IDN0:3和 SEQIDN0:4所示；GLUL的正向引物和反向引物分别如序列表SEQIDN0:7和SEQIDN0:8 所示。荧光定量RT-PCR结果分析采用相对定量的方法分析。
[0216] 表2荧光定量PCR引物序列
[0217]
[0218] 2.3结果总结
[0219] 2. 3. 1结果如图1C所示，98例肝癌组织（TT)中GLS1mRNA的含量显著高于癌旁 组织（NT);而肝癌组织中GLS2mRNA的含量显著低于癌旁组织。
[0220] 2. 3. 2结果如图2C所示，98例肝癌组织（TT)中GSmRNA的含量与癌旁组织（NT) 基本相同，无显著性差异；肝癌组织中GSmRNA与癌旁组织中的GSmRNA显著相关。
[0221] 2. 4 结论
[0222] 2.4. 1GLS1mRNA在肝癌细胞中高表达，而GLS2mRNA在肝癌细胞中不表达或显著 低表达。
[0223] 2. 4. 2肝癌组织中GSmRNA的表达与癌旁组织无明显差异，GSmRNA定量不宜作 为诊断肝癌的指标。
[0224] 实验例3组织芯片检测GLS1和GLS2表达
[0225] 90例肝癌组织（TT)和癌旁组织（NT)收集于南京鼓楼医院，组织芯片交 由上海生物芯片有限公司（生物芯片上海国家工程研究中心）制作，芯片编号为 HLiv-HCC180Sur-01。患者生存时间统计据病例跟踪访问。
[0226] 结果如图5A所示，在90例肿瘤组织（TT)GLSl染色中，80%呈强阳性，16. 67%呈 弱阳性，3. 33%阴性；在90例癌旁组织中，13. 3%呈强阳性，53. 3%呈弱阳性，33. 3%呈阴 性。图5B显示，低GLS1表达的患者（lowGLS1expression,阴性和弱阳性）生存时间显著 长于高GLS1表达（highGLS2expression，强阳性）的患者，中位生存期分别为44. 56个 月（高GLS1表达）和29. 32个月（低GLS1表达）。图6A所示，在86例肿瘤组织（TT)GLS2 染色中，20. 93 %呈强阳性，44. 19 %呈弱阳性，34. 88 %阴性；在86例癌旁组织中，77. 91 % 呈强阳性，17. 44%呈弱阳性，4. 65%呈阴性。图6B，86例患者生存时间统计显示，GLS2染 色阴性患者的生存时间最短，GLS2染色阳性患者的生存时间最长。结果表明GLS1和GLS2 可以作为肝细胞肝癌预后的独立标志物，但GLS1在预后评判中起主导作用。
【主权项】
1. GLS1基因在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝癌诊断试剂盒以GLS1基因作为诊 断标记物。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肝癌诊断试剂盒是通过荧光定量PCR 技术检测疑似肝癌患者的手术切除组织中GLS1基因的水平，所述GLS1基因在瘤内的水平 高于瘤旁与肝癌的发生呈正相关。 4. GLS1和GLS2基因在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肝癌诊断试剂盒以GLS1和GLS2基因 作为诊断标记物。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肝癌诊断试剂盒是通过荧光定量PCR 技术检测疑似肝癌患者的手术切除组织中GLS1和GLS2基因的水平，所述GLS1基因在瘤内 的水平高于瘤旁与肝癌的发生呈正相关，GLS2基因在瘤内的水平低于瘤旁与肝癌的发生呈 负相关。 7. GLS1基因编码的蛋白在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肝癌诊断试剂盒以GLS1基因编码的 蛋白作为诊断标记物。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肝癌诊断试剂盒是通过免疫组化技 术检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1蛋白的表达情况，所述的GLS1蛋白在癌内的表达 水平高于癌旁与肝癌的发生呈正相关。 10. GLS1和GLS2基因编码的蛋白在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。11. 根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述肝癌诊断试剂盒以GLS1和GLS2基 因编码的蛋白作为诊断标记物。12. 根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述肝癌诊断试剂盒是通过免疫组化 技术检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1和GLS2蛋白的表达情况，所述的GLS1蛋白在癌 内的表达水平高于癌旁与肝癌的发生呈正相关，GLS2蛋白在癌内的水平低于癌旁与肝癌的 发生呈负相关。 13. GLS1基因编码的蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。14. 根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述肝癌预后评估试剂盒以GLS1基因 编码的蛋白作为预后评估标记物。15. 根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述肝癌预后评估试剂盒是通过免疫 组化技术检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1蛋白的表达情况，所述的GLS1蛋白癌内表 达的程度与肝癌患者的预后生存期呈负相关。 16. GLS1和GLS2基因编码的蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。17. 根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述肝癌预后评估试剂盒以GLS1和 GLS2基因编码的蛋白作为预后评估标记物。18. 根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述预后评估试剂盒是通过免疫组化 技术检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1和GLS2蛋白的表达情况，所述的GLS1蛋白癌内 表达的程度与肝癌患者的预后生存期呈负相关，GLS2蛋白癌内表达的程度与肝癌患者的预 后生存期呈正相关。19. 一种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是通过荧光定量PCR技术检 测疑似肝癌患者的手术切除组织中GLS1基因的水平，所述的GLS1基因在瘤内的水平高于 瘤旁与肝癌的发生呈正相关。20. 根据权利要求19所述的诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述诊断肝癌的 试剂盒包括如下试剂： 试剂A:TRIzol，XI; 试剂B:75 %乙醇，XI; 试剂C:RNase_freewater，X1 ; 试剂D:逆转录酶，X1 ; 试剂E:SYBRGreen荧光定量PCR酶，X1 ; 试剂F:GLS1 正向引物（SEQIDNO: 1)，X1 ; 试剂G:GLS1 负向引物（SEQIDN0:2)，XI。21. -种用于诊断肝癌的试剂盒，其特征在于，所述诊断肝癌的试剂盒是通过荧光定量 PCR技术检测疑似肝癌患者的手术切除组织中GLS1和GLS2基因的水平，所述的GLS1基因 在瘤内的水平高于瘤旁与肝癌的发生呈正相关，GLS2基因在瘤内的水平低于瘤旁与肝癌的 发生呈负相关。22. 根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下试剂： 试剂A:TRIzol，XI; 试剂B:75 %乙醇，XI; 试剂C:RNase_freewater，X1 ; 试剂D:逆转录酶，X1 ; 试剂E:SYBRGreen荧光定量PCR酶，X1 ; 试剂F:GLS1 正向引物（SEQIDNO: 1)，X1 ; 试剂G:GLS1 负向引物（SEQIDN0:2)，XI; 试剂H:GLS2 正向引物（SEQIDN0:3)，XI; 试剂I:GLS2 负向引物（SEQIDN0:4)，XI。23. -种用于诊断肝癌和预后评估的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是通过免疫组 化技术检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1蛋白的表达情况，所述的GLS1蛋白在癌内的 表达水平高于癌旁与肝癌的发生呈正相关，所述的GLS1蛋白癌内表达的阳性率与肝癌患 者的预后生存期呈负相关。24. 根据权利要求23所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下试剂： 试剂A:封闭液，10%山羊血清，X1 ; 试剂B:兔抗GLS1单克隆抗体，X1 ; 试剂C:抗兔生物素化二抗，X1 ; 试剂D:链亲和素标记HRP，X1 ; 试剂E:20倍浓缩DAB显色液，X1 ; 试剂F:氨水，X1。25. -种用于诊断肝癌和预后评估的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是通过免疫组化 技术检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1和GLS2蛋白的表达情况，所述的GLS1蛋白在癌 内的表达水平高于癌旁与肝癌的发生呈正相关，GLS2蛋白在瘤内的水平低于瘤旁与肝癌的 发生呈负相关；所述的GLS1蛋白癌内表达的阳性率与肝癌患者的预后生存期呈负相关，所 述的GLS2蛋白癌内表达的阳性率与肝癌患者的预后生存期呈正相关。26. 根据权利要求25所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下试剂： 试剂A:封闭液，10%山羊血清，X1 ; 试剂B:兔抗GLS1单克隆抗体及兔抗GLS2单克隆抗体，X1 ; 试剂C:抗兔生物素化二抗，X1 ; 试剂D:链亲和素标记HRP，X1 ; 试剂E:20倍浓缩DAB显色液，X1 ; 试剂F:氨水，X1。 27. GLS1基因编码的蛋白在制备肝癌个体化治疗筛选试剂盒中的应用，其特征在于，所 述肝癌个体化治疗筛选试剂盒是通过免疫组化技术检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1 蛋白的表达情况，所述的GLS1蛋白在癌内的1?表达能够指导抗谷氣醜胺酵解的临床治疗。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及一种GLS1和GLS2蛋白和基因的新应用，特别是在制备肝癌诊断和预后评估试剂盒中的应用，具体的说本发明的目的在于提供一种基于GLS1/GLS2蛋白表达检测、GLS1/GLS2？mRNA表达检测的肝癌早期诊断策略和应用。本发明包括用于肝癌诊断的GLS1/GLS2免疫组化检测试剂盒，GLS1/GLS2荧光定量PCR检测试剂盒。本发明检测试剂盒提供一种GLS1/GLS2免疫组化检测的方法。本发明检测试剂盒提供一种GLS1/GLS2免疫组化检测诊断肝细胞肝癌的标准。本发明方法是通过检测肝组织中GLS1/2mRNA、蛋白的表达变化的情况，预警肝组织的癌变是否发生及肝癌的发生发展情况，为肝癌的确诊及预后、靶向肿瘤代谢的个体化治疗提供必要的依据。
【IPC分类】G01N33/68, G01N33/574, C12Q1/68
【公开号】CN105349622
【申请号】CN201410419471
【发明人】余德才, 丁义涛, 魏继武, 史先彪, 孟刚
【申请人】南京大学医学院附属鼓楼医院
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2014年8月22日