Gls在制备肝癌诊断和预后评估试剂盒中的应用
【专利说明】GLS在制备肝癌诊断和预后评估试剂盒中的应用 所属技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种GLS1和GLS2蛋白的应用，具体地说，涉及 GLS1和GLS2蛋白在制备肝癌诊断和预后评估试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002] 肝细胞癌（肝癌）是我国常见的恶性肿瘤。治疗仍以手术为主，但临床上90%的 肝癌患者在被诊断为肝癌的时候，已经失去手术机会。而且，肝切除术后5年内复发率高达 80%，长期存活率仍然不高。早期诊断是提高术后生存期的最重要的策略。因此，肝癌急需 早期诊断和转移复发预测的标记物，提高肝癌的诊断率、手术率、和长期生存时间。
[0003] 血清甲胎蛋白AFP升高与肿瘤复发相关，但约有40%的患者AFP为阴性，且与预后 无正相关。迄今为止，尚无确定的蛋白标记能够较准确地诊断或预示肿瘤复发转移，也没有 评价肝癌预后的指标。因此本领域迫切需要寻找能协助肝癌早期诊断和预测肝癌病情及预 后的相关基因和/或蛋白，这方面的研究对临床治疗肝癌及预防肿瘤复发具有重要意义。
[0004] 肿瘤细胞为适应其快速增殖的需要对其新陈代谢过程重编程产生了两个重要代 谢途径-有氧糖酵解（Aerobic Glycolysis)和谷氨酰胺酵解（Glutaminolysis)。肿瘤 细胞即使在氧充足的条件下也将大部分的葡萄糖转化为乳酸，为其快速增殖提供充足的能 量。但这也使得进入三羧酸循环（TCAcycle)的丙酮酸比例减少，致使细胞合成代谢的原料 和中间产物不充足。为了弥补这种不足，肿瘤细胞产生了一个替代途径来补充这些中间产 物，也就是谷氨酰胺酵解（Glutaminolysis)。谷氨酰胺由谷氨酰胺酶（Glutaminase，GLS) 水解转变成谷氨酸，并且进一步被谷氨酸脱氢酶（Glutamatedehydrogenase,⑶Η)催化产 生α -酮戊二酸（α -ketoglutarate,a-KG)，进入三羧酸循环（TCAcycle)，进而维持细胞 代谢中间产物的充足，从而形成一个以谷氨酰胺为原料进入三羧酸循环的补充代谢流，称 之为谷氨酰胺酵解。谷氨酰胺酶（Glutaminase，GLS)是谷氨酰胺酵解过程的关键限速酶， 已有研究表明靶向GLS能够有效的杀伤肿瘤细胞。
[0005] 在人类细胞中有两种类型的谷氨酰胺酶，即由2号染色体编码的GLS1和由12号 染色体编码的GLS2。GLS1最早发现于肾脏（kidney-type)，随后发现也表达在肿瘤细胞中， 如人类B淋巴细胞瘤，乳腺癌，胰腺癌，胶质细胞瘤等肿瘤细胞中GLS1表达量或活性和正常 组织相比明显增加，在大鼠和人肝癌（小样本）中也较正常肝细胞高。GLS1基因编码的蛋 白有GAC(GlutaminaseC)，KGA(kidneyGlutaminaseisoform)等；GLS2 是 2010 年发现的 一种肝型（liver-type)的肿瘤抑制因子。研究发现，GLS2在肝癌组织中的表达量明显低 于正常肝组织。
[0006] 我们前期临床研究发现：在450例肝癌组织和200例其它肝疾病组织中，GLS1在 450例肝癌组织中的阳性率高90 %，诊断肝癌的敏感性高达87. 2 %，特异性高达74. 86 % ; 有趣的是，GLS2的表达呈现出与GLS1表达完全相反的趋势。进一步我们追踪了 90例患者 发现，GLS1表达水平与患者的复发和预后相关，即GLS1高表达患者生存时间显著缩短。上 述研究结果提示，谷氨酰胺酶GLS1和GLS2可能是一种潜在的肝癌生物标记。
[0007]目前，世界上尚未有将谷氨酰胺酶GLS1和GLS2作为肝细胞癌的生物标记的报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供GLS1和GLS2蛋白和基因的新应用，特别是在制备肝癌诊 断和预后评估试剂盒中的应用。
[0009] 本发明提供一种基于GLS1/GLS2蛋白表达检测、GLS1/GLS2mRNA表达检测的肝癌 早期诊断方法和应用。该方法和应用主要包括：
[0010] (1)提供诊断试剂盒临床检测所需的试剂以及可靠操作流程。
[0011] (2)临床可疑肝癌病例采取本诊断试剂盒检测，进行诊断和预后评估。
[0012] (3)提供一种基于GLS1和GLS2蛋白表达检测、GLS1和GLS2mRNA表达检测的肝 癌早期诊断标准。
[0013] (4)扩大样本量验证肝癌和其他肝脏疾病组织中GLS1和GLS2蛋白免疫组织化学 检测、GLS1和GLS2mRNA荧光定量PCR检测的情况。
[0014] (5)选择高敏感性GLS1和GLS2抗体、GLS1和GLS2弓丨物。
[0015] 本发明包括用于肝癌诊断的GLS1免疫组织化学检测试剂盒，GLS1和GLS2免疫组 织化学检测试剂盒，GLS1荧光定量PCR检测试剂盒，GLS1和GLS2荧光定量PCR检测试剂 盒。
[0016] 本发明试剂盒提供一种GLS1和GLS2免疫组织化学检测的方法。本发明试剂盒提 供一种GLS1和GLS2免疫组化检测诊断肝细胞肝癌的标准。本发明试剂盒包括试剂A，试剂 B，试剂C，试剂D，试剂E和试剂F。
[0017] 本发明试剂盒提供一种GLS1/GLS2荧光定量PCR的检测方法。本发明试剂盒包括 特异性引物：GLS1的引物：其序列为上游SEQIDN0. 1，下游SEQIDNO. 2 ;GLS2的引物：其 序列为上游SEQIDNO. 3,下游SEQIDNO. 4;内参基因GAPDH的引物，其序列为上游SEQID NO. 5,下游SEQIDNO. 6;序列详细碱基对见序列表。
[0018] 本发明所述的检测方法，其特异性特征是，所述的样本均来自肝癌病人肝组织中 癌组织及远离癌巢的正常组织。
[0019] 本发明的试剂盒为一种通过对组织或细胞提取总RNA，并通过逆转录mRNA样品得 到cDNA，再结合荧光定量PCR检测技术，准确的检测标本中GLS1和GLS2mRNA的表达量的 试剂盒。
[0020] 本发明方法是通过检测肝组织中GLS1和GLS2mRNA的表达变化量，预警肝组织的 癌变是否发生及肝癌的发生发展情况，为肝癌的确诊及诊治过程提供重要信息。
[0021] 本发明具有如下的有益效果：
[0022] 本发明的临床意义是跟踪检测肝脏癌变的发生和病理演变过程中GLS1和GLS2蛋 白、mRNA表达变化，预警肝癌发生发展趋势。
[0023] 本发明的GLS1和GLS2与临床上其它癌症标志物，以及影像学检查有显著不同。
[0024] 本发明可以在基因转录水平检测GLS1和GLS2基因的异常表达。在影像学检查发 现占位性癌病灶之前，及时检测到GLS1和GLS2基因的表达异常，提供一种肝癌早期筛查、 早期诊断、早期治疗的方法和应用，为肝癌患者脱离病痛提供极有前景的策略。
[0025] 本发明中的GLS1和GLS2抗体、GLS1和GLS2引物检测试剂盒为肝癌及其他癌症 的基础研究和临床研究提供了良好的工具。
[0026] 本发明中GLS1和GLS2的表达与肝癌患者预后明显相关，对判断肝癌患者预后具 有重要作用；对肝癌病人术后随访和序贯治疗具有重要的指导意义。
[0027] 本发明中提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强、操作简单的特点，不仅可以在大 中型医院推广，也可以在基层医院中广泛使用。
[0028] 本发明的其他具体优点和效果将在下面继续说明。
【附图说明】：
[0029] 图1GLS1和GLS2在肝癌组织中的分布与表达
[0030] 免疫组织化学与荧光定量PCR两种方法检测112对肝癌组织和癌旁组织中GLS1、 GLS2蛋白的分布与表达情况，苏木精-伊红染色（HEstaining)判定组织病理分类。图1A 是免疫组织化学检测肝癌组织（TT)和癌旁组织（NT)中GLSUGLS2蛋白分布与表达的代表 图片（本专利申请附图的原始彩图中，肿瘤组织（TT)GLSl染色呈棕黄色阳性，GLS2染色阴 性，而癌旁组织（NT)中GLS1染色阴性，GLS2染色呈棕黄色阳性）。图1B是112对肝癌组 织和癌旁组织中GLSUGLS2蛋白表达水平的统计数据。++代表强阳性染色，+代表弱阳性 染色，-代表阴性染色；分别代表高表达、低表达、基本不表达。图1C是荧光定量PCR检测 肝癌组织（TT)和癌旁组织（NT)中GLS1、GLS2mRNA的表达。#ρ〈0·01，#*ρ〈(λ001。
[0031] 图2GS在肝癌组织中的分布与表达
[0032] 免疫组织化学与荧光定量PCR两种方法检测112对肝癌组织和癌旁组织中谷氨 酰胺合成酶（GS,GlutamineSynthetase)蛋白的分布与表达情况，苏木精-伊红染色（HE staining)判定组织病理分类。图2A是免疫组织化学检测肝癌组织（TT)和癌旁组织（NT) 中GS蛋白分布与表达的代表图片（本专利申请附图的原始彩图中，肿瘤组织（TT)中GS 染色呈棕黄色阳性、呈现集中分布，而癌旁组织（NT)中GS染色呈棕黄色阳性、呈现弥散分 布。）。图2B是112对肝癌组织和癌旁组织中GS蛋白表达水平的统计数据。++代表强阳 性染色，高表达；+代表弱阳性染色，低表达。图2C是荧光定量PCR法检测肝癌组织（TT)和 癌旁组织（NT)中GLULmRNA(编码GS蛋白）的表达。图2D是使用非配对Spearman相关 性分析法分析GLULmRNA在肝癌组织（TT)和癌旁组织（NT)中表达的相关性。
[0033] 图3GLS1和2在肝癌和其他肝病组织中的分布与表达
[0034] 免疫组织化学法检测112对肝癌组织和癌旁组织、10个不典型增生组织、44个肝 硬化组织、5个肝腺瘤组织、12个局灶性结节增生组织、20个正常肝组织中GLS1和GLS2的 表达情况，苏木精-伊红染色（HEstaining)判定组织病理分类。图3A是免疫组织化学 检测肝癌组织（TT)与癌旁组织（NT)、不典型增生组织（DN)、肝硬化组织（FL)、肝腺瘤组织 (HCA)、局灶性结节增生组织（FNH)、正常肝组织（NL)中GLS1和