一种提取、分离三斑海马脂溶性成分的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物提取技术领域，涉及一种提取、分离三斑海马脂溶性成分的方法。
【背景技术】
[0002] 炎症是机体对感染、病原菌侵入或细胞损伤做出的防御反应。它的基本生物过程 是疾病最常见的信号。在大多数情况下炎症是通过内源抗炎介质和细胞内负调节因子的积 累而得到缓解。然而，持续的积累和激活时慢性炎症的标志，将会导致这些负调节机制的功 能紊乱。因此，加强和加速炎症的限制和解决是开发抗炎药物的关键。
[0003] 近年来，从天然产物中提取抗炎活性物质因为来源安全和广泛、副作用小而得到 越来越多的关注。海洋生物居住在复杂的栖息环境，产生次生代谢产物等，含有独特的一系 列生物分子，因而海洋资源是寻求抗炎药物的巨大宝库。
[0004] 三斑海马是包括中国在内一些亚洲国家名贵药材，据中国古典药籍记载其具有补 肾壮阳、温通血脉、镇静安神、散结消肿、舒筋活络功效等功效。现代药理学研究表明其具有 抗氧化、抗肿瘤、抗菌等生理活性，其与磷脂、留醇、氨基酸、微量元素等有关。其中，脂溶性 组分是主要的功效组分，但其中含有不少胆固醇。目前市场上主要的三斑海马产品是海马 酒、海马追风油等，动物组织的脂溶性组分普遍存在胆固醇。
[0005] 胆固醇存在于动物的所有组织中，是动物体维持正常生理活动所必需的。但人体 摄入过多的胆固醇将引起高血脂，并进而引发一系列心血管疾病，所以控制饮食中胆固醇 的摄入是现代饮食所提倡的方式。
[0006] 动物组织胆固醇的脱除方法目前有有机溶剂抽提、超临界二氧化碳萃取、P_环状 糊精包埋等物理方法及乳酸杆菌分解等生物学方法，成本高，或机制不明确，产生的其他代 谢产物干扰其他营养物的吸收等一系列不利因素而其使用受到限制。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种提取、分离三斑海马脂溶性成分的方法，用以从三斑海 马中筛选、提取出抗炎活性较强的脂溶性生物活性物质，并脱除其中的胆固醇。
[0008] 本发明所采用的技术方案是，一种提取、分离三斑海马脂溶性成分的方法，具体按 以下步骤实施：
[0009]步骤1，提取脂溶性成分：
[0010] 1.1:采用乙醇溶液回流提取三斑海马粉体，获得乙醇粗提取液；
[0011] 1. 2 :对乙醇粗提液进行抽滤，滤渣重复抽滤操作多次，合并滤液减压蒸发除去溶 剂，获得浸膏状乙醇粗提物；
[0012] 1. 3 :对浸膏状乙醇粗提物进行有机溶剂萃取，得到三斑海马脂溶性成分；
[0013] 步骤2,确定脂溶性成分最大紫外吸光峰的波长；
[0014] 步骤3,以步骤测得的三斑海马脂溶性成分最大紫外吸光峰波长为检测波长，对脂 溶性成分进行中压制备与纯化色谱硅胶柱层析分离、洗脱，然后收集每个洗脱峰，浓缩至浸 膏、O°c冷冻干燥，得到去除胆固醇的三斑海马脂溶性分离物。
[0015] 本发明特点还在于，
[0016] 步骤I. 1具体为：将三斑海马干燥体用自来水冲洗除去污泥、沙子，干燥后粉碎、 过筛得到三斑海马粉体，将三斑海马粉体与质量分数为70 % -95 %的乙醇溶液混合，在 80°C下回流lh-2h，得到乙醇粗提液。
[0017]干燥温度为50_60°C，干燥时间24_36h;过筛规格为20-40目。
[0018] 三斑海马粉体与乙醇溶液的料液比为I:8-12g/ml。
[0019] 步骤1. 3具体为：将浸膏状乙醇粗提物与去离子水混合，然后加入石油醚，萃取， 取上层石油醚相，重复萃取多次，合并所有萃取得到的石油醚相，45_55°C减压蒸发浓缩浸 膏后，0 °C冷冻干燥，得到三斑海马脂溶性成分。
[0020] 浸膏状乙醇粗提物与去离子水的质量体积比为I:8-12g/ml，石油醚的加入量与 浸膏状乙醇粗提物和去离子水的混合物等体积。
[0021] 步骤2具体为：取步骤1得到的三斑海马脂溶性成分，在石油醚中溶解，涡旋混匀， 以溶剂石油醚为空白，400-190nm紫外光谱扫描，获取扫描图谱，得到三斑海马脂溶性成分 在205nm波长下具有最大吸收峰。
[0022] 步骤3中中压制备与纯化色谱硅胶柱层析分离参数具体为：进样量：0. 5-2.OmL; 检测波长：205nm，监测波长：210nm。
[0023] 步骤3中洗脱为台阶/线性梯度洗脱。
[0024] 台阶/线性梯度洗脱具体为：洗脱溶剂以石油醚为流动相A，以乙醇为流动相B，流 动相A、B的比例按体积百分比为：45-95%流动相A，5-55%流动相B，以上组分体积百分比 总和为100%，洗脱流速：8-10mL/min。
[0025] 本发明的有益效果是，本发明方法采用乙醇溶液回流提取三斑海马获得乙醇粗提 物，然后采用液_液分离的系统溶剂提取方法，从乙醇粗提物获得极性小的石油醚提取物， 石油醚提取物经过中压制备与纯化色谱硅胶柱层析，用不同极性溶剂进行台阶/线性梯度 洗脱，获得极性不同的分离组分。其中，极性较大组分FrIV的生理活性物质含量较高，该组 分中未检测出胆固醇；同时该组分能够抑制脂多糖刺激小鼠巨噬细胞RAW264. 7炎症因子 一氧化氮，且对细胞无毒副作用，对细胞存活性无显著影响。
【附图说明】
[0026]图1是本发明方法的流程图；
[0027] 图2是本发明中石油醚提取物紫外光谱扫描图谱；
[0028] 图3是本发明中三斑海马脂溶性成分中压快速制备与分离硅胶柱层析谱图；
[0029] 图4是本发明分离得到的胆固醇薄层层析图谱；
[0030] 图5是本发明实施例1三斑海马脂溶性成分分离组分对小鼠巨噬细胞RAW264. 7 细胞存活性影响示意图；
[0031] 图6是本发明实施例1三斑海马脂溶性成分分离组分对小鼠巨噬细胞RAW264. 7 亚硝酸盐的产量抑制状况图。
[0032] 图中，1?标准品胆固醇，2.FrI组分，3.FrII组分，4.FrIII组分，5.FrIV组分。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0034] 本发明提供了一种提取、分离三斑海马脂溶性成分的方法，如图1所示，具体按以 下步骤实施：
[0035] 步骤1，提取脂溶性成分：
[0036]I. 1将三斑海马干燥体用自来水冲洗除去污泥、沙子，然后置于50_60°C恒温干燥 箱中24-36h。经中草药粉碎机粉碎后过20-40目筛得到三斑海马粉体，将三斑海马粉体与 质量分数为70%-95%的乙醇溶液以料液比1 :8-128/1111混合，在80°(：下回流111-211，得到 乙醇粗提液。
[0037] 1. 2将三斑海马乙醇粗提液在布氏漏斗中抽滤，滤渣重复抽滤操作3次。合并滤液 减压蒸发除去溶剂，获得浸膏状乙醇粗提物。
[0038] 1. 3将浸膏状乙醇粗提物与去离子水以I:8-12g/ml的比例混合，然后加入与上述 混合物等体积的石油醚II(沸程：60-90°C)，在梨形漏斗中萃取，取上层石油醚相，重复萃 取3次。合并所有萃取得到的石油醚相，45-55°C减压蒸发浓缩成浸膏后，(TC冷冻干燥，得 到三斑海马脂溶性成分，置于-20°C冰箱保存。
[0039] 步骤2,确定脂溶性成分最大紫外吸光峰的波长：
[0040] 取步骤1得到的三斑海马脂溶性成分，在石油醚中溶解，涡旋混勾，以溶剂石油醚 为空白，400-190nm紫外光谱扫描。获取扫描图谱，检测出三斑海马脂溶性成分的最大吸收 波长。石油醚提取物400-190nm紫外光谱扫描结果表明，三斑海马脂溶性成分在205nm波 长下具有最大吸收峰，因此以205nm为检测波长，如图2所示。
[0041] 步骤3,三斑海马脂溶性成分的中压制备与纯化色谱硅胶柱层析分离：
[0042] 3. 1三斑海马脂溶性成分经过装有硅胶柱的中压制备与纯化色谱层析分离。进样 量：0? 5-2.OmL;检测波长：205nm，监测波长：210nm;
[0043] 3