专利名称：辅助上皮性卵巢癌早期诊断的host2试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学生物检测技术领域，具体涉及一种辅助上皮性卵巢癌早期诊断的H0ST2试剂盒，及其在辅助上皮性卵巢癌的早期诊断中的应用和检测方法。
背景技术：
上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer, EOC)是最常见的卵巢癌，约占80-90%，是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤，高达70%。由于卵巢位于盆底深部，这给卵巢癌的早期诊断造成诸多困难，在临床诊断时，70%的卵巢癌已是晚期(Luesley, D.，LawtonF., Blackledge G., Hi I ton C.，Kelly K., Rollason T., Wade-Evans Τ., JordanJ., Fielding J., Latief Τ..Failure of second-look laparotomyto influence survivalin epithelial ovarian cancer.Lancet.1988，2 (8611): 599-603.)。因此，EOC 的诊断是妇科肿瘤学家面临的最严峻挑战之一。虽然CA125是目前被认为对上皮性卵巢癌较为敏感的肿瘤标 id (Nagele, F.，Petruj E.，Medlj Μ.，Kainzj C.，Graf, A.Η.，Seveldaj P..Preoperative CA125: an independent prognosticfactor in patients with stage Iepithelial ovarian cancer.0bstet Gynecol.1995，86 (2): 259-264.)，但迄今为止，并没有特异性强能够辅助诊断EOC的生物学指标。因此，目前诊断EOC方面的突破主要针对多肿瘤标记联合检测，以提高EOC的检出率及其敏感性和特异性(Husseinzadeh N..Status oftumor markers inepithelial ovarian cancer has there been any progress A review.Gynecol Oncol.2011，120(1):152-157.)。长链非编码RNA (Long noncoding RNA，LncRNA)是一类长度大于200个碱基的功能性RNA分子，占人类基因组4-9%。LncRNA缺乏编码蛋白的能力，但能够在多种层面上调控其他基因的表达，参与细胞内诸多生物过程。由于自身分子长度，LncRNA具有一定的调控特色:既可以通过核酸序列一级结构与其他基因结合，又可以通过复杂的高级空间结构与蛋白因子相互作用；另外它们整体保守性较差，有利于维持自身功能的长期存在。目前许多研究表明，LncRNA广泛参与机体多种生理病理过程，其特异性表达和/或表达变化与恶性肿瘤的发生发展密切相关(Lee，J.T..Epigenetic regulation by long noncodingRNAs.Science.2012.338(6113):1435-1439.)DLncRNA特异性表达可作为肿瘤的生物标志物，对于LncRNA能否作为临床检测指标，已有诸多集中于癌症诊断、预后方面的研究报道，如前列腺癌中高表达的LncRNADD3，可辅助 PSA 用于早期诊断(Kusuda，Y.，Miyake, H.，Kurahashij Τ.，and Fujisawa, M.Assessment of optimal target genes for detectingmicrometastases in pelvic lymphnodes in patients with prostate cancer undergoingradical prostatectomy byreal-time reverse transcri ptase-polymerase chain reaction.Urol Oncol.2011.18.[Epub ahead of print]);肝细胞性肝癌中的LncRNA MVIH，可作为治疗的潜在靶点，并且其表达下调可以在一定程度上预测复发率(Yuan，S.X., Yang, F.，Yang，Y.，Tao，Q.F.，Zhang, J.，Huang, G.，Wang, R.Y.，Yang, S.，Huoj X.S.，Zhang, L.，Wang F.，SunS.Η., Zhou ff.P..Longnoncoding RNA associated with microvascular invasion inhepatocellularcarcinoma promotes angiogenesis and serves as a predictorfor hepatoceIlularcarcinoma patients' poor recurrence-free survival afterhepatectomy.Hepatology.2012.56 (6): 2231-2241.)。目前已知的是，短链非编码 RNA,如microRNA,在血浆、血清等体液中的表达非常稳定。这一结论为LncRNA应用于体液检测领域奠定基础。2003年，Rangel等人利用RACE技术，即进行cDNA末端快速克隆的方法，在EOC组织中发现一个特异性转录本H0ST2，长度约3000个碱基，没有开放式可读框，不能编码蛋白质，属于 LncRNA (Rangel L.B., Sherman-BaustC.A., Wernyj R.P., Schwartz D.R., ChoK.R., Morin P.J..Characterization of novel human ovarian cancer-specifictranscripts (HOSTs) identified by serialanalysis of gene expression.0ncogene.2003，22(46):7225-7232.)。文献并未就该特异性转录本H0ST2展开深入研究，至今也没有其他相关报道。目前，尚无其他检测H0ST2的方法问世，尚无H0ST2作为EOC生物学标记物的文献。
发明内容
本发明的目的在于提供一种辅助上皮性卵巢癌早期诊断的H0ST2试剂盒，本发明的另一目的是提供该H0ST2试剂盒在辅助上皮性卵巢癌的早期诊断中的应用，以及相应的检测方法。本发明人首先采集了 50例EOC患者的新鲜血液作为实验组，对照组选择35例良性卵巢上皮性肿瘤患者的新鲜血液，将所有样品分为两部分，一部分抗凝处理后取血浆，另一部分促凝处理后取血清。分别检测两组血浆及血清中H0ST2的表达情况，结果发现血浆和血清的数据差异无统计学意义，对照组血浆或血清中H0ST2的含量极其微弱，个别样品甚至无法检测出，但是实验组H0ST2的含量远远高于对照组13倍左右。这个结果说明H0ST2的含量变化可作为早期辅助诊断EOC的重要方法之一。本发明人认为以聚合酶链式反应(qRT-PCR)为基础技术，通过检测患者血浆或血清中H0ST2的表达来实现早期辅助诊断EOC是完全可行的。本发明提供的一种辅助上皮性卵巢癌早期诊断的H0ST2检测试剂盒，是由反转录系统、引物系统和扩增系统组成。其中反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成；扩增系统由SYBR Premix Ex Taq 试剂组成；引物系统由总RNA反转录随机引物(Oligo dT(18)primer)和H0ST2特异性的qRT-PCR的上、下游引物组成:上游引物 5'-GGACAGGTCCCTTGTTTCAA-3' (如 SEQ ID NO:2 所示)下游引物5'-CTGGTCTTTCCTTGCCTCTG-3' (如 SEQ ID NO:3 所示)。本发明的试剂盒，具体组成如下:A)总RNA反转录引物，1管，浓度:10μΜ，100μ 1/管；B) qRT PCR 上游引物，1 管，浓度:10 μ M，100 μ I/管；qRT PCR 下游引物，1 管，浓度:10 μ M，100 μ I/管；C) Trizol reagent (总 RNA 提取试剂)，1 管，2000 μ I/管；
D)氯仿，I 管，500 μ I/管；E)无水乙醇，I管，7ml/管；F) DEPC H2O (经焦炭酸乙二酯处理的纯水)，I管，1000 μ I/管；G) dd H2O (双蒸水)，I 管，2000 μ I/管。本发明还提供了上述的H0ST2检测试剂盒在辅助上皮性卵巢癌的早期诊断中的应用。
本发明的试剂盒适用于:根据患者年龄、病史及局部体征初步怀疑EOC的患者。用本发明的试剂盒分别检测若干已知的EOC患者及若干正常患者血浆或血清中H0ST2含量，以作为标准数据。再用相同的方法检测未知患者血清中H0ST2含量，对照上述标准数据，即可初步判断该患者是否患有E0C，以便作进一步检查确诊。本发明的试剂盒是首次利用实时定量PCR方法，通过检测血浆或血清中H0ST2含量以早期辅助诊断E0C，具有创伤性小、操作性强等特点。本发明还进一步地，提供了上述辅助早期诊断EOC的H0ST2检测试剂盒的检测方法，具体步骤如下:按常规处理方法抽血，离心后取血清或血浆，用总RNA提取试剂处理血清或血浆，加氯仿离心后取上层水相，并富集血清或血浆中的总RNA ;由反转录系统反转录成cDNA ;用扩增系统进行Real-timePCR扩增，测定H0ST2含量。本发明通过检测血浆或血清中的H0ST2分子含量的变化，早期辅助诊断E0C，以便尽早进行临床干预，采取手术治疗和/或化疗等其他治疗，防止病情进展，影响预后生存率和复发率。
图1:E0C患者和正常人术前血清中H0ST2的含量检测。图2 =EOC患者和正常人术前血浆中H0ST2的含量检测。图3:术后病理确诊EOC患者的手术前后血清中H0ST2的含量检测。图4:疑似EOC患者中手术确诊者和手术排除EOC者术前血浆中H0ST2的含量检测。
具体实施例方式现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。实施例1:制备本发明的试剂盒H0ST2 的 DNA 序列如 SEQ ID NO:1 所示。其特异性的Real-time PCR的上下游引物通过Primer5软件设计如下，由美国Invitrogen公司负责引物合成，纯度为PAGE级，合成后的引物用DEPCH2O溶解，终浓度为10 μ Μ。上游引物5'-GGACAGGTCCCTTGTTTCAA_3' (如 SEQ ID NO:2 所示)下游引物5'-CTGGTCTTTCCTTGCCTCTG-3' (如 SEQ ID NO:3 所示)制备包括下列组成成分的试剂盒 总RNA提取试齐U、氯仿、无水乙醇、总RNA反转录引物(100 μ I/管浓度:10 μ M)、特异性的H0ST2上游引物(100 μ I/管浓度:10 μ M)、下游引物(100 μ I/ 管浓度:10 μ M)、DEPC H2O (1000 μ I/ 管)、dd H2O (2000 μ I/ 管)
DEPC H2O的配置:用购买的DEPC(焦碳酸二乙酯)，纯度>99%，密度为1.12g/ml，配置DEPC H2O0 IOOmlMiliQ纯水中加0.lmlDEPC，放在IOOml干烤过的容量瓶中静置4小时后高压灭菌，制成千分之一浓度的DEPC H2O,经检测不含RNase、DNase和proteinase。用来溶解合成的反转录引物，并作为反转录时的稀释用水。ddH20的配置=MiliQ纯水经高压灭菌后，配置成Real-time PCR用的ddH20。实施例2:本发明的试剂盒的检测一、采集血清或血浆样本及处理:由于血清或血浆具有取材方便、连续检测的优点，因此从血清或血浆中检测术前疑似EOC的患者的生物标记物可以将EOC的早期诊断提高到一个新的水平。血清或血浆样本在上海长海医院住院部采集，所有患者均无血液、肾脏、肿瘤等可能影响血清或血浆水平的疾病。样品收集:收集约3飞ml病人的外周血放入含360 μ I EDTA的抗凝管中，颠倒混匀，静置约半小时，离心取上清得到血浆；收集约3飞ml病人的外周血放入真空促凝管中，颠倒数次以便充分结合，静置约半小时，离心取上清得到血清。离心注意事项:4°C离心两次，首先1600g离心lOmin，取上清，加入新的离心管中，第二层12000g离心lOmin，取上清，加入新离心管中。二、提取血清或血浆样本中的总RNA:
1、在制备好的血清或血衆样本中加入Trizol reagent (Invitrogen公司购买)，Trizol reagent:血衆=1:0.6 1.0。2、摇晃混匀，放置冰上15min，1000g2_8°C离心lOmin，取上清，分别放入经DEPC处理过的2ml EP管中。3、每使用Iml TRIzol加入200 μ I氯仿(三氯甲烷)，剧烈振荡摇晃混匀，静置冰上10-15min。12000g2_8°C 10_15min离心，离心后样品分为三层，取上层无色水相，水相体积约为所用TRIzol体积的50-60%。4、每使用Iml TRIzol加入0.5ml异丙醇，轻轻摇匀5-6次，_20°C放置Ih或室温放置10-15min。2_8° C12000rpml0-15min离心，离心后在管侧和管底出现白色胶状沉淀。5、小心去上清，用DEPC处理的75 %乙醇洗涤RNA沉淀。每使用Iml TRIzol至少加lml75 %乙醇,振荡混勻。2-8° C, 12000rpm, 5min离心。在RNA沉淀较多的情况下可以
重复该步骤I次。6、去上清，将留有沉淀的离心管开盖放置于超净台室温自然干燥，直至沉淀变成半透明状，干燥过程约5-10min。加入适量已温热过的DEPC水(约10-40 μ I)，用枪头吹打几次混匀，65 °C有助于RNA溶解。7、取少量RNA (1.5-2.0 μ I)使用Eppendorf紫外分光光度仪测定OD值(0D260值)，RNA纯度为0D260/0D280=1.8-2,以评估其浓度和质量。符合定量检测要求的样本进行
下一步反应。三、反转录成cDNA取富集液500ng为模板,用随机反转录引物进行反转录。使用TaKaRa反转录试剂，按照下列成分加入体系。以上步骤所用的tip头、EP管均经过DEPC水处理后高压灭菌。
权利要求
1.一种辅助上皮性卵巢癌早期诊断的H0ST2检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒是由反转录系统、引物系统和扩增系统组成，其中的反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成；扩增系统由SYBR Premix ExTaqTM试剂组成；引物系统由总RNA反转录随机引物和H0ST2特异性的qRT-PCR的上、下游引物组成； H0ST2特异性的qRT-PCR的上游引物如SEQ ID NO:2所示， H0ST2特异性的qRT-PCR的下游引物如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的一种辅助上皮性卵巢癌早期诊断的H0ST2检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒的具体组成如下: A)总RNA反转录引物，I管，浓度:10μΜ，100μI/管； B)qRT PCR上游引物，I管，浓度:10 μ M，100 μ I/管; qRT PCR下游引物，I管，浓度:10μΜ，100μ I/管；C)Trizol reagent, I 管，2000 μ I/ 管； D)氯仿，I管，500μ1/管； Ε)无水乙醇，1管，7ml/管;F)DEPC H2O, I 管，1000 μ I/ 管;G)dd H2O, I 管，2000 μ I/ 管。
3.—种如权利要求1或2所述的辅助上皮性卵巢癌早期诊断的H0ST2检测试剂盒的检测方法，其特征在于，具体步骤如下:按常规处理方法抽血，离心后取血清或血浆，用总RNA提取试剂处理血清或血浆，加氯仿离心后取上层水相，并富集血清或血浆中的总RNA ;由反转录系统反转录成cDNA ;用扩增系统进行Real-time PCR扩增，测定H0ST2含量。
全文摘要
本发明涉及医学生物检测技术领域。本发明提供的一种辅助上皮性卵巢癌(EOC)早期诊断的HOST2检测试剂盒，是由反转录系统、引物系统和扩增系统组成，其中的HOST2特异性的qRT-PCR的上游引物如SEQ ID NO:2所示，下游引物如SEQ ID NO:3所示。本发明的试剂盒利用实时定量PCR方法，通过检测血浆或血清中HOST2含量以早期辅助诊断EOC，具有创伤性小、操作性强等特点。本发明还进一步地提供了上述辅助早期诊断EOC的HOST2检测试剂盒的检测方法。
文档编号C12Q1/68GK103074439SQ20131003644
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月30日 优先权日2013年1月30日
发明者刘善荣, 惠宁, 高原, 刘淑鹏, 余喜亚, 胡晶晶 申请人:中国人民解放军第二军医大学