以重组的三股螺旋支架为基础的复合物的制作方法

专利名称：：以重组的三股螺旋支架为基础的复合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有支架(scaffold)的蛋白质复合物(proteincomplex),且特别涉及具有三股螺旋(triple-helix)支架的蛋白质复合物,其可用于抗肿瘤、感染性疾病与免疫调节(immunomodulatory)的用途。
背景技术：
：基于蛋白质的结合试剂在治疗或诊断应用上具有多种用途。抗体就是个极佳的范例，许多单克隆抗体(rnAbs)(以下简称mAbs)已经成功地用于治疗癌症、感染性疾病和炎性疾病(inflammatorydiseases)(Adamsetal.,Nat.Biotechnol.2005Sep;23(9):1147-57)。通过重组DNA技术,包括嵌合化(chimerization)和人源化(humanization),增强了鼠科动物mAbs的功效与安全性。然而使用CDR(互补决定区，以下简称CDR)移植来进行鼠科动物mAbs人源化时,通常使其结合亲和力低于鼠科动物的对应物(counterpart)。抗体的亲和力是抗体作为治疗剂成功与否的关键因素。具有高亲和力的抗体可使抗体与天然的配体对靶向受体有效地竞争以减少剂量、毒性与花费。亲和力也影响抗体的药物动力学，例如在靶向组织与宿主循环之内的分布与分泌。在体内有效的单克隆抗体的必要条件是对靶向抗原具有强的亲和力且对非相关蛋白质没有非特异性的结合。抗原结合位点的多聚化(multimerization)已被证实是增加抗体与抗原结合的整体强度的有效方式，其中抗体与抗原结合的整体强度被定义为抗体亲和力(antibodyavidity)(功能性亲和力(functionalaffinity))(Milleretal.,JImmunol170:4854-4861,2003;Rheinneckeretal.,JImmunol157:2989-2997，1996;Shopes,JTmmunol148:2918-2922,1992;Shufordetal.,Science252:724-727,1991;Wolffetal.,JImmunol148:2469-2474,1992)。在体内它们具有增强的抗肿瘤活性(Liuetal.,IntImmunopharmaco16:791-799,2006;Wolffetal.，CancerRes53:2560-2565，1993)。由于免疫球蛋白G(IgG)(以下简称IgG)分子结构的二价性质，常用的和经过改造的IgG不能用来结合同时结合两个以上的不同抗原。因此需要多价或多特异性(mult1-specific)的蛋白质结合试剂。在一些实例中，为了减少促有丝分裂副作用(mitogenicityside-effect),需要通过改造Fe区来避免效应功能(effectorfunction),例如依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)以及依赖于补体的细胞毒性(complementdependentcytotoxicity,Q)C)。例如，鼠科动物抗-人类⑶3单克隆抗体(正纯种系(Orthoclone)0KT3,莫罗莫那-⑶3(Muromonab-⑶3))作为以人类T细胞上的T-细胞受体/CD3复合物为靶标的强有力免疫抑制试剂。它用来预防或治疗同种异体移植排斥(allograftrejection)已有二十年的时间(Cosimietal.,NEnglJMed305:308-314,1981;Group,NEnglJMed313:337-342,1985;Kungetal.,Science206:347-349,1979)。然而进行这种治疗的一个主要缺点是细胞因子，例如TNF-α、IL-2和IFN-Y的全身释放，其导致一系列有害的促有丝分裂作用(mitogeniceffects),包括感冒样症状(flu-likesymptoms)、呼吸窘迫(respiratorydistress)、神经症状(neurologicalsymptoms)和急性肾小管坏死(acutetubularnecrosis)(Abramowiczetal.,Transplantation47:606-608,1989;Chatenoudetal.,NEnglJMed320:1420-1421，1989;Goldmanetal.,Transplantation50:158-159，1990;Toussaintetal.，Transplantation48:524-526,1989)。因为0KT3和其它抗_CD3mAbs的促有丝分裂作用依赖于与带有Fe受体的细胞(FcR-positivecell)(例如单核细胞)结合从而发生广泛的TCR/⑶3交联(cross-linking)，因此最近有许多研究都希望通过改变与FcR的结合，来开发抗-⑶3抗体的非促有丝分裂作用形式(nonmitogenicforms)。由以上说明可知，目前亟需一种具有高亲和力、低促有丝分裂作用和体内高稳定性的蛋白质结合试剂。
发明内容本发明提供了具有高亲和力、低有丝分裂作用和体内高稳定性的以蛋白质复合物为基础的结合试剂(proteincomplex-basedbindingreagent)。本发明试剂也可为多价的(mult1-valenyt)或多特异性的(mult1-specific)。在一方面，本发明涉及分离的重组蛋白质复合物，其包含第一融合多肽链，包含第一支架区和一该第一支架区一端框内(in-frame)融合的第一异源性(heterologous)区、第二融合多肽链，包含第二支架区，以及第三融合多肽链，包含第三支架区。上述第一、第二与第三支架区互相比对(align)以形成三股螺旋卷曲。而且上述第一支架区域与第一异源性区框内融合且在相同的多肽链上。上述异源性区可包含酶促结构域或荧光蛋白质的序列。荧光蛋白质的例子包括GFP和dsRed及其变体(variant)。酶促结构域的例子包括谷胱甘肽S-转移酶(glutathioneS-transferase)、萤光素酶(Iuciferase)、β-半乳糖昔酶(β-galactosidase)与β-内酸胺酶(β-lactamase)。上述异源性区可包括与结合配偶体(bindingpartner)结合的结合区(例如,配体(ligand)结合区、配体、受体、亲和标记物或蛋白聚糖)。“结合配偶体”意指对于感兴趣的靶向化合物的一部分(例如，蛋白质)具有特异性的、共价或非共价的亲和性的任何分子。结合配偶体的例子包括抗原/抗体配对物、蛋白质/抑制物配对物、受体/配体配对物(例如，细胞表面或细胞核受体/配体配对物)、酶/底物配对物(例如，激酶(kinase)/底物配对物)、凝集素(lectin)/碳水化合物(carbohydrate)配对物、寡聚的(oligomeric)或异源寡聚的(heterooligomeric)蛋白质配对物、DNA结合蛋白/DNA结合位点的配对物和RNA/蛋白质配对物。结合区的例子也包括亲和标记物的序列，例如，组氨酸-标记物(histidine-tag)、myc标记物(myctag)或血凝素标记物(hemagglutintag)。上述第一异源性区可包含免疫球蛋白的一个或多个⑶R。因此异源性区可包含抗体的抗原结合部分，例如Vh区和Fab。在实施例中第一异源性区包含抗原结合片段或单链抗体的序列，例如对簇命名3(ClusterDesignation3,0)3)(以下简称⑶3)或表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR)(以下简称EGFR)特异的序列。上述第一多肽链还可包含与上述第一支架区另一端框内融合的第二异源性区。如上述第一支架区，第二异源性区也可包含与结合配偶体结合的结合区。第一和第二异源性区可彼此相同或不同。它们可与相同的结合配偶体或两个不同的结合配偶体结合。例如，第一异源性区和第二异源性区可分别包含第一单链抗体和第二单链抗体的序列，上述两抗体分别与CD3与EGFR特异性结合。在上述蛋白质复合物中，第二融合多肽链可以包含与上述第二支架区一端框内融合的第三异源性区、框内融合至第二支架区另一端的第四异源性区或框内融合至该两端的两个区。同样地，前述第三融合多肽链可包含框内融合至第三支架区一端的第五异源性区或框内融合至第三支架区另一端的第六异源性区或两者皆有。如同上述第一和第二异源性区，其它四个异源性区中的每一个均可包含与结合配偶体结合的结合区。全部六个异源性区可彼此相同或不同。因此它们可与1、2、3、4、5或6个结合配偶体结合。换句话说，此蛋白质复合物可以是一、二、三、四、五或六价。为了让第一、第二与第三支架区形成三股螺旋卷曲，三个支架区的每一个均包含一个或多个三股螺旋重复序列，每个重复序列包含下列式子的序列:(Xl-X2_X3)n，其中Xl是甘氨酸(Gly)残基，X2或X3是任何氨基酸残基，优选为亚氨基酸脯氨酸或羟脯氨酸(hydroxproline);以及η大于或等于5。例如,第一、第二或第三支架区可包含(GPP)ltl或人类补体Clq、胶原凝集素(collectin)或胶原蛋白多肽链的一个或多个三股螺旋重复序列。在实施例中，前述第一、第二与第三融合多肽基本上相同，彼此具有至少75%(例如在75%与100%之间任何数量，包括75%与100%)的序列同一性。通过三个相同的融合多肽形成的复合物为同源三聚体(homotrimer)。上述三个融合多肽可以是“功能等同物(functionalequivalent)”。“功能等同物”意指常见多肽的多肽衍生物,例如,具有一个或多个点突变、插入(insertion)、缺失(deletion)、截短(truncation)的蛋白质、其融合蛋白或上述的组合，并且其基本上保持形成三股螺旋的能力以及异源性区的活性，例如与配体结合。异源性多肽、核酸或基因可源自不同物种，或者即使它们来自相同物种，它们也从在最初的形式上经过基本的修饰。两个融合区或序列彼此是异源的，即使在天然存在的蛋白质或核酸中它们也并不相互连接。例如并非是天然存在的人类迷你胶原蛋白(minicollagen)(第XXI型)、胶原凝集素家族蛋白或补体Iq(Clq)—部分的多肽序列对于人类蛋白质的区而言是异源的。本发明的另一特色是分离的重组融合多肽，其包括(i)用来形成三股螺旋卷曲的支架区和(ii)框内融合至上述支架区一端的第一异源性区或框内融合至上述支架区另一端的第二异源性区。所述支架区可以包含一个或多个前述三股螺旋重复序列，例如人类Clq或胶原蛋白多肽链的重复序列。异源性区可包含上述结合区之一并且可以通过许多本
技术领域：
已知方法例如曬菌体展示筛选(phagedisplayscreening)来获得。分离的多肽或蛋白质复合物意指基本上无自然相关的分子，即由干重计算具有至少75%(即在75%与100%之间的任何数量，包括75%与100%)的纯度的多肽或蛋白质复合物。纯度可用任何适当的标准方法，例如通过柱层析(columnchromatography)>聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis)或高效液相层析(highperformanceliquidchromatography,HPLC)分析来测量。本发明的分离多肽或蛋白质复合物可由自然来源分离或用重组DNA技术制造。本发明也涉及分离的核酸，此分离的核酸包含编码上文所述融合多肽的序列或此序列的互补序列。核酸指DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、或DNA或RNA的类似物。DNA或RNA的类似物可由核苷酸类似物合成。此核酸分子可以是单链或双链，但优选双链DNA。“分离的核酸”是结构不与任何天然存在的核酸或任何天然存在的基因组核酸片段相同的核酸。因此该用语包含，例如(a)DNA，其具有天然存在的基因组DNA分子的一部分序列，但不与在生物体的基因组中天然存在于其两侧的编码序列邻接；(b)核酸，其以某种方式被引入载体(vector)或原核细胞或真核细胞的基因组中，由此所形成的分子不与任何天然存在的载体或基因组DNA相同；(c)分离的分子，例如cDNA、基因组片段、通过聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)所产生的片段或限制性片段(restrictionfragment);和(d)重组核苷酸序列，其为杂合基因(即编码融合蛋白质的基因)的一部分。上述核酸可用来表达本发明多肽。为此目的，可将上述核酸连接至适合的调控序列以产生表达载体。载体是指核酸分子，其具有将另一核酸转移到其连接处的能力。载体具有自主性复制(autonomousreplication)或整合入宿主DNA的能力。载体的例子包括质粒(plasimd)、噬菌粒(cosmid)或病毒载体。本发明载体包含核酸，其为适合于在宿主细胞内表达该核酸的形式。优选所述载体包含与待表达的核酸序列可操作连接的一个或多个调控序列，其。“调控序列”包括启动子(promoter)、增强子(enhancer)和其它表达控制元件(例如多腺苷酸化信号(polyadenylationsignal))。调控序列包括那些指导核苷酸序列的组成型表达和组织特异性调控和/或可诱导的序列。对表达载体的设计可依据下列因素，如对被转染宿主细胞的选择、所需蛋白质表达的程度与诸如此类。可将表达载体引入宿主细胞以制造本发明多肽。包含上述核酸的宿主细胞也在本发明范围内。例子包括大肠杆菌(E.coli)细胞、昆虫细胞(例如使用果蚬(Drosophila)S2细胞或杆状病毒(baculovirus)细胞)、酵母细胞或哺乳动物细胞(例如小鼠骨髓瘤(Hiyeloma)NSO细胞)。请参阅，例如Goeddel,(1990)GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymologyl85,AcademicPress,SanDiego,CA。为了制造本发明的融合多肽，在一定条件下在培养基中培养宿主细胞以表达本发明核酸所编码的多肽，并从被培养的细胞或该细胞的培养基中纯化上述多肽。或者，可在体外转录与翻译本发明的核酸，例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。为了制造本发明的蛋白质复合物，可一定条件下培养包含分别编码上述第一、第二与第三融合多肽的第一、第二与第三核酸的宿主细胞，以表达上述三个核酸所编码的多肽并且在所表达的多肽之间形成三股螺旋卷曲，以及从培养的细胞或该细胞的培养基中纯化上述蛋白质复合物。优选上述宿主细胞为真核细胞(eukaryoticcell),其包含使脯氨酸残基轻基化(hydroxylate)的酶活性。为了让本发明上述和其它的目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举优选实施例，并配合所附图示，作详细说明如下:附图简述图1显示蛋白质复合物，其具有来自人类XXI型胶原蛋白的迷你胶原蛋白三股螺旋卷曲支架。三股螺旋卷曲的六个末端分别框内融合至六个具有单链抗体(scFv)的\与Vh区的Fv片段区。图2A显示具有三股螺旋卷曲支架的蛋白质复合物，其三个N末端分别与三个单链抗体:0KT3(抗-CD3)、528(抗-EGFR)和erb_scFv(抗-EGFR)框内融合，而第2B图显示该蛋白质复合物的Western印迹的照片。将稳定转染的果蝇S2细胞的培养基在非还原状态下进行SDS-PAGE电泳，之后以抗XXI型胶原蛋白(3E2)C末端的单克隆抗体作免疫印迹。T:键间双硫键三体；Mt:包含键间双硫键三体的单体。图3显示具有三股螺旋卷曲支架的蛋白质复合物。上述三股螺旋卷曲支架的三个N末端与三个0KT3单链抗体框内融合；三个C末端与三个528单链抗体框内融合。图4A和4B显示不同形式抗体的示意图:图4A显示胶原蛋白支架抗体:scFv-Col(左图)，其包含氨基末端scFv、人类IgG铰链(hinge)区、胶原蛋白区(GPP)lt^XXI型胶原蛋白羧基末端NCl区；NSro-scFV(右图)，其包含表面活性蛋白D(surfactantproteinD,SPD)、在羧基末端的胶原凝集素和scFv。图4B由左到右分别显示免疫球蛋白G(IgG)、嵌合的(scFv-Fc)和单链抗体(scFv)，以及它们各自的大致分子量。灰色区显示Vh与'片段；虚线:链间双硫键。主要组件符号说明101迷你胶原蛋白401铰链区403(GPP)10的胶原蛋白区405胶原蛋白XXI型的NCl区或其它靶向的结合区407胶原凝集素的N端区409胶原凝集素的胶原蛋白样(collagen-like)区411胶原凝集素的α螺旋颈部区域实施方式本发明是因(至少一部分)意外发现与人类三股螺旋卷曲支架区域框内融合的异源性蛋白质结合区域保留了结合活性，并且所得的的融合多肽形成了三股螺旋卷曲。图1显示了本发明蛋白质复合物的例子。如该图所示，三股螺旋卷曲蛋白质复合物的六个末端分别与六个异源性蛋白质的结合区，即单链抗体(scFv)的Fv片段框内融合。本发明的蛋白质复合物较常用抗体有许多优点。一方面而言，当上述六个区的两个或多个彼此相同时，蛋白质复合物可具有2-6个对结合配偶体(例如抗原)特异的结合区，而常用抗体只具有两个这种区。换句话说，不像常用抗体对于抗原只有二价，此蛋白质复合物可以是二、三、四、五或六价的。因而，可将其制造为具有各种比常用抗体高的亲和力。因为较高的亲和力，所以比起常用抗体而言，它比常用抗体需要较少量的蛋白质复合物及较短的反应时间来达到期望的目标，例如疗效(therapeuticeffects),由此降低治疗成本并减少副作用(例如，非期望的免疫反应)。在另一方面，当上述六个区的两个或多个互相不同时，本发明的蛋白质复合物可以具有2-6个对2-6个不同结合配偶体特异的结合区。将不同特异性的结合配偶体组合成为一个单元，具有将多种结合配偶体集合在一起的能力，因此用在治疗、组织重构(tissuereconstruction)和在纳米水平的活性蛋白质结构(activeproteinmachinery)(例如多亚基酶)的装配上具有令人满意的应用。为了在人体内使用，本发明的蛋白质复合物优选为人源(humanorigin)的。例如，其可包含人源化单链抗体序列，该序列与人源的螺旋卷曲支架的，如人类Clq、胶原凝集素家族蛋白质或胶原蛋白多肽链的螺旋卷曲支架框内融合。因为人类Clq与胶原蛋白两者在血液中都非常稳定，所以此蛋白质复合物比起一般治疗型鼠源抗体而言更加稳定。胶原蛋白是在哺乳类动物中存在的最大量的蛋白质，其为包含重复的三联体的序列甘氨酸(Gly)-X1-X2的细胞外基质蛋白(extracellularmatrixprotein),这种三联体的出现允许三条胶原蛋白多肽链U-链)折叠成三股螺旋构象。在三联体的序列甘氨酸-X1-X2中，X2位置的氨基酸常为脯氨酸，为了稳定胶原蛋白的三股螺旋结构，常通过胶原蛋白多肽链的翻译后修饰将脯氨酸4-轻基化(hydroxylated)。缺少脯氨酸轻基化,胶原蛋白的必需的三股螺旋构象在低于生理温度(physiologicaltemperature)时是热不稳定的(thermallyunstable)(BergandProckop,BiochemBiophysResCommun52:115-120,1973;Rosenbloometal.,ArchBiochemBiophysl58:478-484,1973)。许多具有胶原蛋白三股螺旋区(collagenousdomain)的胶原蛋白样蛋白质出现于人类血清中，在防护传染性生物上扮演先天性免疫系统(innateimmunesystem)的角色。这些包括补体蛋白质Clq、胶原凝集素家族蛋白质-甘露糖结合凝集素(mannosebindinglectin,MBL)、表面活性蛋白(surfactant而这些胶原蛋白样蛋白质共同的结构特征为由胶原蛋白区的三股螺旋集合构成的多聚化(multimeric)蛋白质亚基(unit),且三聚体分子互相堆集或链间形成二硫键交联。因此，这些“防御胶原蛋白”分子的结合区的功能性亲和力通过多聚化(multimerization)而大幅度增加。本发明的蛋白质复合物或多肽可以通过重组技术获得。可将编码此复合物的多肽的核酸引入合适的宿主细胞中，并且在一定条件下表达由前述核酸编码的多肽，以允许表达该多肽以及在多肽间形成三股螺旋卷曲。为了促进三股螺旋卷曲支架的形成，可在宿主细胞中共表达(co-express)脯氨酰4_轻化酶(prolyl4_hydroxylase，P4HA),其为在胶原蛋白的生物合成中的关键酶。异源蛋白质的结构域可包含抗体或其片段(例如其抗原结合片段)。在此处所使用“抗体”意指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即抗原结合部分。其指包括最少一个优选两个重(heavy，H)链可变区(Vh)，以及至少一个优选两个轻(light，L)链可变区(')的蛋白质。可将Vh和\区更进一步细分为超变区和较保守的散布区，前者称为“互补决定区(complementaritydeterminingregion)”“(CDR)”区，后者称为框架区(frameworkregion)。已经明确定义互补决定区和框架区的范围(参阅Kabatetal.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationN0.91-3242，andChothiaetal.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。每个Vh和Vl由三个⑶R和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端的排列顺序为:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体还可包含重链和轻链的恒定区(constantregion)，由此分别形成重链和轻链的免疫球蛋白链。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。轻链恒定区包含结构域CL。重链和轻链的可变区包含与抗原反应的结合区。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞(effectorcell))和经典补体系统的第一种组分Clq的结合。此处使用的“免疫球蛋白”指由一个或多个多肽组成、基本上由免疫球蛋白基因编码的蛋白质。已知的人类免疫球蛋白基因包括K、λ、a(IgAl和IgA2)、y(IgGUIgG2、IgG3和IgG4)、δ和μ的恒定区基因和无数的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白的“轻链”(约25KDa或214个氨基酸)由在NH2末端的可变区基因(约110个氨基酸)和在COOH末端的K或λ恒定区基因来编码。而全长免疫球蛋白的“重链”(约50KDa或446个氨基酸)相似地由可变区基因(约116个氨基酸)，及其它上述恒定区基因，例如Y(编码约330个氨基酸)来编码。抗体的“抗原结合片段”(或“抗体部分”或“片段”)指全长抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合至抗原(例如EGFR或CD3多肽或其片段)的能力。抗体的抗原结合片段包括，但不限于:(i)Fab片段，由VL,VH,Cl和Chi结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含由二硫键在其铰链区(hingeregion)连结两个Fab片段的二价片段；(iii)由Vh和Chi结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂(singlearm)的\和Vh结构域组成的Fv片段；(V)dAb片段(Wardetal.,(1989)Nature341:544-546),其包含Vh结构域；(vi)分离的互补决定区(CDR)以及(vii)'或Vh结构域。更进一步，虽然Fv片段的两个结构域\和Vh是由各自的基因编码的，但使用重组方法可将它们连接，通过人工接头可将它们制备成单链蛋白质，其中\与Vh区配对形成单价分子(称为单链Fv(ScFv)，参阅，例如Birdetal.(1988)Science242:423-426;andHustonetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883)。此种单链抗体也包括在抗体的“抗原结合片段”范围内。这些抗体片段可用本
技术领域：
常见的技术获得，并以与对完整抗体相同的方式来筛选应用。适当的抗体可以是单克隆抗体。在其它实施例中，抗体可以重组制备，例如由噬菌体展示或组合方法(combinatorialmethod)来制备。产生抗体的曬菌体展示和组合方法是本
技术领域：
已知的(参阅，例如Ladneretal.U.S.PatentN0.5,223,409;Kangetal.1nternationalPublicationN0.W092/18619;Doweretal.1nternationalPublicationN0.W091/17271;Winteretal.1nternationalPublicationW092/20791;Marklandetal.1nternationalPublicationN0.W092/15679;Breitlingetal.1nternationalPublicationW093/01288;McCaffertyetal.1nternationalPublicationN0.W092/01047;Garrardetal.1nternationalPublicationN0.W092/09690;Ladneretal.1nternationalPublicationN0.W090/02809;Fuchsetal.(1991)Bio/Techno1gy9:1370-1372;Hayetal.(1992)HumAntibodHybridomas3:81-85;Huseetal.(1989)Science246:1275-1281;Griffthsetal.(1993)EMBOJ12:725-734;Hawkinsetal.(1992)JMolBiol226:889-896;Clacksonetal.(1991)Nature352:624-628;Grametal.(1992)PNAS89:3576-3580;Garradetal.(1991)Bio/Technology9:1373-1377;Hoogenboometal.(1991)NucAcidResl9:4133-4137;和Barbasetal.(1991)PNAS88:7978-7982)。在一个实施例中，抗体是完全人类抗体(例如，在小鼠中制造的抗体，此小鼠经基因工程改造来制造源自人类免疫球蛋白序列的抗体)或非人类抗体，例如啮齿类动物(小鼠或大鼠)、山羊、灵长类动物(例如猴子)、骆驼(cameloid)的抗体。非人类抗体优选为啮齿类动物(小鼠或大鼠)的抗体。制造啮齿类动物抗体的方法已为本
技术领域：
公知。可以通过使用携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠来制造人类单克隆抗体，而不是使用小鼠的系统。使用感兴趣的抗原免疫的这些转基因小鼠的脾细胞(splenocytes)被用来制造杂交瘤(hybridoma),其分泌对人类蛋白质的表位(epitope)具有特异性亲和力的人类mAbs(参阅，例如Woodetal.1nternationalApplicationW091/00906,Kucherlapatietal.PCTpublicationW091/10741;Lonbergetal.1nternationalApplicationW092/03918;Kayetal.1nternationalApplication92/03917;Lonberg,N.etal.1994Nature368:856-859;Green,L.L.etal.1994NatureGenet.7:13-21;Morrisonetal.1994Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6851-6855;Bruggemanetal.1993YearTmmunol7:33-40;Tuaillonetal.1993PNAS90:3720-3724;Bruggemanetal.1991EurJImmunol21:1323-1326)。抗体的变异区或其一部分，例如CDR，可在非人类生物(例如，大鼠或小鼠)中产生。可使用嵌合的、CDR移植的和人源化的抗体。在本发明中包括在非人类生物(例如，大鼠或小鼠)中产生并经过修饰(例如在可变框架(variableframework)或恒定区)以降低在人类的抗原性(antigenicity)的抗体。可用本发明
技术领域：
公知的重组DNA技术来制造嵌合抗体(chimericantibody)。例如用限制性酶消化编码鼠(或其它物种)的单克隆抗体分子的Fe恒定区基因，将编码鼠Fe的区域移除，然后取代为编码人类Fe恒定区的基因的等同部分(见，Robinsonetal.,InternationalPatentPublicationPCT/US86/02269;Akira,etal.,EuropeanPatentAppIication184，187;Taniguchi,M.,EuropeanPatentAppIication171，496;Morrisonetal.,EuropeanPatentApplicationl73,494;Neubergeretal.,InternationalApplicationW086/01533;Cabillyetal.U.S.PatentN0.4，816，567;CabiIIyetal.,EuropeanPatentApplicationl25,023;Betteretal.(1988Science240:1041-1043);Liuetal.(1987)PNAS84:3439-3443;Liuetal.,1987,J.1mmunol.139:3521-3526;Sunetal.(1987)PNAS84:214-218;Nishimuraetal.,1987,Cane.Res.47:999-1005;Woodetal.etal(1985)Nature314:446-449;andShawetal.,1988,J.NatlCancerInst.80:1553-1559)。人源化或⑶R移植的抗体中(免疫球蛋白的重或轻链的)至少一个或两个但一般为全部三个接受者(recipient)⑶R被供者⑶R取代。抗体可被非人类⑶R的至少一部分取代或只有CDR中的一些被非人类的CDR取代。只需取代结合人源化抗体或人源化抗体片段所需数量的CDR。优选的供者为啮齿类动物抗体，例如大鼠或小鼠的抗体，以及接受者为人类框架(framework)或人类共有框架(consensusframework)。一般而言，提供⑶R的免疫球蛋白称为“供者”以及提供框架的免疫球蛋白称为“接受者(acceptor)”。在一个实施例中，供者免疫球蛋白是非人类(例如大鼠)的。接受者框架是天然存在(例如人类)或共有的框架，或有约85%或更高，优选90%、95%、99%或更高同一性的序列。此处所使用的“共有序列(consensussequence)”指在相关序列的家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)所形成的序列(参阅，例如Winnaker,FromGenestoClones(Verlagsgesellschaft,ffeinheim,Germanyl987)。在蛋白质家族中，在共有序列中的每个位置被此家族在那个位置最常出现的氨基酸所占据。若两个氨基酸出现的频率相同，两者中的任一个都可包含在共有序列中。“共有框架”指在共有免疫球蛋白序列中的框架区。可通过本
技术领域：
已知的方法将抗体进行人源化。通过取代不直接参与抗原结合的Fv可变区序列为来自人类Fv可变区的等同序列，可产生人源化抗体。用于产生人源化抗体的常用方法由Morrison,S.L.，1985，Science229:1202-1207、Oietal.，1986，BioTechniques4:214、Queenetal.US5,585，089、US5,693，761和US5，693，762提供，其内容引入本文作为参考。那些方法包括分离、操纵和表达核酸序列，其中所述核酸序列编码来自至少一条重链或轻链之一的免疫球蛋白Fv可变区的全部或一部分。此种核酸的来源在本
技术领域：
中是众所周知的，以及例如可从杂交瘤中获得，其中此杂交瘤产生抗感兴趣的多肽或其片段的抗体。可克隆(clone)重组DNA至适当的表达载体，其中此重组DNA编码人源化抗体或其片段。也可将人源化抗体融合至支架，在人源化抗体中，特定的氨基酸已被取代、缺失或增加。优选的人源化抗体在框架区中具有氨基酸取代，如为了改善与抗原的结合。例如人源化抗体具有框架残基，其与供者的框架残基或除了接受者的框架残基之外的其它氨基酸相同。为了产生此种抗体，人源化免疫球蛋白链的经过选择的少量受者框架残基可用对应的供者氨基酸取代。优选的取代位置包括邻接于CDR或能与CDR相互作用的氨基酸残基。从供者选择氨基酸的标准描述于US5，585，089中，其内容引入本文作为参考。将抗体人源化的其它技术描述在Padlanetal.EP519596A1中。本发明也包括核酸，其编码形成本发明的蛋白质复合物的融合多肽。可从噬菌体展示文库筛选出或从表达上述适合的抗体或抗体衍生物的细胞株中分离(例如RT-PCR)核酸。可将核酸与表达载体功能性连接。可使用经核酸或载体转化(transformed)的细胞来制备本发明的融合多肽或蛋白质复合物。用以制备抗体的有用的细胞包括昆虫细胞和哺乳动物细胞(例如，CHO或淋巴细胞(lymphaticcell))。可将本发明的蛋白质复合物和有疗效的部分(therapeuticmoiety)结合，所述有疗效的部分例如细胞毒素(cytotoxin)、治疗剂(therapeuticagent)或放射性离子(radioactiveion)。细胞毒素或细胞毒剂(cytotoxicagent)包括任何对细胞有害的试剂，例子包括紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasinB)、短杆菌素D(gramicidinD)、溴化乙淀(ethidiumbromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、鬼臼乙叉式(etoposide)、鬼臼噻吩式(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春喊(vinblastine)、秋水仙喊(colchicin)、阿霉素(doxorubicin)>柔红霉素(daunorubicin)、二轻基蒽二酮(dihydroxyanthracindione)、盐酸米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycinD)、l_脱氢睾酮(Ι-dehydrotestosterone)、糖皮质素(glucocorticoids)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(Iidocaine)、普蔡洛尔(propranolol)、嘿呤霉素(puromycin)、美登素(maytansinoids)，例如，美登醇(maytansinol)(见，USPatentN0.5,208,020)、CC-1065(见USPatentNos.5，475，092，5，585，499，5，846，545)与其类似物或同源物。治疗试剂包括但不限于，抗代谢剂(antimetabolites)(例如,氨甲蝶呤(methotrexate)、6_巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、6_硫鸟嘌呤核苷(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿卩密唳氨烯咪胺(5_fluorouracildecarbazine))、烧化剂(alkylatingagents)(例如，氮芥(mechlorethamine)、硫喷妥苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、CC-1065、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine,BSNU)与洛莫司汀(lomustine,CCNU)、eyelothosphamide>白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链服菌素(streptozotocin)、丝裂霉素C(mitomycinC)与顺-二氯二氨钼(cis-dichlorodiamineplatinum(II)(DDP)顺钼(cisplatin)))、蒽环类(anthracyclines)(例如，柔红霉素(daunorubicin)(之前称为道诺霉素(daunomycin)))、抗生素(例如，更生霉素(dactinomycin)(之前称为放线菌素)、博来霉素(bleomycin)、光神霉素与氨茴霉素(anthramycin,AMC))以及抗有丝分裂剂(ant1-mitoticagents)(例如，长春新碱)、长春碱、紫杉醇与美登素。放射性离子包括但不限于碘(iodine)、乾(yttrium)与镨(praseodymium)。可利用缀合物(conjugate)来修饰已知的生物反应，药物部分(drugmoiety)不应限于常用的化疗试剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可包括，例如毒素，如相思豆毒素(abrin)、蓖麻蛋白A(ricinA)、假单胞菌外毒素(pseudomonasexotoxin)或白喉毒素(diphtheriatoxin);蛋白质，例如肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor)、α-干扰素(认-1nterferon)、β-干扰素(β-1nterferon)、神经生长因子(nervegrowthfactor)、血小板衍生的生长因子(plateletderivedgrowthfactor)、组织纤溶酶原激活物(tissueplasminogenactivator);或生物应答调节剂(biologicalresponsemodifier),例如，淋巴因子(Iymphokines)、白细胞介素_1(interleukin-1,“IL-1”)、白细胞介素_2(interleukin-2,“IL-2”)、白细胞介素_6(interleukin-6,“11^-6”)、粒细胞-巨卩遼细胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,“GM-CSF，”)、粒细胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor,“G-CSF”)或其它生长因子。前述蛋白质与缀合物依据其异源性结合区的特异性，可用来治疗多种紊乱(disorder)，包括癌症、炎性疾病(inflammationdisease)、代谢疾病(metabolismdisease)、纤维化疾病(brosisdisease)和心血管疾病(cardiovasculardisease)。因此本发明以治疗此种紊乱为特征，例如，通过把有效量(effectiveamount)的本发明蛋白质复合物施用给需要的受试者。可确定被治疗的患者具有以紊乱为特征的情况或是处于此风险中。此方法可单独进行或与其它药物或治疗联合。因为本发明蛋白质复合物具有多特异性的特点，可以用其来连接在一般情况下并不互相结合的分子或细胞。此特征特别对于基于细胞的疗法(cell-basedtherapy)有用。在一个实施例中，蛋白质复合物中的异源性区通过与位于细胞毒性细胞(cytotoxiccell)上的效应抗原(effectorantigen)特异性结合而能够活化细胞毒性细胞(例如细胞毒性T细胞(cytotoxicTcell)),而其它异源性区则特异性结合至位于将被破坏的病原体细胞(pathogencell)或恶性细胞(malignantcell)上的祀向抗原。用这种方式，蛋白质复合物可用来治疗因病原体或有害细胞所导致的紊乱。经由本发明蛋白质复合物与细胞毒素性细胞上作为效应抗原的CD3抗原结合，可活化细胞毒性细胞。其它淋巴样细胞(lymphoidcell)相关的效应抗原包括人类⑶16抗原、NKG2D抗原、NKp46抗原、⑶2抗原、⑶28抗原、⑶25抗原、⑶64抗原和⑶89抗原。与这些效应抗原结合会活化效应细胞，例如，单核细胞(monocyte)、嗜中性粒细胞(neutrophilicgranulocyte)和树突细胞(dendriticcell)。这些被活化的细胞之后会给祀向细胞施加细胞毒性或细胞凋亡作用(apoptoticeffect)。靶向抗原是独特地表达在与疾病情况相关的靶向细胞上的抗原，但是它在细胞健康的情况下不表达或表达程度低或是不可检测。这些与恶性细胞相关的靶向抗原的例子包括EpCAM、CCR5、CD19、HER_2neu、HER-3、HER-4、EGFR、PSMA,CEA,MUC-1(粘液素(mucin))、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5.sub.AC、MUC5.sub.B、MUC7、.beta.hCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神经节糖苷CD3(ganglioside⑶3)、9_0_乙酰_GD3、GM2、GloboH、岩藻糖基GMUPolySA、GD2、碳酸野酶(CarboanhydraseIX(MN/CAIX))、CD44v6、SonicHedgehog(Shh)、Wue_l、衆细胞抗原(PlasmaCellAntigen)、膜结合(membrane-bound)IgE、黑色素瘤硫酸蛋白多糖(MelanomaChondroitinSulfateProteoglycan(MCSP))、CCR8、TNF-α前体、STEAP、间皮素(mesothelin)、A33抗原、前列腺生殖细胞抗原(ProstateStemCellAntigen(PSCA))、Ly-6;桥粒核心糖蛋白4(desmoglein4)、E_I丐粘附素新表位(E-cadherinneoepitope)、胎儿乙酸胆喊受体(FetalAcetylcholineReceptor)、CD25、CA19-9标志(marker)、CA-125标志和第II型缪勒管抑制物质受体(MuellerianInhibitorySubstance(MIS)ReceptortypeII)、sTn(唾液酸化Tn抗原(sialylatedTnantigen;TAG-72))、FAP(纤维母细胞活化抗原(fibroblastactivationantigen))、内皮唾(液)酸蛋白(endosialin)、EGFRv111,LG,SAS和CD63。“治疗”定义为将组合物施用于患者，其目的为治愈、减轻、缓和、治疗、预防或改善紊乱、紊乱的症状、继发于紊乱的疾病状态或易患疾病的诱因(predisposition)。“有效量”为能够例如上述在被治疗的受试者产生医疗满意结果的组合物的量。在体内途径，将有疗效的组合物(例如，包含本发明蛋白质复合物的组合物)施用于受试者。一般而言，将复合物悬浮于可药用的(pharmaceuticallyacceptable)载体(carrier)(例如生理盐水)中，将其以口服、静脉内(intravenous)输注、或皮下(subcutaneous)、肌肉内(intramuscular)、蜘蛛膜下腔(intrathecal)、腹腔内(intraperitoneal)、直肠内(intrarectal)、阴道内(intravaginal)、鼻内(intranasal)、胃内(intragastrical)、气管内(intratracheal)或肺内(intrapulmonary)注射或植入的方式施用。所需剂量取决于所选择的施用途径；配制剂的性质；受试者疾病的性质；受试者的体型、体重、表面积、年龄和性别；所施用的其它药物和主治医师的决定。适当的剂量范围在0.01-100.0mg/kg。基于现有组合物(composition)的多样化和多种施用途径有不同功效的观点，预期剂量需求是多样性的。例如，预期口服施用比静脉内注射施用需要较高的剂量。如本发明领域公知的，可利用标准经验程序(standardempiricalroutines)来调整这些剂量水平的多样性达到最佳。通过将组合物包裹(encapsulate)在常用的适当载体(vehicle)(例如多聚微粒(polymericmicroparticles)或植入装置(implantabledevices))中，可提高传送的效率，特别是对于口服传送而言。本发明的范围也包括药学组合物，其包含可药用的载体和有效量的本发明蛋白质复合物。可使用此药学组合物来治疗上述的紊乱。可药用的载体包括溶剂、分散介质(dispersionmedium)、包衣(coating)、抗菌剂与抗真菌剂、和等渗透压剂与延迟吸收(absorptiondelaying)剂。可利用常用方法将所述组合物配制成用于不同施用方式的剂型(dosageform)。可在体内和体外评价本发明组合物的功效。对于在体内的研究，可注射组合物到动物(例如，小鼠模型)，以及之后记录其治疗功效。根据这个结果，可确定适当的剂量范围和施用方式。下面的实施例仅仅是为了举例说明的目的，绝不是为了从任何角度限制本发明的其它公开。无需更多细节，可以相信本领域技术人员能够根据本文的公开，最大程度地实施本发明。所有引用的出版物都全文引入本文作为参考。实施例1对M13卩遼菌体展示文库(phagedisplaylibrary)进行筛选以鉴定与EGFR特异性结合的人类单链可变片段(scFv)。鉴定一些克隆(clone)。在通过Western印迹和酶联免疫分析(Enzyme-linkedimmunoassay,ELISA)(以下简称ELISA)确认后，选出一个克隆erb_scFv作进一步的实验。获得编码erb_scFv的cDNA,通过标准方法将其连接到表达载体。erb_SCFv的多肽序列为序列识别号:1(SEQIDNO:1)，编码该序列的核苷酸序列为序列识别号:2(SEQIDNO:2)SEQIDNO:1MetAlaGluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyrAlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValSerAspIIeGlyAlaSerGlySerAlaThrSerTyrAlaAspSerValLysGlyArgPheThrIIeSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaLysSerThrThrThrPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlYGlySerGlyGlyGlyGlySerThrAspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGlyAspArgValThrlleThrCysArgAlaSerGlnSerlleSerSerTyrLeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIleTyrAspAlaSerAlaLeuGlnSerGlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlleSerSerLeuGlnProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTyrAlaAspTyrProThrThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIIeLysArgSEQIDNO:2ATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGATATTGGTGCTTCTGGTTCTGCTACATCTTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAATCTACTACTACTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGTATGCTGATTATCCTACTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG之后将表达载体在昆虫细胞系果蝇S2(DrosophilaS2)中表达。纯化抗-EGFR的erb_scFv并进行Western印迹分析和ELISA，来确认其抗EGFR的特异性。进行RT-PCR来从杂交瘤细胞系中获得cDNA，所述cDNA编码抗-CD3单克隆抗体0KT3的重链可变区(Vh)和轻链可变区(Vl)。之后，将两个cDNA连接以产生编码0KT3的Vh-'融合蛋白质的融合序列。此融合蛋白质的序列为序列识别号:3(SEQIDN0:3)，编码该序列的cDNA序列为序列识别号:4(SEQIDNO:4)SEQIDNO:3ValGlnLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuAlaArgProGlyAlaSerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrArgTyrThrMetHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIIeGlyTyrlleAsnProSerArgGlyTyrThrAsnTyrAsnGlnLysPheLysAspLysAlaThrLeuThrThrAspLysSerSerSerThrAlaTyrMetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCysAlaArgTyrTyrAspAspHisTyrCysLeuAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlYGlySerGlyGlyGlyGlySerAspIleValLeuThrGlnSerProAlalleMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrMetThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrMetAsnTrpTyrGlnGlnLysSerGlyThrSerProLysArgTrpIleTyrAspThrSerLysLeuAlaSerGlyValProAlaHisPheArgGlySerGlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrlleSerGlyMetGluAlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTrpSerSerAsnProPheThrPheGlySerGlyThrLysLeuGluLeuLysArgSEQIDNO:4GTCCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGTGCTAACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCACTTCAGGGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCGGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGA`进行相同的步骤来获得编码抗-EGFR单克隆抗体528的Vh和\的cDNA，和编码抗-EGFR的抗体528的Vh-V1融合蛋白质的融合序列。单克隆抗体528和EGFR在细胞膜上，例如在人的表皮样癌(epidermoidcarcinoma)A431细胞上结合。528单链抗体的多肽序列为序列识别号:5(SEQIDN0:5)，编码该序列的cDNA序列为序列识别号:6(SEQIDN0:6)oSEQIDNO:5ValLysLeuGlnGluSerGlySerGluMetAlaArgProGlyAlaSerValLysLeuProCysLysAlaSerGlyAspThrPheThrSerTyrTrpMetHisTrpValLysGlnArgHisGlyHisGlyProGluTrpIIeGlyAsnlleTyrProGlySerGlyGlyThrAsnTyrAlaGluLysPheLysAsnLysValThrLeuThrValAspArgSerSerArgThrValTyrMetHisLeuSerArgLeuThrSerGluAspPheAlaValTyrTyrCysThrArgSerGlyGlyProTyrPhePheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerMetThrGlnThrProLeuSerLeuProValSerLeuGlyAspGlnAlaSerIIeSerCysArgSerSerGlnAsnlIeValHisAsnAsnGlyIIeThrTyrLeuGluTrpTyrLeuGlnArgProGlyGlnSerProLysLeuLeuIIeTyrLysValSerAspArgPheSerGlyValProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLysIIeSerArgValGluAIaGluAspLeuGlyIIeTyrTyrCysPheGlnGlySerHisHisProProThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluSEQIDNO:6GTCAAGCTGCAGGAGTCAGGGTCTGAGATGGCGAGGCCTGGAGCTTCAGTGAAGCTGCCCTGCAAGGCTTCTGGCGACACATTCACCAGTTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCATGGACATGGCCCTGAGTGGATCGGAAATATTTATCCAGGTAGTGGTGGTACTAACTACGCTGAGAAGTTCAAGAACAAGGTCACTCTGACTGTAGACAGGTCCTCCCGCACAGTCTACATGCACCTCAGCAGGCTGACATCTGAGGACTTTGCGGTCTATTATTGTACAAGATCGGGGGGTCCCTACTTCTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTGTACATAATAATGGAATCACCTATTTAGAATGGTACCTGCAAAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCGACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTAGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATCATCCTCCCACGTTCGGCGGGGGGACCAAGCTGGAA编码上述抗-EGFRscFv03,0KT3VH-VL和抗-EGFR抗体528Vh_Vl的cDNA分别与人类迷你胶原蛋白XXICDNA框内融合，所述cDNA在5’末端包含短铰链序列并在3’末端包含组氨酸标签序列。人类迷你胶原蛋白XXI的多肽及其cDNA序列分别为序列识别号:7(SEQIDNO:7)和序列识别号:8(SEQIDNO:8)SEQIDNO:7GlyGlyArgGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProArgSerIIeProGlyProProGlyProIleGlyProGluGlyProArgGlyLeuProGlyLeuProGlyArgAspGlyValProGlyLeuValGlyValProGlyArgProGlyValArgGlyLeuLysGlyLeuProGlyArgAsnGlyGluLysGlySerGlnGlyPheGlyTyrProGlyGluGlnGlyProProGlyProProGlyProGluGlyProProGlylleSerLysGluGlyProProGlyAspProGlyLeuProGlyLysAspGlyAspHisGlyLysProGlyIIeGlnGlyGlnProGlyProProGlylleCysAspProSerLeuCysPheSerValIIeAlaArgArgAspProPheArgLysGlyProAsnTyrSerLeuAspAspSerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGly(注:Pro=脯氨酸或羟基脯氨酸残基)SEQIDNO:8GGCGGCCGCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAGATCTATTCCTGGGCCACCTGGTCCGATAGGCCCAGAGGGTCCCAGAGGATTACCTGGTTTGCCAGGAAGAGATGGTGTTCCTGGATTAGTGGGTGTCCCTGGACGTCCAGGTGTCAGAGGATTAAAAGGCCTACCAGGAAGAAATGGGGAAAAAGGGAGCCAAGGGTTTGGGTATCCTGGAGAACAAGGTCCTCCTGGTCCCCCAGGTCCAGAGGGCCCTCCTGGAATAAGCAAAGAAGGTCCTCCAGGAGACCCAGGTCTCCCTGGCAAAGATGGAGACCATGGAAAACCTGGAATCCAAGGGCAACCAGGCCCCCCAGGCATCTGCGACCCATCACTATGTTTTAGTGTAATTGCCAGAAGAGATCCGTTCAGAAAAGGACCAAACTATAGTCTAGACGACAGCAGCCATCATCACCATCACCATAGCAGCGGC将产生的三个表达载体共转染(co-transfected)到果蚬S2(DrosophilaS2)细胞中。在杀稻瘟菌素(blasticidin)存在时培养这些细胞，以筛选出抗杀稻瘟菌素的细胞。收集细胞培养上清并通过Western印迹和ELISA来筛选出有抗EGFR和⑶3的活性的抗体。发现一些克隆的细胞稳定地表达三股螺旋复合物。这些三股螺旋复合物，如人类迷你胶原蛋白XXI是抵抗热与胃蛋白酶(P印sin)的。更重要的是，它们特异地与EGFR和⑶3结合。实施例2在此实施例中，生成三个融合多肽:0KT3_scFv_Col、erb_scFv_Col和erb_NSPD-scFvo噬菌体文库的筛选通过筛选人类单折叠的(singlefold)scFv卩遼菌体展示文库(TomlinsonI+J;由1.M.TomlinsonandG.Winter,MRCLaboratoryofMolecularBiology,Cambridge,UK友情提供)，来分离erb曬菌粒(phagemid),该erb曬菌粒包含结合表皮生长因子受体胞夕卜区(epidermalgrowthfactorreceptorextracellulardomain,EGFR-ECD)的可变区片段(variablefragment)(scFv)。使用免疫管(immunotube)(Maxisorp;Nunc,Roskilde,Denmark)来进行筛选,其中所述免疫管用10μg经纯化的重组EGF受体(EGFR-ECD;ResearchDiagnostics,Inc.)的胞外区包被(coated)。根据制造商使用手册进行封闭(blocking)、淘选(panning)、清洗、洗脱(elution)和被洗脱的卩遼菌粒的再扩增(reamplification)。重组质体的构建从erb噬菌粒将编码erb的scFv的cDNA通过PCR进行扩增。通过来自0KT3杂交瘤(ATCC,CRL-8001)的逆转录产物，获得鼠的IgG2a抗-CD3mAb(OrthoPharmaceuticalCorporation)的·编码序列。根据公开的核苷酸序列通过RT-PCR获得0KT3mAb的\和Vh的CDNA0通过用甘氨酸接头(glycine-linker)(GGGS)3连接Vh和Vl链，来生成erb和0KT3的scFvPCR融合物。为了生成scFv-Col,scFv-Col的编码区在N末端(N-terminal)包含scFv核苷酸序列并在C末端(C-terminal)包含合成胶原蛋白支架基因，该胶原蛋白支架基因编码EPKSCDKTHTCPPCPRSIP(GPP)1(IGICDPSLCFSVIARRDPFRKGPNY的肽序列，其包含人类IgG的铰链区、胶原蛋白结构域(collageneousdomain)(用下划线标记)和XXI型胶原蛋白的NCl区。合成的胶原蛋白支架多肽及其cDNA的序列分别为序列识别号:9(SEQIDNO:9)和序列识别号:10(SEQIDNO:10)。SEQIDNO:9GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProArgSerlleProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlylleCysAspProSerLeuCysPheSerValIIeAlaArgArgAspProPheArgLysGlyProAsnTyrSEQIDNO:10GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAGATCTATTCCTGGGCCACCTGGTCCCCCAGGTCCTCCAGGACCCCCAGGGCCCCCAGGCCCCCCCGGGCCGCCTGGACCCCCAGGGCCACCAGGCCCCCCAGGCATCTGCGACCCATCACTATGTTTTAGTGTAATTGCCAGAAGAGATCCGTTCAGAAAAGGACCAAACTAT此合成的序列(SEQIDNO:10)通过重叠的PCR以及将两侧具有NotI和XhoI位点的PCR产物克隆到表达载体pSecTag2/Hygro(Invitrogen)的相同位置来制备。将erb与0KT3的scFv在AscI与NotI位点框内克隆到包括上述C末端胶原蛋白支架的构建体(construct)中，以分别制备erb_scFv_Col和0KT3_scFv_Col的表达构建体(expressionconstruct)。之后生成erb_NSPD_scFv。NSPD_scFv的编码区包含人类表面活性蛋白质D(SPD)(胶原凝集素家族的成员)的N末端254个氨基酸和在C末端的scFv。人类表面活性蛋白质D多肽的N末端254个氨基酸与其cDNA序列分别为序列识别号:11(SEQIDNO:11)与序列识别号:12(SEQIDNO:12)SEQIDNO:11MetLeuLeuPheLeuLeuSerAlaLeuValLeuLeuThrGlnProLeuGlyTyrLeuGluAlaGluMetLysThrTyrSerHisArgThrMetProSerAlaCysThrLeuValMetCysSerSerValGluSerGlyLeuProGlYArgAspGlyArgAspGlyArgGluGlyProArgGlyGluLysGlyAspProGlyLeuProGlyAlaAlaGlyGlnAlaGlyMetProGlyGlnAlaGlyProValGlyProLysGlyAspAsnGlySerValGlyGluProGlyProLysGlyAspThrGlyProSerGlyProProGlyProProGlyValProGlyProAlaGlyArgGluGlyProLeuGlyLysGlnGlyAsnlleGlyProGlnGlyLysProGlyProLysGlyGluAlaGlyProLysGlyGluValGlyAlaProGlyMetGlnGlySerAlaGlyAlaArgGlyLeuAlaGlyProLysGlyGluArgGlyValProGlyGluArgGlyValProGlyAsnThrGlyAlaAlaGlySerAlaGlyAlaMetGlyProGlnGlySerProGlyAlaArgGlyProProGlyLeuLysGlyAspLysGlylleProGlyAspLysGlyAlaLysGlyGluSerGlyLeuProAspValAlaSerLeuArgGInGlnValGluAlaLeuGlnGlyGlnValGlnHisLeuGlnAlaAlaPheSerGlnTyrLysLysValGluLeuPheSEQIDNO:12ATGCTGCTCTTCCTCCTCTCTGCACTGGTCCTGCTCACACAGCCCCTGGGCTACCTGGAAGCAGAAATGAAGACCTACTCCCACAGAACAATGCCCAGTGCTTGCACCCTGGTCATGTGTAGCTCAGTGGAGAGTGGCCTGCCTGGTCGCGATGGACGGGATGGGAGAGAGGGCCCTCGGGGCGAGAAGGGGGACCCAGGTTTGCCAGGAGCTGCAGGGCAAGCAGGGATGCCTGGACAAGCTGGCCCAGTTGGGCCCAAAGGGGACAATGGCTCTGTTGGAGAACCTGGACCAAAGGGAGACACTGGGCCAAGTGGACCTCCAGGACCTCCCGGTGTGCCTGGTCCAGCTGGAAGAGAAGGTCCCCTGGGGAAGCAGGGGAACATAGGACCTCAGGGCAAGCCAGGCCCAAAAGGAGAAGCTGGGCCCAAAGGAGAAGTAGGTGCCCCAGGCATGCAGGGCTCGGCAGGGGCAAGAGGCCTCGCAGGCCCTAAGGGAGAGCGAGGTGTCCCTGGTGAGCGTGGAGTCCCTGGAAACACAGGGGCAGCAGGGTCTGCTGGAGCCATGGGTCCCCAGGGAAGTCCAGGTGCCAGGGGACCCCCGGGATTGAAGGGGGACAAAGGCATTCCTGGAGACAAAGGAGCAAAGGGAGAAAGTGGGCTTCCAGATGTTGCTTCTCTGAGGCAGCAGGTTGAGGCCTTACAGGGACAAGTACAGCACCTCCAGGCTGCTTTCTCTCAGTATAAGAAAGTTGAGCTCTTC将N末端SPDcDNA克隆到表达载体pSecTag2/Hygro(Invitrogen)的NheI和AscI位点之间。将erb的scFv框内克隆至包含上述N末端STO的构建体的AscI和XhoI位点，以制备erb_NSPD-scFv的表达构建体。每个erb_scFv_Col、erb_NSPD-scFv和0KT3_scFv_Col的开放读码框(openreadingframe)包含编码N末端前导序列(leadersequence)和以分泌、检测和纯化为目的的C末端myc表位/多聚组氨酸(polyhistidine)标签的序列。表一为通过上述表达构建体编码的多种重组的蛋白质/抗体。表1.本研究中使用的多种抗体分子的综述权利要求1.重组蛋白质复合物，其包含:第一融合多肽链，包含第一支架区和与该第一支架区N端框内融合的第一异源性区；第二融合多肽链，包含第二支架区和与该第二支架区N端框内融合的第三异源性区；以及第三融合多肽链，包含第三支架区和与该第三支架区N端框内融合的第五异源性区；其中所述支架区为SEQIDN0:9，且其中所述第一、第二与第三支架区互相排列以形成三股螺旋卷曲，所述第一、第三、第五异源性区的氨基酸序列为SEQIDN0:1或者所述第一、第三、第五异源性区的氨基酸序列为SEQIDN0:3。2.分离的核酸，其包含编码权利要求1所述的第一融合多肽链的序列。3.宿主细胞，其包含权利要求2所述的核酸，该宿主细胞是真核细胞且包含使脯氨酸残基羟基化的酶活性。4.如权利要求3所述的宿主细胞，其中该细胞是哺乳动物或昆虫的细胞。5.如权利要求4所述的宿主细胞，其中该哺乳动物的细胞为小鼠骨髓瘤NSO细胞。6.产生权利要求1所述的蛋白质复合物的方法，包括:在允许表达由三种核酸编码的多肽并在它们之间形成三股螺旋卷曲的情况下在培养基中培养宿主细胞，该宿主细胞是真核细胞且包含使脯氨酸残基羟基化的酶活性，该宿主细胞包含:编码第一融合多肽链的第一核酸，该第一融合多肽链包含第一支架区和与第一支架区的N端框内融合的第一异源性区域；编码第二融合多肽链的第二核酸，该第二融合多肽链包含第二支架区和与该第二支架区N端框内融合的第三异源性区；和编码第三融合多肽链的第三核酸，该第三融合多肽链包含第三支架区和与该第三支架区N端框内融合的第五异源性区；以及从培养的细胞或该细胞的培养基中纯化该蛋白质复合物，其中所述支架区为SEQIDNO:9，所述第一、第三、第五异源性区的氨基酸序列为SEQIDNO:1或者所述第一、第三、第五异源性区的氨基酸序列为SEQIDNO:3。7.如权利要求6所述的产生蛋白质复合物的方法，其中该宿主细胞为真核细胞，其包含使脯氨酸残基羟基化的酶活性。全文摘要本发明披露了一种蛋白质复合物，其包括形成三股螺旋卷曲的融合多肽链，每条链具有支架区和异源性区。本发明也披露了相关的分离的融合多肽、核酸、载体、宿主细胞及制备方法。文档编号C07K19/00GK103159857SQ20131005650公开日2013年6月19日申请日期2007年5月21日优先权日2007年5月21日发明者周民元,范佳玉,黄娟娟,李秀娟申请人:财团法人工业技术研究院