oire)，这是因为在自性细胞中诱导的溶酶体介导的抗 原加工活动。
[0126] 由经IFN-γ处理的细胞系所产生的非凋亡性的、自噬性肿瘤细胞可以与树突细 胞整合，以增强抗原呈递，这是因为在自噬性肿瘤细胞的表面上高水平的主要组织相容性 复合体。该过程会得到由两种细胞类型融合而产生的新的细胞产物。
[0127] 对IFN-γ的应答时诱导自噬的过程可以以不导致细胞凋亡的方式诱导。通过用 半胱天冬酶抑制剂和干扰素-γ合并处理肿瘤细胞，可以阻断细胞死亡（并最终阻断耐受 性凋亡细胞的形成）的过程，而不抑制自噬的诱导或主要组织相容性II类复合体的增加。
[0128] 消除凋亡细胞同时保留有活力的自噬性细胞的程序
[0129] 黑色素瘤的研究表明在临床试验中凋亡细胞的存在与差生存率之间具有相关性 (Cornforth等（2011)Cancer Immunol. Immunother. 60 :123-131 ;Dillman等（2011)Cancer Biother. Radiopharmaceuticals 26:407-415)。下面研究调查了在体外 IFN-γ 处理黑色 素瘤肿瘤细胞后自噬的诱导、细胞凋亡和MHC II类分子。
[0130] 过滤
[0131] 下面提供"过滤"程序。本发明提供方法以及通过这些方法所产生的细胞，其用于 增强非凋亡性细胞中黑色素瘤细胞群落。在体外IFN-γ处理之前，在任意给定的黑色素瘤 细胞群落中，第一百分数细胞可以偏向于是凋亡性的，并且第二百分数细胞可以偏向于是 非凋亡性的。在本发明上下文中，偏向指的是体外IFN-γ处理刺激第一百分数细胞（或第 一子群落细胞）的细胞凋亡，但不刺激第二百分数细胞（或第二子群落细胞）的细胞凋亡。 在多个实施方式中，可以使用体外IFN-γ处理来富集用于树突细胞疫苗中的黑色素瘤细 胞的免疫学刺激群落，通过迫使偏向于凋亡性的黑色素瘤细胞经历细胞凋亡。一旦偏向于 凋亡性的黑色素瘤细胞的子群落经历细胞凋亡，就可以将这些细胞去除并丢弃。
[0132] 本项研究的方法如下。在测定自噬、细胞凋亡和MHC II类表达之前，用1000IU/mL 的IFN-γ培育自体黑色素瘤肿瘤细胞系和模型黑色素瘤肿瘤细胞系72小时。通过采用对 LC3II的抗体的免疫印迹并通过采用Enzc/ s CytolD?自噬检测试剂盒的流式细胞法，来 检测自噬。通过使用7-AAD和Annexin-V染色和对MHC II类的抗体的流式细胞法，分别测 定细胞凋亡和MHC II类诱导。
[0133] 本研究的结果证明IFN-γ既诱导黑色素瘤细胞系中自噬性细胞群落又诱导凋 亡性的细胞群落。凋亡性的群落主要发现于非粘附群落中，而自噬性细胞保持粘附到烧 瓶上。用抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA)阻断自噬会抑制对IFN-γ应答时MHC II类阳性 细胞的诱导（39. 4% IFN-γ vs. 10. 0% IFN-y+3-MA)。用泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD抑 制半胱天冬酶活性来在经IFN-γ处理的细胞中防止细胞凋亡但不干扰自噬（2. 75±0. 15 IFN- γ vs. 3. 04±0. 27 IFN- γ +Z-VAD，倍数变化）。综上所述，细胞凋亡的诱导与低水平的 自噬和MHC II类诱导有关。本发明提供消除凋亡性的细胞同时保护有活力的自噬性细胞 的方法或程序以及IFN-γ处理能够增强这类基于细胞的免疫治疗的有效性。
[0134] 第一研究的材料和方法
[0135] 自体树突细胞生成
[0136] 通过如前所述的塑料粘附法（Choi 等（1998)Clin. Cancer Res. 4 :2709-2716 ; Luft等（1998) Exp. Hematol. 26 :489-500)，生成树突细胞。简言之，将自体采血术产物进行 ficoll_hypaque(GE Healthcare，Buckinghamshire，United Kingdom)密度梯度分离。将所 得到的外周血单核细胞置于无抗生素的AIM-V培养基中（Invitrogen，Grand Island，NY)， 上述培养基补充有在以15X106cells/mL的细胞培养瓶（Corning_Costar，Corning，NY)中 各 1000IU/mL 的 IL_4(CellGenix， Freisberg， Germany)和 GM_CSF(Beriex， Seattle， WA) (DC培养基）。培育一小时后，丢弃未粘附群落，并将新鲜DC培养基加入到烧瓶中。第二天 早晨，丢弃未粘附细胞，用室温PBS将烧瓶洗涤一次，并加入新鲜DC培养基。然后将烧瓶培 养6天，在这段时间进行流式细胞评估来测定该方法（负载DC之前）所产生的DC的百分 数和表型。
[0137] 自体肿瘤细胞系生成
[0138] 将先前报道的生成和表征的纯肿瘤细胞扩展到2亿个细胞，然后在15% FBS/ ECS 中在 RPMI (完全培养基）中用 1000IU/mL 的 IFN-γ (InterMune，Brisbane，CA)培育 72 小时，用来自铯源的 lOOGy 辐照并冻存（Choi (1998)Clin. Cancer Res. 4 :2709-2716 ; Luft(1998)Exp. Hematol. 26 :489-500 ；Dillman (1993)J.Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 14 :65-69)，如前所述。从冻存中恢复经IFN-γ处理且辐照的肿瘤细胞，用PBS洗 涤3次，然后加入体外培养的DC，并培育约24小时。通过用橡皮淀帚轻轻刮取来收获负载 了抗原的DC，并以相等的量在9-11个等份中冻存。获得细胞的等分部分，用于流式细胞评 价，其代表负载后的DC细胞。
[0139] 流式细胞法
[0140] 使用对从BD Pharmingen San Diego，CA获得的表面标志物的单克隆抗体：结合 PerCp的MHC II类抗体、结合APC的⑶11c抗体，⑶80抗体、⑶83抗体、结合PE的⑶86 抗体，进行树突细胞群落的表型表征。使用同型对照来测定百分阳性细胞。使用来自BD Pharmingen的对结合FITC的MHC I和II类的抗体、Annexin-V-PE和7-氨基放线菌素 D (7-AAD)，进行肿瘤细胞的流式细胞法。在每个批次之前，使用CaliBRITE流式细胞校准 (BD Pharmingen)，并且在流式细胞数据的整个收集过程中使用相同的仪器设定。
[0141] 免疫印迹测定
[0142] 用 Mammalian Protein Extraction Reagent(Thermo Scientific, Rockford, IL)加蛋白酶抑制剂混合物（Roche，Indianapolis，IN)以10, 000细胞/uL在冰上，制备 细胞质的细胞裂解物。将大约25uLs/道的细胞裂解物在12. 5 % Tris-甘氨酸凝胶上分 离，转移到PVDF膜，并用针对如下的抗体进行探测：钙网蛋白（MBL，Woburn，MA)、Hsp-60、 Hsp-70、Hsp-90 (R&D Systems，Minneapolis，MN)、HMBG-1 (Cell Signaling，Danvers，ΜΑ)、 I CAM-1 (Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA)、Mel_4、Mart-1 (Signet，Emeryville，CA)、 酪氨酸酶（Upstate，Lake Placid，NY)和 GADPH(Calbiochem，Darmstadt，Germany)。
[0143] 免疫组织化学
[0144] 使用免疫细胞化学程序，测定黑色素瘤系对一组（panel)抗原的表达。在存在或 不存在1000IU/mL IFN-γ的情况下，在8室培养载玻片（Thermo Fisher，Rochester，NY)中 培养细胞。72小时后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS)洗涤3次，并固定在冷丙酮中。阻断内源性 过氧化物酶后，用适当的对所列抗原的一抗（primary antibodies)培育细胞。使用生物素 化抗鼠（anitmouse)或兔免疫球蛋白、结合超敏感酶的链霉亲和素标记（Super Sensitive enzyme-conjugated streptavidin labeling)和辣根过氧化物酶色原体（chromogen)以及 底物试剂盒（Biogenex，San Ramon，CA)，进行免疫组织化学。采用同型匹配对照抗体，研究 如下抗人多克隆或单克隆抗体的活性：S-100和HMB-45 (Biogenex，San Ramon，CA)、Mel_2、 Mel_5、art-1 (Signet，Dedham，MA)、酪氨酸酶和 Mage-1 (Thermo Scientific，Fremont，CA)、 Melan-A、HLA-I 类和 HLA-II 类（Dako, Denmark)。
[0145] 统计分析
[0146] 在双尾检验的学生t检验中，两样本的方差相等。通过p值< 0. 05确定显著差异。
[0147] 第一研究的结果
[0148] 在完全培养基中，对用IFN-γ培育72小时应答时，在自体黑色素瘤肿瘤细胞系中 差异地引起细胞死亡。在经IFN-γ处理的细胞上或者未经IFN-γ处理的细胞上，进行台 盼蓝拒染料测定，其表明在经IFN-γ处理的细胞中向更低活力的显著趋势（89. 1±6. 8% vs. 84. 9±9. 3%，p = 0. 014，N = 47)。通过流式细胞法分析四个自体黑色素瘤细胞系的样 本的细胞凋亡诱导（图1A)，其表明黑色素瘤细胞对IFN- γ诱导的细胞凋亡差异地敏感，其 中一些细胞显示更迟的细胞凋亡或"死亡"群落（7-AAD+/Annexin-V+)，而其他细胞显示出 更早的细胞凋亡或"即将死亡"群落（7-AAD-/Annexin-V+)的信号。IFN-γ处理后所得到 的凋亡性细胞的存在与无进展生存期和总生存期中显著降低有关（Comforth (2010) Cancer Immunol. Immunother. Resistance to the proapoptotic effects of interferon-gamma on melanoma cells used in patient-specific dendritic cell immunotherapy is associated with improved overall survival) 〇 对数秩检验（log-rank test)表明 iFN_Y处理黑色素瘤肿瘤细胞后较低的活力与所研究患者中总生存期明显相关。
[0149] 将在存在或不存在IFN-γ的情况下发育的细胞裂解物进行各种分子的免疫印 迹，这些分子可能是免疫的重要介导物（图1B)。在用IFN-γ处理的黑色素瘤细胞的设定 中，热休克蛋白似乎被差异性地调控，但基本上仍存在于细胞制剂中，尤其是在hsp-70的 情况下。内质网蛋白、钙网蛋白和高迀移率族蛋白l(HMGB-l)似乎在某些情况下IFN-γ处 理后被正调节（图1B)。相反，普通黑色素瘤抗原（mel-4、Mart-Ι和酪氨酸酶）通常似乎 被IFN-γ负调节，而ICAM-1被显著正调节（图1C)，ICAM-1是一种与对淋巴细胞介导的细 胞毒性的敏感度有关的淋巴细胞黏附分子（Hamai (2008) Cancer Res. 68:9854-9864)。事 实上发现，经IFN-γ处理的黑色素瘤肿瘤细胞对细胞毒性T淋巴细胞（CTL)活性更敏感。 此外，一组黑色素瘤相关抗原的免疫组织化学表明，IFN-γ导致在许多考查的抗原中抗原 表达的负调节（表1)。
[0150] IFN-γ的使用导致主要组织相容性复合体I类和II类的正调节（Bohn (1998) J. Immunol. 161 :897-908)。如图ID中所示，用IFN-γ处理自体黑色素瘤细胞导致几乎普 遍的且显著的MHC I类正调节（p = 2. 8X10 8)，中值倍数诱导（median fold induction) 为2. 91 ±1.13 (95% C. I.)。此外，MHC II类的平均荧光强度也显著较高，但稍逊色（p = 0.039)，中值诱导为4. 23±2. 66(95% C.I.)。在自体黑色素瘤细胞表面上MHC II类分子 的水平通常低于MHC I类分子，但在70%的情况下，对IFN-γ处理应答时对于MHC II类分 子来说诱导高2倍，这是因为MHC II类表达的低初始水平。在抗原负载到树突细胞上时， 肿瘤细胞上这些分子的存在可以提供将MHC复合体"易装"（"cross dressing"）到抗原呈 递细胞上的机会（Dolan (2006) J. Immunol. 277 :6018-6024, Dolan (2006) J. Immunol. 176 : 1447-1455)。
[0151] 用IFN-γ培育一组四个代表性自体黑色素瘤细胞系，并等量负载到树突细胞上， 然后通过流式细胞法测定⑶80、⑶83、⑶86和MHC II类的表达。结果表明，在负载经IFN- γ 处理的黑色素瘤细胞后，观察到表达CD83的树突细胞的阳性群落百分数的小幅但明显增 加（图2)。此外，在⑶86散点图（左上象限）中标出更多的未经处理的肿瘤细胞，结果是 CD86阳性群落百分数明显减少，表明未经IFN-γ处理的肿瘤细胞仍然存在。此效果最可能 地是由于IFN-γ诱导细胞凋亡，因为凋亡性细胞更可能被之前报告的树突细胞吞噬。
[0152] 如图3中所示，负载前DC的样本表明其表达CD80 (39. 0± 16. 2 % )、 CD83(7. 1±6.9%)、CD86(73.6±19.5%)并且是MHC II 类阳性的，并且具有 96·2±5·0% 活力。负载的DC具有显著更高百分数的⑶83(9. 4±7. 1%，ρ = 0.019)和显著更高的平均 荧光强度（172. 9±79.0，ρ = 0.0009)，表明用经辐照的、IFN-γ处理的肿瘤细胞负载DC在 一些树突细胞中诱导成熟（图3B)。
[0153] 第一研究讨论
[0154] 在抗肿瘤免疫的上下文中，抗原负载、成熟和施用的方案以及在基于树突 细胞（DC)的免疫治疗的指导是本领域技术人员已知的。这种类型的治疗包含经纯 化的自体肿瘤细胞作用抗原的来源的用途，并且包含与肿瘤相关抗原的患者特异库 (repertoire) (Selvan(2010)Melanoma Res. 20 :280-292 ；Diliman(2007)Cancer Biother. Radiopharm. 22 :309-321)。一些临床试验使用未纯化的自体实体（bulk)肿瘤。这种抗 原来源可能具有已污染的成纤维细胞和坏死组织（〇' R〇urke(2007)Melanoma Res.17: 316-322)。与肿瘤干细胞有关的抗原可以存在于经纯化的细胞系中（Dillman(2006)New Engl.J.Med. 355:1179-1181)。IFN-γ 处理提高 MHC II 类分子的表达。MHC II 类分子 对于对基于树突细胞的治疗的应答非常重要。存在于吞噬物质中的分子（诸如钙网蛋 白、