已被诊断为黑色素瘤并且此前已得到成功 治疗以消除黑色素瘤（或者经历过自动完全痊愈），并且其中在根除后预防性施用。
[0099] 肿瘤抗原
[0100] 本发明的黑色素瘤细胞表达Mage、Mart-l、Mel-5、HMB45、S100或酪氨酸酶中的一 种或多种（Dillman 等（2011)Cancer Biotherapy Radiopharmaceuticals 26:407-415)， 但并不限于此。在一个方面，肿瘤抗原的检测使用未暴露于IFN-γ的细胞，而在另一方面， 肿瘤抗原的检测在经IFN-γ处理的细胞上进行（参见例如Cornforth等（2011)Cancer Biotherapy Radiopharmaceuticals 26 :345-351)。本发明包含表达一种或多种黑色素瘤 抗原或者包含一种或多种分离的黑色素瘤抗原的组合物的黑色素瘤细胞，如Dubensky的 US2007/0207171所公开的，其通过引用以其全文并入本文。
[0101] 测定细胞凋亡
[0102] 可以使用多种试剂来检测或测定细胞凋亡，例如荧光染料标记的膜联蛋白，通过 用染料诸如碘化丙烷和7-氨基放线菌素 D(7_AAD)染色，通过测定线粒体内膜势的损失， 通过测定半胱天冬酶的活化或裂解。参见例如George等（2004) Cytometry Part A.59A: 237-245。细胞凋亡的早期活动是磷脂酰丝氨酸暴露于质膜的外表面，其可以通过荧光染料 标记的膜联蛋白检测。可用的方法能够区分活细胞、坏死细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡细 胞。本发明使用通过7-ADD测定为非凋亡性的黑色素瘤细胞、通过膜联蛋白V测定为非凋亡 性的黑色素瘤细胞、在IFN-γ处理后经凋亡性测定为非凋亡性的黑色素瘤细胞（Dillman 等（2011) Cancer Biotherapy Radiopharmaceuticals 26 :407-415)、或者通过一种或多种 生物标志物Bcl-2、半胱天冬酶-3、P53或存活素测定为非凋亡性的黑色素瘤细胞（Karam等 (2007)Lancet Oncol. 8 :128-136)。本发明的药物组合物、试剂和相关方法排除经IFN-γ 处理的凋亡性的黑色素瘤细胞，其中根据例如Herlyn等的美国专利No. 7544465、Thorpe等 的美国专利7714109来测定细胞凋亡，其通过引用并入本文。
[0103] 测定自噬
[0104] 自噬是用于降解许多蛋白质和某些细胞器的自然存在的过程。自噬介导蛋白质 和细胞器周转、饥饿应答、细胞分化、细胞死亡等。与微管相关的蛋白轻链3(1X3)监测自 噬。在一种方法中，可以通过测量LC3的转化来检测自噬，其涉及LC3-I或LC3-II的转化。 LC3-II的量与自噬体的数目相关。具体来说，LC3是细胞溶质的且可溶的，而LC3-II存在 于膜上。LC3-II具有更大的分子量，因为其与脂质结合（conjugated)。可以测量1X3*1， 例如通过western印迹，而自、自小泡和自体可以通过显微镜测定。自可以是定量 的，例如通过检测加工的LC3-II、通过早期与晚期自·性区室（compartment)之间的比例、 或者通过自·体积。参见（Mizushima和 Yoshimori (2007) Autophagy 3 :542-546 :634-641 ; Tanida 等（2008)Methods Mol Biol. 445 :77-88 ;Eng.等（2010) Autophagy 6:634-641)。 在一个方面，本发明使用自噬作为筛选工具，用于选择合适的自噬性癌细胞，其中可以根据 在一个或多个具体阶段中自噬的出现来选择细胞。这些自噬阶段包括：（1)通过自噬体隔 离胞质区室，（2)使用溶酶体融合自噬体，以形成自溶酶体，并且（3)通过溶酶体内的蛋白 酶来降解自溶酶体内容物。在另一个方面，本发明包括主要显示第一阶段、主要显示第二阶 段、主要显示第三阶段、主要显示所有三个阶段的细胞。在另外一个方面，本发明包含显示 第一阶段、第二阶段、第三阶段、第一和第二、第二和第三阶段或者显示所有三个阶段的细 胞。
[0105] 干扰素 -γ (IFN-γ)信号传导
[0106] IFN-γ (II型干扰素）信号传导依赖于一些基因的表达，诸如IFN-γ受体、STAT1、 STAT2、STAT1 同源二聚体、STAT1/STAT2 异源二聚体、IRF-UGAS 和 IRF-E。研究表示 IFN-γ 信号传导依赖于IFN-γ受体（IFNGR1链；IFNGR2链）。细胞表面上IFNGR的低表达能够 阻断 IFN-γ 信号传导的某些方面（Schroder 等（2004) J. Leukocyte boil. 75:163-189)。 在一个方面，本发明排除使用表现出IFNGR的低表面表达的癌细胞。在另一个方面，本发 明筛选表达STAT1同源二聚体的那些癌细胞，使用这些细胞，并且基本上排除那些不表达 STAT1同源二聚体的细胞。在另外一个方面，本发明考虑筛选那些具有STAT1磷酸化（丝 氨酸-727)的细胞。本发明还考虑排除来自具有STAT1基因中功能突变缺失的患者的癌 细胞（参见例如 Dupuis 等（2001) Science 293 :300-303 ;Schroder 等（2004) J. Leukoc. Biol. 75 :163-189)。下面关注IRF基团家族。RF-UIRF-2和IRF-9均参与IFN-γ信号传 导。本发明涵盖了使用表达这些IRF基因族基因中的一种或多种基因的癌细胞，或者排除 未表达这些基因中一种或多种的癌细胞。
[0107] IFN-γ应答基因
[0108] 在一些示例性实施方式中，本发明包含生物材料、组合物、试剂和方法，其要 求使用对IFN-γ应答的黑色素瘤细胞或肿瘤前期的黑色素瘤细胞。可以通过一种 或多种IFN-γ应答基团的表达测定，来确认、区分和选择黑色素瘤细胞。已经确认 了许多 IFN-γ 应答基团（参见例如 Halonen 等（2006) J. Neuroimmunol. 175 :19-30 ; MacMicking(2004) 11 :601-609 ;Boehm 等（1997) 15 :749-795)。所述测定可以涉及从患者 中去除一种或多种黑色素瘤细胞、在添加的IFN-γ存在和不存在情况下培养细胞、并确定 对IFN-γ的应答。在该测定中，IFN-γ诱导的基因表达可以通过对以下敏感的试验来检 测，上述试验对以下敏感：转录因子结合到IFN-γ诱导的基因的启动子、IFN-γ诱导的基 因的mRNA的表达、表达的多肽等等。IFN-γ应答基因可以包括例如，用于免疫应答、编码转 录因子、转运蛋白质的基因、细胞凋亡基因、用于细胞生长或维持的基因、用于脂质代谢的 基因、介导胞吞或胞吐的基因、胞内信号传导基因、糖代谢基因、细胞粘附基因以及无确定 功能（established function)的基因。
[0109] 在一个方面，本发明排除使用IFN-γ处理时具有以下特点的黑色素瘤细胞：表现 出MHC II类表达降低，在MHC II类的表达方面未表现出可检测到的变化，表现出MHC II 类表达增加10%或更少，表现出MHC II类表达增加15%或更少，表现出MHC II类表达增 加20 %或更少、25 %或更少、30 %或更少、40 %或更少、50 %或更少等等。在一个方面，百分 数的值指的是存在于来自给定受试者或患者的活检或部分活检中的黑色素瘤细胞群落的 平均表达值。
[0110] 用于筛选IFN-γ应答癌细胞的IFN-γ诱导基因的非限制性列表
[0111] ab000677, JAB/S0CS1 ;m63961，IFN-γ 诱导蛋白（mag-1) ;m35590,巨噬细胞炎性 蛋白 l-β ;ml9681，MCP-l(JE) ;y07711，zyxin;M34815, IFN-γ 诱导的单核因子（MIG); m33266,干扰素诱导蛋白10(IP-10) ;U44731，嘌呤核苷酸结合蛋白；U88328,细胞因子信号 传导抑制因子 _3(Sup.of cytokine signalling-3，S0CS-3) ;M21065,干扰素调节因子 1; M63630, GTP 结合蛋白（IRG-47) ;U19119, G-蛋白样 LRG-47 ;L27990, Ro 蛋白；M31419,204 干扰素活化蛋白；af022371，干扰素诱导蛋白203 ;U28404，MIP-1 α受体；U43085,糖皮质激 素减弱反应基因 39 (Glucocorticoid-attenuated response 39) ;x56123，Talin;m31419， 204干扰素活化蛋白；U53219, GTPase IGTP;I38444, T细胞特异蛋白；M31418,202干扰素 活化蛋白；d38417,芳香经（Arylhydrocarbon)受体；m26071，组织因子（mtf) ;D13759，Cot 原癌基因 ；Μ 18194,纤维连接蛋白；u59463, ICH-3 ;M 13945, pim-1 原癌基因；L20450, DNA 结合蛋白（参见 Gil 等（2001)Proc.Natl.Acad.Sci 98:6680-6685)。本发明包含 IFN-γ 诱导基因 CIITA(参见例如 Chan 等（2010) J. Leukocyte Biol. 88 :303-311 ;Kwon 等（2007) Mol. Immunol. 44 :2841-2849)的用途。
[0112] 本发明包含对如下IFN-γ诱导基因中一种或多种的表达的测量，作为用于确认 施用药物的患者的资格或选择施用药物的患者的筛选过程。这些基因包括：（基因1)FCGR1 A、（基因 2)IL6R、（基因 3)CXCL9、（基因 4)CLCSF 14、（基因 5)UBD、（基因 6)C/EBPalpha 和（基因 7)MHC2TA(CIITA)(参见 Waddell 等（2010)PL〇S ONE 5 :e9753)。还包括这些基 因的特定簇在确认资格过程中的用途，例如基因1和2、2和3、3和4、4和5、5和6、6和7、 1和3、1和4、1和5、1和6、1和7、2和4、2和5、2和6、2和7、3和5、3和6、3和7、4和6、 4和7、5和7以及这些基因的组合，例如1、2、3 ;或3、4、5 ;或4、5、6 ;或5、6、7 ;或1、3、4 ;或 1、3、5,或 1、3、6,或 1、3、7 ;或 1、2、4 ;或 1、2、5 ;或 1、2、6 ;或 1、2、7 等等。（这些基因编号 是任意的。）
[0113] 干扰素-γ处理
[0114] 包含暴露于IFN-γ处理的黑色素瘤细胞的试剂和相关方法说明如下。
[0115] 本发明包含如下细胞，其中IFN-γ应答基因的诱导为至少20% (对照值的1. 2 倍）、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少 100% (对照值的2. 0倍）、至少2. 5倍、至少3. 0倍、至少4. 0倍等。
[0116] 本发明排除的是具有以下特征的黑色素瘤细胞群，其中在IFN-γ处理后，小于 90 %是自噬性的、小于80 %是自噬性、小于70 %是自噬性、小于60 %是自噬性、小于50 %是 自噬性、小于40 %是自噬性等等。
[0117] 本发明排除的是具有以下特征的黑色素瘤细胞群，其中在IFN-γ处理后，小于 90%是非凋亡性的、小于80%是非凋亡性的、小于70%是非凋亡性的、小于60%是非凋亡 性的、小于50%是非凋亡性的、小于40%是非凋亡性的等等。
[0118] 本发明排除的是具有以下特征的黑色素瘤细胞群，其中在IFN-γ处理后，小于 90%是非粘附性的、小于80%是非粘附性的、小于70%是非粘附性的、小于60%是非粘附 性的、小于50%是非粘附性的、小于40%是非粘附性的等等。
[0119] 测量MHCII类的表达
[0120] 使用对MHC II类基因产物特异的抗体或核酸探针，可以测量MHC II类的表达。这 些 MHC II 类产物包括 HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DRB1 以及 HLA-DM 和 HLA-D0 (参见例如 Apostolopoulos.等（2008) Human Vaccines 4:400-409)。
[0121] 例如，本发明包含试剂、治疗方法和诊断方法，其要求黑色素瘤细胞表达STAT1和 STAT2,从而具有活性STAT1信号传导通路、具有活性STAT2信号传导通路或者具有活性 STAT1和STAT2信号传导通路。
[0122] 本发明提供药物组合物或药物试剂、相关施用方法以及治疗方法，其导致以下生 存数据：危害比（hazard ratio, HR)小于1. 0、HR小于0· 9、HR小于0· 8、HR小于0· 7、HR 小于0. 6、HR小于0. 5、HR小于0. 4、HR小于0. 3等。本发明结果可以为总生存数据、无进 展生存数据、疾病进展时间数据等。本发明还提供至少40%、至少50%、至少60%、至少 70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %等的6月PFS。此外，本发明提 供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、 至少95 %等的6月总生存率/期。此外，本发明提供至少40 %、至少50 %、至少60 %、至 少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的1年（或2年）PFS。 此外，本发明提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%、至少90%、至少95%等的1年（或2年）总生存率（参见例如U.S.D印t. of Health and Human Services. Food and Drug Administration. Guidance for Industry. Clinical trial endpoints for the approval of cancer drugs and biologies (April 2005))。
[0123] IFN-γ的使用和自噬的诱导
[0124] 在IFN- γ处理后诱导自噬是一种确定对系统性（systemic) IFN- γ处理的应答的 方法，如通过增加主要组织相容性II类复合体测定。如果在暴露于培养基中IFN-γ后， 活检的黑色素瘤肿瘤细胞的可测量的群落发生自噬而不是细胞凋亡，则这表明这些患者将 有利地对系统性IFN-γ处理应答。此外，如果从活检中确定了成功细胞系，患者也会从 细胞治疗产品受益，该细胞治疗产品由来自自噬性但非凋亡性粘附（adherent)群落的经 IFN-γ处理的纯化的肿瘤细胞系制得。
[0125] 本发明包含分离和表征从自噬性、非凋亡性细胞所分离的主要组织相容性复合 体，上述细胞是从用干扰素-γ处理的肿瘤细胞系收集的。主要组织相容性复合体包含对 CD4+T细胞特异的抗原，并且已经与抗体介导的免疫应答相关。复合体代表不会存在于非自 性细胞中的大型抗原库（repert