供前述肺癌细胞特异靶向多肽在制备肺癌诊断、跟踪试剂中的应用。本发明采用细菌随机多肽库体外展示技术和流式细胞分选技术在人肺癌细胞 A549细胞表面筛选出与肺癌细胞特异性结合的靶向多肽，经基因测序及体外细胞结合实验鉴定后，得到与肺癌细胞A549细胞特异性结合的13肽，具有如SEQ ID NO. 1所示的序列， 命名为“A-13A-1肽”。与现有技术相比，本发明的优点至少在于该A-13A-1肽可与肺癌细胞A549细胞特异性结合，而对肝癌、乳腺癌、宫颈癌等的肿瘤细胞无特异性结合作用；该A-13A-1肽与正常肺成纤维细胞HLF细胞无特异性结合，显示出多肽对肺癌肿瘤细胞的特异性选择。同时，该A-13A-1肽的制备方法简单易行，适于规模化工业生产。本发明为肺癌的早期诊断、 靶向治疗等提供了重要的理论和实践基础，具有广阔的应用前景。
图Ia-Ig是表达A-13A-1肽细菌与A549细胞、HLF细胞、H460细胞、HeLa细胞、 MCF-7细胞、!fep2细胞和HepG2细胞特异性结合能力鉴定结果的细胞实验流式分析图，图中 P4代表同细菌结合的细胞的比例；
图2a-2g是表达A-13A-1肽细菌特异性结合鉴定结果的荧光照片，其中 图加表面展示A-13A-1肽的细菌和A549细胞孵育后的荧光图片(绿色荧光代表了细菌)(200 X)；
图2b 表面展示CPX的细菌和A549细胞孵育后的荧光图片(绿色荧光代表了细菌) (200X)；
图2b:表面展示A-13A-1肽的细菌和HLF细胞孵育后的荧光图片(绿色荧光代表了细菌)(200 X)；
图2d:表面展示A-13A-1肽的细菌和H460细胞孵育后的荧光图片(绿色荧光代表了细菌)(200 X)；
图加表面展示A-13A-1肽的细菌和HeLa细胞孵育后的荧光图片(绿色荧光代表了细菌)(200 X)；
图2f 表面展示A-13A-1肽的细菌和HepG2细胞孵育后的荧光图片(绿色荧光代表了细菌)QOO X)；
图2g:表面展示A-13A-1肽的细菌和MCF-7细胞孵育后的荧光图片(绿色荧光代表了细菌)Q00X)。
具体实施例方式以下结合附图及一较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。本实施例的A-13A-1肽是通过下述步骤筛选得到的 1)细菌随机多肽库体外筛选
细菌随机多肽库复苏，至少取库容量10倍的菌量于LB培养基中，37°C下扩大生长，用 0. 02%(m/v) arabinose室温1小时诱导细菌，按细菌细胞为100 1的比例和肺成纤维细胞HLF细胞孵育，4°C，30min,离心lOOOrpm，4°C，5min,取上清和同样数量的肺癌细胞A549 细胞孵育，4°C，30min,离心lOOOrpm, 4°C，5min, 3遍，弃上清，PBS ( ρΗ7· 4)重悬，流式细胞术分析其结合情况，分选出结合有细菌的细胞，将分选出来的细胞置于细菌培养基中过夜培养，扩增有特异性结合的细菌，重复以上的体外筛选步骤10次左右，得到50个左右特异的细菌克隆。前述细菌随机多肽库来自美国加州大学圣巴巴拉分校化学工程系Patrick S. Daugherty实验室。其详细构建过程是对OmpX (outer membrane protein X)基因序列进行改造，使其第2个loop上的s53及站4残基之间断开，形成游离于胞外C00H端和NH2端，成为 CPX (circularly permuted outer membrane protein OmpX)。之后将随机合成的X2CX7CX2的多肽编码序列连接到CPX序列中，使其表达于CPX的胞外的NH2端，将改造后的CPX片段连接到pBAD33 (参考文献1)质粒中alajGFPl (参考文献2)下游的多克隆位点上，改造后的PBAD33质粒可以利用araBAD启动子来控制CPX及表面展示多肽的表达。 改造后的PBAD33质粒转化入大肠杆菌MC1061菌株，就可以利用阿拉伯糖(arabinose)控制CPX及随机多肽在细菌表面的展示(参考文献3)。多肽测序鉴定将结合特异性最高的单克隆细菌扩大培养，送测序公司(上海生工生物有限公司)，得到细菌表面展示13肽序列，其中A-13A-1肽(序列“WFCSWYGGDTCVQ”)出现频率为60%。2)单克隆细菌结合细胞实验流式细胞仪检测
按步骤1)所述方法将特异性单克隆细菌培养、诱导，并按比例分别和肺成纤维细胞 HLF细胞及肺癌A549细胞共孵育，4°C，30min,离心lOOOrpm，4°C，5min,两遍，弃上清，PBS ( PH7.4)重悬，流式细胞术分析其结合情况，结果如图Ia-Ig所示。3)单克隆细胞结合细胞实验荧光显微镜检测
按步骤1)所述方法将特异性单克隆细菌培养(LB培养基，37°C)、诱导，并按100:1比例与肺成纤维细胞HLF细胞、A549细胞、H460细胞、HeLa细胞、!fepG-2细胞、MCF-7细胞共孵育，室温，30min，PBS( pH7. 4)冲洗三遍，置于荧光显微镜下观察细菌结合情况，结果如图 2a-2g所示。因此，由前述实验可以证实，本发明的A-13A-1肽具有如下特性
(1)能与肺癌细胞A549细胞特异性结合，而对正常肺成纤维细胞HLF细胞、肝癌、乳腺癌、宫颈癌等肿瘤细胞无特异性结合作用，即，能实现对肺癌肿瘤细胞的特异性选择，展示出良好靶向作用。(2)不但具有抗体的特异性结合优势，同时还有分子量小、免疫反应弱，更易穿透细胞膜等特点，在肺癌的早期诊断及靶向治疗中具有巨大的潜在应用价值。(3)该A-13A-1肽的制备方法操作简单，易于实施，利于进行大规模工业化生产。前述参考文献的具体信息如下
参考文献 1 Guzman, L. et al·, "Tight Regulation, Modulation, and High-Level Expression by Vectors Containing the Arabinose PBAD Promoter，，，J. Bacteriol., 1995，177，p4121 - 4130。参考文献 2 Bessette, P. H. et al. ,"Rapid isolation of high-affinity protein binding peptides using bacterial display",Protein Eng. Des. Sel.,2004, 17， p731-739。参考文献3 Dane, K. Y. et al. ,"Isolation of cell specific peptide ligands using fluorescent bacterial display libraries", J. Immunol Methods. , ,2006, 309，pl20-129。
权利要求
1.一种肺癌细胞特异靶向多肽，其特征在于它具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述肺癌细胞特异靶向多肽的制备方法，其特征在于，该方法是通过细菌随机多肽库体外展示方法和流式细胞分选方法在人肺癌细胞表面筛选出与人肺癌细胞特异性结合的目标产物。
3.如权利要求2所述肺癌细胞特异靶向多肽的制备方法，其特征在于，所述细菌随机多肽库体外展示方法为通过分子克隆技术将随机基因序列构建入质粒，将质粒转染进入细菌，体外诱导，在细菌表面展示随机序列的多肽；所述细菌包括大肠埃希氏菌(E. coli) MC1061 ； 所述质粒包括PBAD33。
4.如权利要求1所述肺癌细胞特异靶向多肽在制备诊断肺癌示踪制剂中的应用。
5.如权利要求1所述肺癌细胞特异靶向多肽在制备肺癌细胞检测试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种肺癌细胞特异靶向多肽、其制备方法及应用。该肺癌细胞特异靶向多肽具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，它是通过细菌随机多肽库体外展示方法和流式细胞分选方法在人肺癌细胞表面筛选制备的。该肺癌细胞特异靶向多肽可在制备诊断肺癌示踪制剂、肺癌细胞检测试剂等之中应用。本发明的肺癌细胞特异靶向多肽可以特异性结合肺癌A549细胞，而不与正常的肺细胞及其他肿瘤细胞结合，同时，其制备方法简单易行，适于规模化工业生产。本发明为肺癌早期诊断、靶向治疗等提供了重要的理论和实践基础，具有广阔的应用前景。
文档编号G01N33/68GK102382175SQ201110340669
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月2日 优先权日2011年11月2日
发明者朱毅敏, 董兵 申请人:中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所