一种用于治疗肝癌的肿瘤疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤疫苗领域，具体涉及一种治疗效果改进的肝癌疫苗，以及该肝癌 疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002] 我国原发性肝癌中90%以上为肝细胞癌（HCC)，其次为胆管细胞癌，男女发病率 比为2~5 :1。肿瘤细胞具有抗原性，能引起机体产生免疫应答，这是肿瘤免疫治疗的理论 基础。近年来，由于分子免疫学、细胞生物学和生物工程技术的发展，使肿瘤疫苗、单克隆抗 体、细胞因子、免疫活性细胞输注及基因转移技术等的临床应用成为可能，使肝癌的免疫治 疗研究有了巨大发展。尤其是肝癌疫苗备受关注，已成为肝癌免疫治疗的研究热点之一。运 用肝癌细胞、肝癌抗原、树突状细胞及核酸为基础构建的肝癌疫苗，通过激发机体的免疫系 统，诱导机体产生针对肝癌特异性抗原的免疫应答，达到杀灭表达肝癌抗原的肿瘤细胞而 产生抗肿瘤效应的目的。通过临床试验发现，肝癌疫苗可以减少肝癌的复发转移、改善患者 生存质量以及延长存活时间，已成为肝癌综合治疗的重要部分。
[0003] 虽然国内外对肿瘤疫苗的相关研究很多，但到目前为止取得突破性进展的却不多 见，存在的主要问题有：将DNA导入到特定细胞进行表达这一技术尚不成熟，并且使用外 源DNA的安全性问题尚未解决；由于肿瘤细胞呈现高度异质性，属于同一类型肿瘤的多个 瘤细胞上可以表达不同的抗原，由一种肿瘤抗原所激活的T细胞只能杀伤一部分的肿瘤细 胞，不表达该抗原的瘤细胞则不能被杀伤；肿瘤细胞疫苗虽然可以包含几乎全部的肿瘤抗 原，但目前的研究表明其激活T细胞的作用有限，将其作为疫苗的效果并不理想。因此，如 何提供一种肿瘤疫苗，不存在使用安全性问题并且能对几乎全部的肿瘤抗原有效，成为有 待解决的问题。
[0004] Exosomes是一类起源于内吞体系统并被排出于细胞外、直径在40-100nm之间的 双层膜性囊泡。Exosomes可以由包括树突状细胞、肿瘤细胞等在内的多种细胞分泌，含有大 量与其来源和功能密切相关的蛋白质和脂质成分，作为细胞间传递信息的重要载体，参与 多种病理生理过程。肿瘤细胞来源的exosomes含有肿瘤共同抗原、热体克蛋白等重要的免 疫分子，可通过多种途径表现出抗肿瘤作用，且其作为一种新型的肿瘤疫苗，较DC疫苗有 明显的优势。
[0005] 然而，近年来却有一些相关实验显示，一些肿瘤来源的exosomes可以抑制甚至是 破坏在肿瘤中发挥作用的免疫细胞，比如下调一些NK受体的表达，影响到肿瘤免疫中一些 固有免疫细胞的激活，还有的可以显著抑制IL-2从而抑制人类淋巴细胞的增殖，因而在肿 瘤的免疫治疗中起到一些负面作用。这些由肿瘤来源的exosomes可能就是肿瘤组织逃逸 机体免疫系统清除的关键因素，给肿瘤的免疫治疗带来很多困难和挑战。因此，如何提高肿 瘤细胞来源exosomes的免疫刺激能力，而减少它的免疫抑制能力在肿瘤的免疫治疗中有 重大的实际意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种对淋巴细胞增殖功能没有抑制作用的肝癌疫苗。
[0007] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0008] -种治疗效果改进的肝癌疫苗，包括肝癌细胞分泌的exosomes小体，所述的肝癌 细胞是经过Cephaloziellins J和SAHA联合加药处理的，Cephaloziellins J和SAHA的 摩尔浓度之比为0. 8~1. 2:1。
[0009] 进一步地，Cephaloziellins J和SAHA的摩尔浓度之比为1: 1。
[0010] 进一步地，所述的治疗效果改进的肝癌疫苗还包括佐剂。
[0011] 进一步地，所述佐剂为为铝佐剂。
[0012] 所述的肝癌疫苗的制备方法，包括如下步骤：肝癌细胞用含胎牛血清的DMEI培养 液在C0J?箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，每3~4天传代1次，待细胞生长至对数期时 接种；接种24h后，用C印haloziellins J和SAHA加药处理细胞，继续培养24h后收集培养 上清液，低温保存；将收集到的肝癌细胞培养上清液离心去除细胞，取上清液；再离心去除 细胞碎片，收集上清液，浓缩超滤，离心得到浓缩液，将分离纯化的浓缩液移至离心管中，低 温条件下超速离心，所得沉淀即含有exosomes小体。
[0013] 进一步地，所述的制备方法包括如下步骤：肝癌细胞用含100ml/L胎牛血清 的DMEI培养液，在37°C 50ml/L C02孵箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，每3~4天传 代1次，待细胞生长至对数期时按3 X 106/100ml接种；接种24h后用1 X 10 6mol/L的 C印halozie 11 ins J和1 X 10 6mo 1/L的SAHA处理细胞，继续培养24h后收集培养上清 液，4°C保存；将收集到的肝癌细胞培养上清液300g离心10min去除细胞，取上清液；再以 1500g离心30min去除细胞碎片，收集上清液，通过100kU MffCO Centriplus离心超滤管浓 缩超滤，以1500g离心30min得到浓缩液，将分离纯化的浓缩液移至离心管中，4°C条件下用 水平转角以l〇〇kg超速离心60min，所得沉淀即含有exosomes小体。
[0014] 所述的肝癌疫苗在制备抗肝癌的药物中应用。
[0015] 本发明的优点：已知未经处理的肝癌细胞分泌的纳米级小囊泡exosomes及 其可溶性免疫分子对淋巴细胞增殖功能具有显著的抑制作用。本发明创造性地使 用Cephaloziellins J和SAHA加药处理肝癌细胞，结果表明，处理后的肝癌细胞分泌 的exosomes及其可溶性免疫分子则能显著改善前述的抑制作用。本发明显著提高了 exosomes肿瘤疫苗治疗效果，具有重要的临床应用价值。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。实施 例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条 件，或按照制造厂商所建议的条件。Cephaloziellins J的化学结构和制备方法参见文献： Secondary Metabolites from the Chinese Liverwort Cephaloziella kiaeri? J. Nat. Prod. ，2013,76,1700-1708。
[0017] 实施例1 :细胞培养
[0018] 实验材料：H22-H8D8细胞株、10%胎牛血清、青链霉素混合液（北京泰格美公司）。
[0019] 实验方法：将1122-!1808细胞株培养于含10%胎牛血清、青霉素10011]/1^、链 霉素100X yg/mL的DMEI培养液中，37°C 5% C0J?箱中培养，待生长至对数期时，按 3 X 106/100ml 接种。
[0020] 实施例2 :药物处理
[0021] 实验材料：Cephaloziellins J 自制，制备方法同文献（Secondary Metabolites from the Chinese Liverwort Cephaloziella kiaeri，J.Nat. Prod·，2013,76， 1700-1708)，经鉴定为 Cephaloziellins J;SAHA 购自 sigma 公司。
[0022] 实验分组：细胞培养液体积每组严格一致，空白对照组、exosomes对照组（不加 药组）、exosomes 实验组 1 (加药 Cephaloziellins J)、exosomes 实验组 2 (加药 SAHA)、 exosomes 实验组 3 (Cephaloziellins J 和 SAHA 联合加药）。
[0023] 实验方法：对照组，接种后不加药物，24h后收集上清液150ml作为对照；加药组 1，接种24h后用浓度1 X 10 6mol/L的C印haloziellins J处理，在加药24h后收集培养上清 液150ml ;加药组2,接种24h后用浓度1 X 10 6mol/L的SAHA处理，在加药24h后收集培养 上清液 150ml ;加药组 3,接种 24h 后用 1 X 10 6mol/L 的 Cephaloziellins J 和 1 X 10 6mol/ L的SAHA处理，在加药24h后收集培养上清液150ml，并4°C保存。
[0024] 实施例3 :药物处理
[0025] 实验材料：Cephaloziellins J 自制，制备方法同文献（Secondary Metabolites from the Chinese Liverwort Cephaloziella kiaeri，J.Nat. Prod·，2013,76， 1700-1708)，经鉴定为 Cephaloziellins J;SAHA 购自 sigma 公司。
[0026] 实验分组：细胞培养液体积每组严格一致，空白对照组、exosomes对照组（不加 药组）、exosomes 实验组 1 (加药 Cephaloziellins J)、exosomes 实验组 2 (加药 SAHA)、 exosomes 实验组 3 (Cephaloziellins J 和 SAHA 联合加药）。
[0027] 实验方法：对照组，接种后不加药物，24h后收集上清液150ml作为对照；加药组 1，接种24h后用浓度1 X 10 6mol/L的C印haloziellins J处理，在加药24h后收集培养上清 液150ml ;加药组2,接种24h后用浓度1 X 10 6mol/L的SAHA处理，在加药24h后收集培养上 清液 150ml ;加药组 3,接种 24h 后用 0· 8 X 10 6mol/L 的 Cephaloziellins J 和 1 X 10 6mol/ L的SAHA处理，在加药24h后收集培养上清液150ml，并4°C保存。
[0028] 实施例4 :药物处理
[0029] 实验材料：Cephaloziellins J 自制，制备方法同文献（Secondary Metabolites from the Chinese Liverwort Cephaloziella kiaeri, J.Nat. Prod. ,2013,76, 1700-1708)，经鉴定为 Cephaloziellins J;SAHA 购自 sigma 公司。
[0030] 实验分组：细胞培养液体积每组严格一致，空白对照组、exosomes对照组（不加 药组）、exosomes 实验组 1 (加药 Cephaloziellins J)、exosomes 实验组 2 (加药 SAHA)、 exosomes 实验组 3 (Cephaloziellins J 和 SAHA 联合加药）。
[0031] 实验方法：对照组，接种后不加药物，24h后收集上清液150ml作为对照；加药组 1，接种24h后用浓度1 X 10 6mol/L的C印haloziellins J处理，在加药24h后收集培养上清 液150ml ;加药组2,接种24h后用浓度1 X 10 6mol/L的SAHA处理，在加药24h后收集培养上 清液 150ml ;加药组 3,接种 24h 后用 1. 2 X 10 6mol/L 的 Cephaloziellins J 和 1 X 10 6mol/ L的SAHA处理，在加药24h后收集培养上清液150ml，并4°C保存。
[0032] 实施例5 :exosomes的分离与纯化