专利名称：检测猪细小病毒2型的环介导等温扩增反应引物的制作方法
技术领域：
本发明 涉及一种用于检测猪细小病毒2型(PPV2)的环介导等温扩增反应引物，属于动物分子病毒学领域。
背景技术：
猪细小病毒2型(Porcine parvovirus 2，PPV2)最早于2001年在緬甸一例患有E型肝炎的猪只中检测到。此后在2006-2007我国(中国)南方地区患有“高热病”的猪群中检测到。最近在匈牙利和美国军用该病的研究报道。目前，关于PPV2的致病性的研究较小，致病机理还未见明确。所以，建立一种简单实用的检测方法对猪细小病毒2型的防控有
着重要意义。基于分子水平对猪细小病毒2型检测常根据病毒基因特征设计特异性引物进行PCR扩增，可及时准确的进行病原鉴别诊断，但是普通的PCR以及灵敏度更高的荧光定量PCR，均需要使用精密仪器，对实验人员有较高的技术要求等，无法在基层实验室广泛使用。环介导等温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification , LAMP)可以在等温条件下进行高效、快速、高特异性的扩增靶序列。该方法特异性强，灵敏度较PCR方法高，无需PCR仪器等贵重仪器，仅需要普通水浴锅调节温度(60°C—65°C)。大大降低了检测的费用，特别适合基层和现地使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测猪细小病毒2型的环介导等温扩增反应引物。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
所述用于检测猪细小病毒2型的环介导等温扩增反应引物，由I对外引物和I对内引物组成，其中所述的外引物由F3和B3，内引物由FIP和BIP组成；上述两对引物的序列如下:
F3:5， - CCCGCTGGAGAACCTCAT -3，，
B3: 5’ - GCCATCCACCACTGCTTG -3’，
FIP:5’ - CATTGATCCCTCTCCGCCCGGGATGCCATGGACAGATCC -3’，
BIP:5’ - GCGCCAGGCTCTCTTACAGCCCCAGAAACCACCGTGTT -3’。本发明还提供了所述的环介导等温扩增反应引物在制备猪细小病毒2型快速诊断试剂中的用途。本发明根据猪细小病毒2型基因组中VPl基因序列特征，设计特异性的LAMP引物，根据所设计的LAMP引物，建立了检测猪细小病毒2型(PPV2)环介导等温扩增方法。该方法不与猪其他常见传染病发生非特异性反应，该方法适用性好，准确度高，特异性强，灵敏度高。敏感性实验表明，本发明所建立的LAMP检测方法能在60分钟内检测出26拷贝数/μ L的病毒核酸，比常规方法敏感100倍。同时，本发明中，加入一种绿色荧光染料SYBRI，该染料在反应液配制是加入，反应结束后，无需开盖，直接根据颜色变化进行结果判定，这极大的降低了污染的可能性，提高该方法的现地使用性。
图1为猪细小病毒2型LAMP特异性实验，其中1:PPV2阳性DNA ；2:猪细小病毒DNA ；3:猪圆环病毒DNA ；4:猪伪狂犬病毒DNA ；5:猪瘟病毒cDNA。图2为猪细小病毒2型LAMP方法琼脂糖电泳实验。其中M:DL2000分子量Marker ;I:构建的P-PPV2阳性质粒；2:猪细小病毒2型阳性；3:猪细小病毒；4:猪圆环病毒；5:猪伪狂犬病毒；6:猪瘟病毒。
具体实施例方式下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。实施例1
1.LAMP实验引物的设计
下载GenBank中登录的所有猪细小病毒2型基因序列和本研究室从我省现地猪场中检测到的猪细小病毒2型基因序列，进行分析比较，选择VPl基因前段保守区域片段(GenBankJX101461),利用 LAMP 引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/)设计引物，包括外引物I对和内引物I对，具体序列见SEQ ID N0.USEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3和 SEQ ID N0.4。2、毒株
猪细小病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。猪细小病毒2型阳性DNA由我省(福建省)现地猪场现地检测并保存。3、病毒核酸的提取
用 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.4.0 (宝生物工程(大连)有限公司)按照说明书方法进行操作提取猪细小病毒2型阳性病料的DNA，- 20°C保存备用。4、阳性标准品的制备
以提取的PPV2病毒DNA为模板，用所设计的特异性引物(F:5 '-TCGAACACGGTCTTGAGGC-3 '和 R:5 ' - TGAATCGCTTTCGAACGGTCTT-3 ',扩增片段长度为693bp，扩增体系为 50μ L，其中 Primix Taq (Ex Taq Version)25 μ L、上下游引物(20 μ Μ)各lyL、cDNAlyL，补充灭菌去离 子水至终体积50 μ L。反应条件:反应条件为94°C 5min预变性后进入循环，循环参数为94°C 50s,53°C 30s,72°C 40s，35个循环后，72°C延伸IOmin0取PCR产物5yL，在1.0 %琼脂糖凝胶上电泳。经胶回收试剂盒切胶回收纯化后与T载体连接，转化JM109感受态细胞，应用PCR和双酶切方法鉴定重组质粒，并将阳性重组质粒进行序列测定。测序结果在NCBI上进行BLAST分析表明，该阳性重组质粒符合实验预期，即作为猪细小病毒2型LAMP阳性标准品(p-PPV2)。将获得的阳性标准品用超微量紫外可见分光光度计测定0D260值对阳性质粒进行定量后计算拷贝数，置于一 20°C备用，使用前并进行10倍连续稀释。5、LAMP实验条件优化
使用Loopamp DNA扩增反应试剂盒(北京蓝谱生物科技有限公司)进行LAMP反应。每25 μ L反应体系中含有:2 X反应液12.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、F3和B3各0.6 μ M、FIP和BIP各1.5 μ Μ、绿色荧光染料SYBR I I μ L，以猪细小病毒2型LAMP阳性标准品为模板，补充灭菌去离子水至终体积25 μ L。实验不同温度(60°C、62°C、64°C、66°C )、不同时间(30min、60min、90min)检测引物反应性能。6、特异性实验
取猪细小病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒提取的DNA (或RNA反转录成cDNA)进行LAMP 反应,并重复实验操作一次。7、敏感性实验
将制备的阳性质粒标准品进行10倍连续稀释，取拷贝数为2.6X IO1拷贝数/ μ L至
2.6X IO5拷贝数/ μ L五个梯度的样品进行LAMP反应，确定检测敏感度。并重复实验操作一次。8、临床样品的检测
对本研究室收集的18份猪组织病料按照步骤3中的方法提取DNA后，进行LAMP和PCR检测。实验结果
1、LAMP方法的特异性实验
猪细小病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均为阴性，而对猪细小病毒2型阳性DNA有很好的扩增，本方法具有很好的特异性。此外，本结果在自然光条件下可以见到的通过明显的颜色区别进行判定(见图1)。肉眼观察颜色变化和管底的白色沉淀判定检测结果:可见阳性试管见有明显的翠绿色，阴性则成明显的橙红色。阳性管内液体浑浊，离心或静置后有白色沉淀集于管底，阴性样品则没有。2、LAMP方法敏感性结果
将制备的阳性质粒标准品进行10倍连续稀释，确定猪细小病毒2型(PPV2)环介导等温扩增方法检测敏感度为2.6 X IO1拷贝数/ μ L，其敏感性为普通PCR的100倍。
3、临床样品的检测
对本研究室收集的18份猪组织病料进行猪细小病毒2型LAMP检测，共有3份阳性样品，PCR检测仅有I份阳性样品。4、猪细小病毒2型LAMP方法琼脂糖电泳后染色检测
从电泳结果图2可见，本发明建立的猪细小病毒2型LAMP方法对猪细小病毒2型检测有明显的条带，而对猪细小病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均为阴性。
权利要求
1.一种用于检测猪细小病毒2型的环介导等温扩增反应引物，其特征性在于:所述的引物由I对外弓I物和I对内引物组成，其中所述的外引物由F3和B3，内引物由FIP和BIP组成；上述两对引物的序列如下:F3:5， - CCCGCTGGAGAACCTCAT -3，，B3: 5’ - GCCATCCACCACTGCTTG -3’，FIP:5’ - CATTGATCCCTCTCCGCCCGGGATGCCATGGACAGATCC -3’，BIP:5’ - GCGCCAGGCTCTCTTACAGCCCCAGAAACCACCGTGTT -3’。
2.权利要求1所述的环介导 等温扩增反应引物在制备猪细小病毒2型快速诊断试剂中的用途。
全文摘要
本发明属于动物分子病毒学领域，本发明公开了一种用于检测猪细小病毒2型(PPV2)的环介导等温扩增反应引物。该方法根据猪细小病毒2型VP1基因前段保守序列设计引物两对引物外引物F3和B3；内引物FIP和BIP组成。具体序列见SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。根据所设计的引物建立一种检测猪细小病毒2型(PPV2)环介导等温扩增方法。该检测方法不与猪常见传染病病毒发生交叉反应。本发明的检测方法现地实用性强，不需要昂贵仪器设备；准确性高，特异性强，灵敏度高。
文档编号C12Q1/70GK103088164SQ20131003654
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月31日 优先权日2013年1月31日
发明者李家玉, 张奇, 林志华 申请人:福建农林大学