配合淋巴细胞培养基快速诱导大量cik细胞的试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种诱导CIK细胞的试剂盒及其使用方法，尤其是一种配合淋巴细胞培养基快速诱导大量CIK细胞的试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002]当前免疫细胞因其高效的肿瘤细胞杀伤活性，其无任何副作用的优势已经逐渐被医学界认可。CIK(Cytokine induced killer)细胞作为免疫细胞中最具代表性的一种细胞，其诱导和扩增的方法各不相同，且诱导出的细胞数量和质量也参差不齐。没有一套简单、高效、稳定的诱导试剂盒。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是，提供一套简单、高效、稳定的配合淋巴细胞培养基快速诱导大量CIK细胞的试剂盒及其使用方法。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:一种配合淋巴细胞培养基快速诱导大量CIK细胞的试剂盒，包括20ug干粉A、40ug干粉B、120ug干粉C及6ml溶液D，按质量百分比，各种组分的成分如下:
[0005]干粉A:10%-30%CD3单抗、10%-20%干扰素_伽马、60%-80%白细胞介素_2；
[0006]干粉B:5%-10%CD3单抗、20%-30%CD28单抗、60%-75%白细胞介素_2；
[0007]干粉C:100%白细胞介素-2;
[0008]溶液D: 20 %人血白蛋白、0.72 %氯化钠、79.28 %注射用水。
[0009]优选，按质量百分比，干粉A:20 %⑶3单抗、20 %干扰素_伽马、60%白细胞介素_2;干粉B: 20 %⑶3单抗、20 %⑶28单抗、60 %白细胞介素_2。
[0010]上述的配合淋巴细胞培养基快速诱导出大量CIK细胞的试剂盒的使用方法，包括以下步骤:
[0011 ] (I)使用10毫升淋巴细胞培养基充分溶解试剂盒中的干粉A，并利用0.22微米孔径的滤膜过滤溶液，在两个T-175培养瓶中分别加入4.5毫升过滤后的溶液，在CO2培养箱中孵育2小时；
[0012](2)分离获得1*108的外周血单个核细胞，重悬于200毫升淋巴细胞培养基中，将重悬的细胞平均接种至2个细胞培养瓶中；
[0013 ] (4)将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养；
[0014](4)培养的第三天，使用试剂盒中的溶液D充分溶解干粉C，并利用0.22微米孔径的滤膜过滤溶液;在两个培养瓶中分别加入100微升的干粉C溶解液，并将剩余的溶解液保存在2-8°C的环境下；
[0015](5)培养的第5天，在两个细胞培养瓶中分别加入10ml新鲜的淋巴细胞培养基，并加入100微升干粉C溶解液后继续培养；
[0016](6)培养的第7天，将全部的细胞培养液及细胞转移到1.8-2升容积的细胞培养袋中，并补加200毫升的新鲜淋巴细胞培养基；
[0017](7)取4.5毫升的淋巴细胞培养基溶解干粉B，并利用0.22微米孔径的滤膜过滤溶液，在两个培养袋中分别加入2毫升过滤后的溶液；
[0018](8)培养的第9天，在两个细胞培养袋中分别加入400ml新鲜的淋巴细胞培养基，并加入400微升干粉C溶解液后继续培养；
[0019](9)培养的第11天，在两个细胞培养袋中分别加入800ml新鲜的淋巴细胞培养基，并加入800微升干粉C溶解液后继续培养；
[0020](10)培养的第14天，回收两个培养袋中全部的3200毫升的细胞培养液;离心并回收细胞，计算细胞总数并通过流式细胞检测方法确定其中CIK细胞的比例。
[0021]所述步骤(10)中，所述CIK细胞的比例是指CD3+CD56+的比例。
[0022]本发明的有益效果是:能够稳定的获得一定数量和质量的CIK细胞，细胞总量在5*19以上的淋巴细胞，其中CIK细胞(⑶3+⑶56+)比例达到25 %以上。
【附图说明】
[0023]图1是本发明试剂盒诱导的CIK细胞；
[0024]图2是CIK细胞流式检测结果。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明:
[0026]本发明的配合淋巴细胞培养基快速诱导大量CIK细胞的试剂盒，包括20ug干粉A、40ug干粉B、120ug干粉C及6ml溶液D，按质量百分比，各种组分的成分如下:
[0027]干粉A:10%-30%CD3单抗、10%-20%干扰素_伽马、60%-80%白细胞介素_2；
[0028]干粉B:5%-10%CD3单抗、20%-30%CD28单抗、60%-75%白细胞介素_2；
[0029]干粉C: 100%白细胞介素-2;
[0030]溶液D: 20 %人血白蛋白、0.72 %氯化钠、79.28 %注射用水。
[0031]优选，按质量百分比，干粉A:20%⑶3单抗、20%干扰素-伽马、60%白细胞介素-2;干粉B: 20 %⑶3单抗、20 %⑶28单抗、60 %白细胞介素_2。
[0032]上述的配合淋巴细胞培养基快速诱导出大量CIK细胞的试剂盒的使用方法，包括以下步骤:
[0033](I)使用10毫升淋巴细胞培养基充分溶解试剂盒中的干粉A，并利用0.22微米孔径的滤膜过滤溶液，在两个T-175培养瓶中分别加入4.5毫升过滤后的溶液，在CO2培养箱中孵育2小时；
[0034](2)分离获得1*108的外周血单个核细胞，重悬于200毫升淋巴细胞培养基中，将重悬的细胞平均接种至2个细胞培养瓶中；
[0035](5)将细胞培养液混合均匀后放置在二氧化碳培养箱中培养；
[0036](4)培养的第三天，使用试剂盒中的溶液D充分溶解干粉C，并利用0.22微米孔径的滤膜过滤溶液;在两个培养瓶中分别加入100微升的干粉C溶解液，并将剩余的溶解液保存在2_8°C的环境下；
[0037](5)培养的第5天，在两个细胞培养瓶中分别加入10ml新鲜的淋巴细胞培养基，并加入100微升干粉C溶解液后继续培养；
[0038](6)培养的第7天，将全部的细胞培养液及细胞转移到1.8-2升容积的细胞培养袋中，并补加200毫升的新鲜淋巴细胞培养基；
[0039](7)取4.5毫升的淋巴细胞培养基溶解干粉B，并利用0.22微米孔径的滤膜过滤溶液，在两个培养袋中分别加入2毫升过滤后的溶液；
[0040](8)培养的第9天，在两个细胞培养袋中分别加入400ml新鲜的淋巴细胞培养基，并加入400微升干粉C溶解液后继续培养；
[0041](9)培养的第11天，在两个细胞培养袋中分别加入800ml新鲜的淋巴细胞培养基，并加入800微升干粉C溶解液后继续培养；
[0042](10)培养的第14天，回收两个培养袋中全部的3200毫升的细胞培养液;离心并回收细胞，计算细胞总数并通过流式细胞检测方法确定其中CIK细胞的比例。
[0043]所述步骤(10)中，所述CIK细胞的比例是指⑶3+⑶56+的比例。
[0044]实施例1
[0045]如图1、2所示，本发明的CIK细胞的试剂盒，包括20ug干粉A、