测到CYP2C19*1/*1基因型231例，CYP2C19*1/巧基 因型164例，CYP2C19巧/*2基因型41例，CYP2C19*l/*3基因型26例，CYP2C19巧/*3基因型13 例，CYP2C19*3/*3基因型2例。本发明试剂盒检测477例基因样本和金标准测序结果对比，检 测结果一致，漏检0例，准确性为100%;对非本试剂盒检测范围的其他基因型阳性和阴性样 本，本试剂盒检测结果均为阴性，灵敏度为100%，特异性为100%。
[0114] W上所述仅为本发明的实施例，并非限制本发明的保护范围，凡是利用本发明说 明书及附图内容所作的等效实施方式，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种用于检测CYP2C19基因分型的引物对，所述引物对包括用于扩增CYP2C19*2基因 的特异性引物对和/或用于扩增CYP2C19*3基因的特异性引物对； 其中，所述用于扩增CYP2C19*2基因的特异性引物对包括一条正向引物CYP2C19*2-F和 一条反向引物CYP2C19*2-R，所述正向引物CYP2C19*2-F具有序列表中SEQ ID N0:1所示的 核苷酸序列，所述反向引物CYP2C19*2-R具有序列表中的SEQIDN0:2所示的核苷酸序列； 所述用于扩增CYP2C19*3基因的特异性引物对包括一条正向引物CYP2C19*3-F和一条 反向引物CYP2C19*3-R，所述正向引物CYP2C19*3-F具有序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷 酸序列，所述反向引物CYP2C19*3-R具有序列表中的SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列。2. -种用于检测CYP2C19基因分型的荧光探针，包括用于检测CYP2C19*2基因的荧光探 针CYP2C19*2-P和/或用于检测CYP2C19*3基因的荧光探针CYP2C19*3-P; 其中，所述荧光探针CYP2C19*2-P具有序列表中的SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列； 所述荧光探针CYP2C19*3-P具有序列表中的SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列； 所述荧光探针为在5'末端区域具有荧光基团，在3'末端区域具有淬灭基团的双标记探 针。3. 如权利要求2所述的荧光探针，其特征在于：当所述荧光探针同时包括用于检测 CYP2C19*2基因的荧光探针CYP2C19*2-P和用于检测CYP2C19*3基因的荧光探针CYP2C19*3-P时，5'末端区域具有不同的荧光基团。4. 一种用于检测CYP2C19基因分型的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1所述引物对 以及如权利要求2或3所述的荧光探针。5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR缓冲液、阴性对照 品、阳性对照品、核酸DNA提取试剂、PCR反应所需的Taq聚合酶、dNTP中的一种或多种。6. -种用于检测CYP2C19基因分型的PCR试剂，所述PCR试剂包括如权利要求1所述的引 物对、如权利要求2或3所述的荧光探针以及PCR缓冲液。7. 如权利要求6所述的PCR试剂，其特征在于:所述引物对中各引物和所述探针在PCR试 剂中的浓度为:正向引物CYP2C19*2-F和/或正向引物CYP2C19*3-F的终浓度为0.08-0.15μ Μ，反向引物CYP2C19*2-R和/或反向引物CYP2C19*3-R的终浓度为0.72-1.55μΜ，和/或，焚光 探针CYP2C19*2-P和/或荧光探针CYP2C19*3-P的终浓度为0.12-0.25μΜ。8. -种非疾病治疗和诊断目的的检测CYP2C19基因分型的方法，包括如下步骤： (1) 提供用于扩增CYP2C19*2基因的特异性引物对和/或用于扩增CYP2C19*3的特异性 引物对； 其中，所述用于扩增CYP2C19*2基因的特异性引物对包括一条正向引物CYP2C19*2-F和 一条反向引物CYP2C19*2-R，所述正向引物CYP2C19*2-F具有序列表中SEQ ID ΝΟ:1所示的 核苷酸序列，所述反向引物CYP2C19*2-R具有序列表中的SEQIDNO:2所示的核苷酸序列； 所述用于扩增CYP2C19*3基因的特异性引物对包括一条正向引物CYP2C19*3-F和一条 反向引物CYP2C19*3-R，所述正向引物CYP2C19*3-F具有序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷 酸序列，所述反向引物CYP2C19*3-R具有序列表中的SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列； (2) 提供用于检测CYP2C19*2基因的荧光探针CYP2C19*2-P和/或用于检测CYP2C19*3基 因的荧光探针CYP2C19*3-P; 其中，所述荧光探针CYP2C19*2-P具有序列表中的SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列； 所述荧光探针CYP2C19*3-P具有序列表中的SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列； 所述荧光探针为在5'末端区域具有荧光基团，在3'末端区域具有淬灭基团的双标记探 针； (3)加入待检测样品和步骤（1)所述的引物对及步骤(2)所述的荧光探针进行荧光PCR 扩增反应，对PCR产物进行熔解曲线分析，通过有无特定的熔解峰来判断样品的基因型。9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述荧光PCR扩增反应的条件为：37°C1~ lOmin，90 ~95°C3 ~lOmin，95°C10 ~20s，59 ~68°C40 ~60s，30 ~40 个循环；所述熔解曲线 分析的条件为:95°C10s，40°Clmin，80°C10s。10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于:所述引物对包括用于扩增CYP2C 19*2基因的 特异性引物对和用于扩增CYP2C19*3的特异性引物对，所述荧光探针同时包括用于检测 CYP2C19*2基因的荧光探针CYP2C19*2-P和用于检测CYP2C19*3基因的荧光探针CYP2C19*3-P;CYP2C19基因分型结果判定的具体方法为： (1) 样本检测熔解曲线中，如果在一个荧光通道内出现一个熔解峰，且Tm值在47.5-52 °C之间，在另一个荧光通道内出现一个熔解峰，且Tm值在46-48.8°C之间，样本基因型判断 为CYP2C19*1/*1; (2) 样本检测熔解曲线中，如果在一个荧光通道内出现两个熔解峰，且Tm值分别在 47.5- 52°C之间和55.9-59.3°C之间，在另一个荧光通道内出现一个熔解峰，且Tm值在46-48.8°C之间，样本基因型判断为CYP2C19*l/*2; (3) 样本检测熔解曲线中，如果在一个荧光通道内出现一个熔解峰，且Tm值在55.9-59.3°C之间，在另一个荧光通道出现一个熔解峰，且Tm值在46-48.8°C之间，样本基因型判 断为 CYP2C19*2/*2; (4) 样本检测熔解曲线中，如果在一个荧光通道内出现一个熔解峰，且Tm值在47.5-52 °C之间，在另一个荧光通道内出现两个熔解峰，且Tm值分别在46-48.8°C之间与56.8-60.3 °C之间，样本基因型判断为CYP2C19*l/*3; (5) 样本检测熔解曲线中，如果在一个荧光通道内出现一个熔解峰，且Tm值在47.5-52 °C之间，在另一个荧光通道内出现一个熔解峰，且Tm值在56.8-60.3°C之间，样本基因型判 断为 CYP2C19*3/*3; (6) 样本检测熔解曲线中，如果在一个荧光通道内出现两个熔解峰，且Tm值分别在 47.5- 52°C之间与55.9-59.3°C之间，在另一个荧光通道内出现两个熔解峰，Tm值分别在46-48.8°C与56.8-60.3°C之间，样本基因型判断为CYP2C19*2/*3。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测CYP2C19基因分型的试剂盒，通过设计特异性引物对和荧光探针来检测CYP2C19基因的CYP2C19*2(681G/A)和CYP2C19*3(636G/A)等位基因分型。本发明采用不对称PCR与荧光探针熔解曲线分析技术相结合，通过特定温度的熔解峰来判断不同基因型，可在单管PCR反应中实现与CYP2C19*2、CYP2C19*3相关的6种基因分型检测，无需后续处理，最大限度避免了反应产物污染的可能性，且操作简单、耗时短、特异性好、准确率高，结果易判读。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105506118
【申请号】CN201610011520
【发明人】杨海艳, 冯东, 沈东艳, 戈斌
【申请人】智海生物工程（北京）股份有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月8日