R扩增引物设计时选择目的区域上下游100~200bp的距离引物设计的起始位点，引物 与序列匹配的特异性更好，引物间退火温度要尽量一致，且保持在55°C左右，使在一个多重 PCR反应中的各个扩增效率相当。12个扩增片段包含所要检测的12个SNP位点，分为两组： A组包括57你?7堪因rsl7038182位点、M7SZ堪因rsl378850位点、基因rsl812175 位点、"/577份/?因rsl0946808位点、基因rs8041863位点、6??基因rs6182位点和 6M基因rs6184,其扩增片段长度依次为369bp、447bp、365bp、304bp、497bp、274bp和 211bp;B组包括 基因rs4410646 位点、6??基因rsl2515480 位点、6??基因rs2940913 位点、/67^-7#基因rs1976667位点和/猫基因rs3099位点，其扩增片段长度为496bp、191 bp、459bp、337bp和284bp。两组多重PCR扩增结束后可通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行 扩增片段检测，发现12条扩增条带。
[0012] 接着进行PCR扩增产物的酶反应纯化，去除多余的dNTP及引物等杂质，再对12个 富集的片段进行寡核苷酸引物的PCR扩增，又进一步针对经过扩增的12个SNP位点进行延 伸引物设计，引物设计的指导思想是：仅在SNP位点的上下游设计正向或反向的延伸引物， 引物设计长度较扩增片段长度少1个碱基，延伸的单个碱基为带有相应颜色荧光标记的双 脱氧核苷酸ddNTP。各个引物扩增片段长度需要有一定的差异，均匀分布在18-80bp之间， 以便于毛细管电泳检测。分为两组进行延伸反应，理论上，A组的57你?77基因rsl7038182 位点、Mr说堪因rsl378850 位点、基因rsl812175 位点、"/577份基因rsl0946808 位点、说基因rs8041863位点、6观基因rs6182位点、6??基因rs6184位点的延伸引物 片段在经过毛细管电泳后的长度依次为35bp、40bp、45bp、50bp、55bp、60bp、65bp; B组的6S?基因rs4410646位点、6??基因rsl2515480位点、6??基因rs2940913位点、 基因rsl976667位点和/猫基因rs3099位点为的延伸引物片段在经过毛细管电 泳后的长度依次为38bp、58bp、53bp、70bp、63bp，如表1所示，实际电泳过程可能存在漂 移现象，尤其是发生了变异位点的峰漂移更多，即与分子量marker所测片段大小有差距， 但不会影响整体结果判读。
[0013] 表1 8个矮小症易感基因12个SNP位点延伸片段理论长度
这样，经过对变异位点的单个碱基进行荧光标记PCR延伸扩增后，再进行一次扩增产 物的酶反应纯化，带有不同荧光的不同长度的片段经遗传分析毛细管电泳后就能够分析出 相应片段所携带的碱基类型，延伸引物的片段长度决定峰的位置，延伸位点碱基的类型决 定电泳峰的颜色，延伸引物的浓度影响电泳检测的峰高。A碱基的峰颜色为绿色，G碱基为 蓝色，T碱基为红色，C碱基为黑色。根据峰的颜色可以清楚方便的判断为野生型(正常）还 是突变型，如表2所示： 表2 12个SNP位点野生型与突变型颜色标记
所示设计为反向测序反应，因此在毛细管电泳结果中野生型与突变型均要按反向测 序去判断。基因rsl812175位点正向测序突变类型为C-T，反向测序则为G-A; "/577份/?因rsl0946808位点正向测序突变类型为G-A，反向测序则为C-T; 6S?基 激rs2940913位点正向测序突变类型为G-T，反向测序为C-A;i?基因rs3099位点 正向测序突变类型为C-T，反向测序为G-C。
[0014] 本发明将上述12个SNP位点在两个反应中检测，大大节省了检测的时间、试剂、人 力和物力，提高了诊断效率。
[0015] PCR扩增引物序列和扩增长度见表3所示： 表3 8个矮小症易感基因12个SNP位点PCR扩增引物
PCR延伸引物见表4所示： 表4 10个矮小症易感基因12个SNP位点的PCR延伸引物
为了使检测准确可靠、简单易行，本试剂盒含有PCR扩增反应试剂，包括10XPCR缓冲 液、Mg2+离子、dNTP、FastTaq酶、引物混合液、延伸引物混合液、SNaPshot混合液，纯化用 SAP酶、ExoI酶及其配套的缓冲液；阳性对照标本、阴性对照标本以及说明书。其主要功能 在于，将所需的试剂集成在一个小盒内，进行片段扩增，纯化可以在试剂盒提供试剂的基础 上顺序而简便地完成。
[0016]在过去的十几年中，虽然已有多种SNP分型检测的技术得到发展，但总的来说，尚 缺乏一种适用于矮小症易感基因SNP位点分型的技术方法，本发明是一种准确、简便、高通 量又经济的基因分型检测的方法。
[0017]下面，结合附图和实施例对本发明之中国儿童矮小症易感基因SNP分型用试剂盒 及其使用方法的技术特征作进一步的说明。
【附图说明】
[0018] 图1 :中国儿童矮小症易感基因SNP位点基因分型原理图。
[0019] 图2 :本发明检测样品一A组6个矮小症易感基因7个多态性位点的基因分型图。
[0020] 图3 :本发明检测样品二A组6个矮小症易感基因7个多态性位点的基因分型图。
[0021] 图4 :本发明检测样品三A组6个矮小症易感基因7个多态性位点的基因分型图。
[0022] 图5 :本发明检测样品四A组6个矮小症易感基因7个多态性位点的基因分型图。
[0023] 图6:本发明检测样品五A组6个矮小症易感基因7个多态性位点的基因分型图。
[0024] 图7:本发明检测样品六A组6个矮小症易感基因7个多态性位点的基因分型图。
[0025] 图8:本发明检测样品七A组6个矮小症易感基因7个多态性位点的基因分型图。
[0026] 图9:本发明检测样品一B组3个矮小症易感基因5个多态性位点的基因分型图。
[0027] 图10 :本发明检测样品二B组3个矮小症易感基因5个多态性位点的基因分型图。
[0028] 图11:本发明检测样品三B组3个矮小症易感基因5个多态性位点的基因分型图。
[0029] 图12 :本发明检测样品四B组3个矮小症易感基因5个多态性位点的基因分型图。
[0030] 图13 :本发明检测样品五B组3个矮小症易感基因5个多态性位点的基因分型图。
[0031] 图14:本发明检测样品六B组3个矮小症易感基因5个多态性位点的基因分型图。
[0032] 图15:本发明检测样品七B组3个矮小症易感基因5个多态性位点的基因分型图。
[0033] -个样品分两组进行扫板，其中图2~图8中有7个多态性位点的基因分型，图 9~图15中有5个多态性位点的基因分型。
【具体实施方式】
[0034] 本发明的的分型原理为：通过在引物的5'末端连接不同数目的核苷酸尾巴，同时 进行多引物(复合）分析，这样各引物可因核苷酸尾巴数目的不同而区分。在电泳平台上应 用5种荧光染料检测，第5种染料标记内标，内标用以纠正电泳时泳道间产生的迀移误差。 四种核苷酸各标记不同的染料颜色：A(green，绿色)、G(blue，蓝色)、C(yellow，黑色）和 T(red，红色)。因此，在电泳中一个蓝色峰形的出现，表明一个G(ddGTP)通过聚合酶结合 在SNP位点上。在检测时，峰的颜色显示所选择的SNP位点核苷酸信息，而峰的位置与SNP 遗传标记5'加尾的长度有关，显示相互区别的不同位点。纯合的等位基因以单峰形式出现， 杂合的等位基因则以毗邻的两个峰显示。
[0035] 实施例1 :如附图所示，矮小症患者易感基因SNP分型监测： 样本选择：样本来源于柳州市妇幼保健院儿童保健科矮小症患者DNA文库。其中男80 例，女80例，库中所有患者样本收集前均签署了知情同意书，并承诺配合后续的诊疗和随 访。
[0036] 1、8个矮小症易感基因12个区段进行单对引物PCR扩增 PCR反应体系为25yL，包括10XPCR缓冲液（Mg2+free)2.5yL，dNTP混合物0.5yL(10mM)，0.8yLMgCl2 (50mM)，0.2yLPlatinumTaqDNA聚合酶（5U)，每个位点 正向引物0.5yL，每个位点反向引物0.5yL，lyLDNA模板（20mg/L)，19yLddH20。 PCR反应条件为：95°C变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，33个循环， 最后72°C延伸5min，结束后4°C保存。PCR反应在美国ABI公司9700热循环仪中进行。 PCR扩增后，取PCR反应产物5μL在1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带清晰，大小正确， 即表明实验成功。
[0037] 2、8个矮小症易感基因12个区段分为两组进行多重PCR扩增反应 12个区段分为两组进行多重PCR扩增反应，Α组包括57撕7堪因rsl7038182位点、M7SZ堪因rsl378850 位点、基因rsl812175 位点、"/577份/?因rsl0946808 位点、 基因rs8041863位点、6??基因rs6182位点、6??基因rs6184位点；B组包括6S?基 因rs4410646 位点、6??基因rsl2515480 位点、6??基因rs2940913 位点、基因 rsl976667位点、/猫基因rs3099位点。每组PCR反应体系为20μL，包括10XPCR缓 冲液（Mg2+free)2.5yL，0.8yLMgCl2 (50mM)，dNTP混合物 0.5yL(10mM)，0.2 yLPlatinumTaqDNA聚合酶（5U)，引物混合液 1yL，lyLDNA模板（20mg/L)，19yL ddH20。PCR反应条件为：95°C变性 5min，94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 30s，33 个循环，最后72°C延伸5min，结束后4°C保存。PCR反应在美国ABI公司9700热循环仪中 进行。扩增引物序列见表3。
[0038] 3、多重PCR扩增产物纯化 用虾碱酶方法进行PCR产物的纯化，总体积为10yL，在2yLPCR产物中加入0. 3yLSAP(lU/yL)和 0.2yLExoI(20U/yL)，震荡混匀，37°C保温 1h30min，然后 75°C保温15min以灭活SAP和ExoI酶，纯化好的模板可以在4°C保存24h或-20°C长期 保存。
[0039] 4、SNaPs