专利名称：基于检测slc45a3-elk4融合转录子的用于诊断前列腺癌的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及癌症的诊断和治疗领域。确切地说，本发明涉及基于检测 SLC45A3-ELK4转录子的用于诊断前列腺癌的组合物和方法。
背景技术：
同其它易位肿瘤类似，前列腺癌中的成红细胞特异性转化基因(ETS)家族成员的染色体重排，可能代表了一种特定的前列腺癌亚类，其依据是有研究揭示了此类肿瘤变化的形态特征(Mosquera等人，J Pathol 2007 ；212 :91-101)、存活率(Attard等人，Oncogene 2008 ；27 :253-63 ；Cheville 等人，J Clin Oncol 2008；26 :3930-6 ；Demichelis 等人， Oncogene 2007 ；26 :4596-9)和特异性的表达谱(Setlur 等人，J Natl Cancer Inst 2008 ； 100:815-25)。雄激素调节的基因是5'基因组调控型启动子元件的主要组成部分，在前列腺癌中其与ETS融合(Tomlins等人，Nature 2007 ；448 :595-9)。举例来讲，雄激素调节的跨膜蛋白酶的启动子，丝氨酸2 (TMPRSS)基因被融合入转录因子ETS家族成员的编码区域，即通常的v-ets骨髓成红细胞增多症病毒似6癌基因同源物(鸟类)(ERG) (Helgeson 等人，Cancer Res 2008 ；68 :73-80 ；Tomlins 等人，Cancer Res 2006 ；66 :3396-400 ；Han 等人.Cancer Res 2008 ;68 :76四_37)。这些融合基因的存在可以作为前列腺癌和其它类型肿癌治疗的诊断标志物和合适的治疗靶标。SLC45A3(溶质载体家族45，成员3)，又称为普罗斯汀(prostein)，其是一前列腺特异的雄激素调节的基因，已有研究显示其是ETVl 和 ETV5 的 5'伴侣 CTomlins 等人，Nature 2007 ；448 :595-9 ；Helgeson 等人，Cancer Res 2008 ；68 :73-80)。多数情况显示SLC45A3重排发生在与ERG(80% )或者ETVl (10%)连接处，但是前列腺癌中剩余10%的SLC45A3的3'伴侣尚未鉴定出来。ELK4(ETS-功能域蛋白(SRF辅助蛋白1))，是转录因子ETS家族的一个成员，最近的研究将其描述为一种靶向 LNCaP细胞的新的雄激素受体，其能够促进细胞生长(Malikonen等人，Oncogene 2008 ；Aug 21；27(36) :4865-76. Epub 2008 May 12)。
发明概述根据本发明，SLC45A3和ELK4之间的融合转录子首次被鉴定出来。已有研究显示， 前列腺癌患者中这些转录子的表达水平较高。在一个实施例中，本发明提供了一种在患者中诊断癌症的方法，例如诊断前列腺癌的方法，此方法的依据是测定患者样本中SLC45A3-ELK4融合分子水平的升高情况。
在一个特定实施例中，融合分子是一转录子，其表示SLC45A3 mRNA的5'部分和 ELK4 mRNA的3'部分之间的融合。在一些实施例中，融合转录子包含SLC45A3 mRNA的5' 部分，该5‘部分至少包括SLC45A3的外显子1，且其融合到ELK4 mRNA的3'部分，该3' 部分至少包括ELK4的外显子2。在另一些实施例中，融合转录子包含SLC45A3的外显子 1，和SLC45A3的外显子2、3和4中的一个或多个外显子的一部分，以及ELK4的外显子2和 ELK4下游外显子中的一个或多个。检测中使用的适宜的样品来源为包含核酸的生物样品，生物样品的例子包括前列腺组织、血液、尿液、精液、前列腺分泌物和前列腺细胞。可以通过多种技术包括基于杂交或者扩增的技术来实现对融合核酸分子的检测。 可以使用专门设计用来选择性的鉴定融合分子的那些引物和探针，包括那些与融合接头处具有特异性的引物。可以通过任意已知的适于蛋白测定的方法来对那些来源于融合核酸分子的融合蛋白进行检测，包括使用融合蛋白特异性抗体例如融合接头处的特异性抗体的免疫检测方法。在另一个实施例中，本发明提供了一种组合物和试剂盒，其包含可用于本发明诊断方法的试剂。在另一个实施例中，本发明提供一种鉴定可用于癌症治疗(例如前列腺癌)的试剂的方法，此方法的依据是确定试剂是否能够抑制SLC45A3-ELK4融合分子在体外细胞中的生物功能或者降低SLC45A3-ELK4融合分子的水平。在另一个实施例中，本发明提供一种治疗癌症的方法，例如患者的前列腺癌，此方法是通过给予患者能够抑制SLC45A3-ELK4融合分子的生物功能或者降低其水平的试剂来实现的。
图la-Id.。前列腺癌、良性前列腺组织和LNCaP细胞中SLC45A3-ELK4 mRNA的检测结果。la.染色体lq32. 1 (Chr. Iq32. 1)的示意图，其示出了 SLC45A3和ELK4的位置和相对距离。红色箭头和线条分别表示SLC45A3-ELK4 TAQMAN分析引物和探针。lb. 31个前列腺癌样品中的SLC45A3-ELK4和ELK4 mRNA水平相对于内控基因(TCFLl)水平的TAQMAN 表达数据，该表达数据被校准到相对于6个良性样品中表达水平的平均值的倍数，其中具有高于10倍的相对SLC45A3-ELK4 mRNA水平的样品以深红色标注。右侧的图形示出了， SLC45A-ELK4 mRNA在10个癌细胞系和1个良性肾细胞系中的相对水平与其在良性前列腺上皮细胞系RWPE-I中的相对水平的比较。Ic.各种SLC45A3-ELK4 cDNA变异体(ν)的 cDNA测序结果，所用cDNA通过扩增(引物为箭头所示)并使用凝胶从RCR和5' RACE (引物为箭头所示)中分离获得。所用SLC45A3-ELK4 cDNA变异体(ν)具体如下变异体1 SLC45A3 (外显子1) -ELK4 (外显子2)；变异体2 :SLC45A3 (外显子1-2) -ELK4 (外显子2)； 变异体3 :SLC45A3(截短的外显子1)-ELK4 (外显子2)；变异体4 :SLC45A3 (外显子1，外显子2的起点-外显子4的末端)-SLC45A3和ELK4-ELK4 (外显子2、之间84个碱基对的基因间序列；变异体5 :SLC45A3(外显子1-外显子4) -SLC45A3和ELK4-ELK4 (外显子2)之间的基因间序列。Id.柱形图示出了从6个尿液样品分离得到的RNA的TAQMAN测定(图Ia和Ib所示)结果。将SLC45A3-ELK4的原始值校准到相对于对照基因TCFLl的值，然后将显示为阴性癌症结果的活检材料的SLC45A3-ELK4值设为1。图Id示出了其它5个样品 (C08、C03、C33和C30对应于癌症阳性活检，C13对应于癌症阴性活检)的相对mRNA。图2.传统PCR实验的结果。使用图Ic所示的引物，对从35个前列腺癌样品、6个良性样品、6个前列腺癌细胞系(NCI-H660、VCaP、PC3、LNCaP、DU145、22_Rvl)以及1个良性细胞系(RWPE-I)中提取的总RNA进行RT-PCR分析。这一凝胶图示出了，前列腺癌样品 (PCa)以及 NCI-H660、VCaP, PC3、LNCaP 和 RWPE-I 细胞的代表性条带。图3a_3b.分隔SLC45A3和ELK4的染色体1区域的基因组学特征。3a. Chr. Iq32区域的示意图，其示出了对13个扩增子中的每一个都具有特异性的引物对的位置。SLC45A3 外显子5和ELK4外显子1的位置也已经被标识出来。3b.从16个前列腺癌样品(从左至右按照所述TAQMAN方法测定的SLC45A3-ELK4mRNA的函数进行排序)中获得的13个扩增子中的每一个以及来源于LNCaP细胞中的扩增子的定量PCR分析结果。将前列腺癌样品分成2组SLC45A3-ELK4 mRNA水平比良性样品高10倍的组(“高”)；SLC45A3-ELK4 mRNA水平与良性样品相似的组(“低”)。所有的Q-PCR实验重复三次。条状图显示平均的校准后的值，该校准后的值已经被校准到未被改变过的染色体Iq上的另一个区域。图4a-4c.雄激素刺激LNCaP细胞，诱导SLC45A3-ELK4 (图如)，诱导内源性的 ELK4(图4b)mRNA和诱导KLK3 (PSA)mRNA(图4c)。柱形图表示在给定时间点时使用InM的 R1881分别在不存在10 μ M氟他胺(黑色的柱)或者存在10 μ M氟他胺(灰色的柱)的条件下处理LNCaP细胞所引起的平均诱导倍数。氟他胺处理的方法是细胞先使用10 μ m氟他胺预处理2小时，然后在给定时间点将培养液移除，并更换以含有InM R1881和10 μ M氟他胺的新鲜培养液。所有的实验均重复三次(标准差以误差线表示)。
发明的详细说明有研究显示，在前列腺癌组织和有患前列腺癌风险的男性尿液样品中， SLC45A3-ELK4融合转录子尤其是SLC45A3-ELK4融合转录子呈现出高水平表达。已经鉴定出一些SLC45A3-ELK4融合转录子的变异体，且已证明它们受到雄激素调节。本申请公开了可用于诊断癌症尤其是用于诊断前列腺癌的组合物和方法，这些组合物和方法的完成是基于对SLC45A3-ELK4融合分子进行检测。此外，本申请还提供了药物筛选方法和治疗方法。SLC45A3-ELK4 融合分子本申请公开了可以在前列腺癌患者中检测到的SLC45A3-ELK4转录子(即mRNAs) 的实施方式。这些融合转录子被认为是由区别于染色体重排的事件所引起的，所述染色体重排是指前列腺癌中存在的其它ETS融合事件。不受任何理论的束缚，这些SLC45A3-ELK4 融合转录子可能是反式剪接、基因组重排或者以上这两种机制结合产生的一种结果。一旦被翻译，则该融合转录子可以生成融合蛋白。本申请中，术语“SLC45A3-ELK4融合分子”可以是嵌合的核酸分子(基因组DNA、 cDNA和RNA)或者是嵌合的蛋白分子。举例来讲，SLC45A3-ELK4融合转录子或者mRNA分子至少由SLC45A3mRNA的5 ‘部分组成，该5'部分至少与ELK4 mRNA的3'部分连接。SLC45A3-ELK4融合转录子还可以包含一序列，该序列来自SLC45A3基因和ELK4基因之间的基因间区域(intergenic region)。 SEQ ID NOs :6-8表示SLC45A3 cDNA和两个ELK4 cDNA (对应于两个剪接变异体)序列。
构成融合转录子的SLC45A3 mRNA的5'部分可以包含SLC45A3 mRNA的5'非翻译区域。mRNA的5'非翻译区域起始于+1位(即转录起始位点)，且刚好终止于编码区域起始密码子之前。构成融合转录子的SLC45A3 mRNA的5'部分还可以包含SLC45A3 mRNA的一个或者多个外显子的全长或者片段。SEQ ID N0:6示出了人SLC45A3 mRNA的五个外显子。术语外显子的一“部分”，是指外显子的连续序列，其比外显子的全长要短。一般来讲，外显子的一部分在长度上可以是至少5个、10个、15、20个、25个、30个、35个、40个核
苷酸或者更长。在一个实施例中，融合转录子包含至少SLC45A3的外显子1，或者外显子1的一部分。在另一个实施例中，融合转录子包含至少SLC45A3的外显子1或者它的一部分，以及 SLC45A3的一个或者多个下游外显子(即外显子2、3、4和幻的全部或者部分。构成融合转录子的ELK4 mRNA的3 ‘部分可以包含转录自ELK4基因的3 ‘非翻译区域。3'非翻译区域是mRNA的片段，其位于编码区域的后面且不会被翻译。3'非翻译区域通常在后面带有多聚腺苷酸尾巴。构成融合转录子的ELK4 mRNA的3'部分还可以包含来自ELK4 mRNA 3'端的一个或者多个外显子的全长或者片段，例如外显子5、外显子4、外显子3a、外显子北和外显子 2，或者它们的片段。SEQ ID NOS :7-8表示人ELK4 cDNA的两个剪接变异体的外显子。在一个特定实施例中，SLC45A3-ELK4融合转录子由SLC45A3 mRNA的5'部分组成，该5'部分包含至少SLC45A3的外显子1，该5'部分连接到ELK4 mRNA的3'部分，该 3'部分包含有外显子2或者外显子2的一部分，以及一个或者多个ELK4 mRNA的下游外显子。这种融合转录子的一个实施例是以下实施例中提到的变异体1，其含有SEQ ID N0:1所示的接头序列。在另一个实施例中，SLC45A3-ELK4融合转录子由SLC45A3 mRNA的5'部分组成， 该5'部分包含SLC45A3的外显子1和外显子2的一部分，所述5'部分融合到ELK4 mRNA 的3'部分，该3'部分包括ELK4 mRNA的外显子2或者外显子2的一部分以及下游外显子。这种融合转录子的实施例是下面实施例中提到的变异体2和变异体3，两者分别含有 SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示的接头序列。在另一个实施例中，SLC45A3-ELK4融合转录子由SLC45A3 mRNA的5'部分组成， 该5'部分包括SLC45A3的外显子1、外显子2的一部分，以及外显子4的一部分，所述5' 部分融合到ELK4 mRNA的3 ‘部分，该3'部分包括ELK4 mRNA的外显子2或者外显子2的一部分以及下游外显子。这种融合转录子的一个实施例是下面实施例中提到的变异体4，其含有SEQ ID NO 4所示的接头序列。在另一个实施例中，SLC45A3-ELK4融合转录子由SLC45A3 mRNA的5'部分组成， 该5 ‘部分包括SLC45A3的外显子3和外显子4的至少一部分，所述5 ‘部分融合到ELK4 mRNA的3'部分，该3'部分包括ELK4 mRNA的外显子2或者外显子2的一部分以及下游外显子。这种融合转录子的一个实施例是以下实施例中提到的变异体5，其含有SEQ ID NO 5所示的接头序列。通过翻译，融合转录子可以生成融合蛋白。由于融合转录子的形成可能会引起移码，所以融合转录子中ELK4 mRNA部分所编码的氨基酸可能会或者可能不会与ELK4 mRNA
7的3'部分原始编码的氨基酸相一致。诊断基础根据本发明，患者癌症的诊断是基于检测样品中的SLC45A3-ELK4融合分子来实现的。已有研究证明，SLC45A3-ELK4融合转录子表达水平升高这一现象会特异性地出现在前列腺癌患者中，并且也认为会在其它癌症中出现。因此，本发明所提供的方法可用于诊断癌症，其包括但不限于，前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌和肺癌。术语受试的“患者”包括所有的哺乳动物患者，尤其是人类患者。术语“诊断”是指，确定患者是否患有或者可能患有癌症。基于检测SLC45A3-ELK4 融合分子的诊断方法可以和其它的诊断方法组合使用，从而减少假阳性或者假阴性结果。适合用于检测的样品来源包括任何生物样品，只要其含有本申请中所描述的可用于检测的融合分子。样品来源的实例包括，组织、尿液、血液、精液、前列腺分泌物或者前列腺细胞。在一个特定实施例中，直肠指检(DRE)后，迅速收集尿液样品，直肠指检通常会导致前列腺细胞从前列腺散落到尿道中。可以对以上来源的样品进行进一步的处理，从而富集融合分子或者含有融合分子的细胞。处理方法可以包括，从血液中获取血清或者血浆成分、从尿液中获取上清液或者细胞颗粒成分、组织均浆处理、细胞裂解处理等等，从而提供适于对融合分子进行分析的材料。癌症的诊断可以通过检测是否存在高水平融合分子的方式来完成。可替换地或者另外地，诊断还可以通过检测是否存在高水平的特定融合分子的方式来完成，这可以根据该特定融合分子的组成或者特征来确定。本申请中，“高水平”是指与对照水平相比明显增加的水平，对照水平是指在正常组织中检测到的融合分子的水平(例如正常或者良性组织，和/或正常非前列腺组织)。明显增加是指增加至少50%,75%U00% (正常水平的两倍)、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、 8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍或者更多。 举例来讲，SLC45A3-ELK4融合转录子可以通过RT-PCR方法进行检测，RT-PCR使用的引物包含第一引物和第二引物，其中，第一引物对应于或者特异于SLC45A3 mRNA的5' 部分的序列(例如外显子1)，第二引物特异于或者对应于ELK4 mRNA的3'部分的序列(例如外显子2或者任意其它的下游外显子)。阳性信号表示存在一个或者多个SLC45A3-ELK4 融合转录子变异体，或者存在不同变异体的组合。水平(信号)的定量以及将其与正常组织水平进行对比的结果可以为诊断提供基础依据。 当提到寡聚核苷酸引物或者探针“对应于”或者“特异于”某一序列时，其是指，这些引物或者探针与该序列具有足够的同一性，从而使引物或者探针在严格条件下可以与该序列或者该序列的互补链进行杂交。所谓严格条件是从温度、离子强度以及是否存在其它化合物(例如有机溶剂)这几个方面来定义。举例来讲，“高度严格条件”可以包括42°C 下，在由 5x SSPE (43. 8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4H2O 和 1. 85g/l EDTA，用 NaOH 将 pH 调至 7. 4)、0. 5%SDS,5x Denhardt试剂和100 μ g/ml变性的鲑精DNA所组成的溶液中进行杂交 然后用含有0. Ix SSPE和1. 0% SDS的溶液在42°C或者更高的温度下冲洗。“中等严格条件，，包括42°C下，在切 SSPE、Na0H、0. 5% SDSjx Denhardt 试剂和 100 μ g/ml 变性的鲑精 DNA组成的溶液中进行杂交；随后用含有1. Ox SSPE和1. 0% SDS的溶液在42°C下进行冲洗。
适合用在检测中的寡聚核苷酸引物或者探针除了包含序列结合区域，还可以包含其它组件，例如包含这样一种序列，该序列不会结合接头序列(例如是标记序列或者启动子序列)，也不会在接头处干扰接头序列与靶标序列的结合。相似地，引物或者探针可以包含非核酸部分，例如不会对靶标结合产生干扰的标记。除此之外或者说是作为检测(也就是任何类型的)融合分子的一种替代方式，也可以根据特定融合分子的组分或者特征的不同来检测特定的融合分子。例如，可以通过使用对应于SLC45A3 mRNA的5'部分的第一引物和对应于ELK4 mRNA的3'部分的第二引物进行RT-PCR分析，然后在琼脂糖上对获得的RT-PCR产物进行评价从而确定RT-PCR产物的尺寸。本申请所举例的包括SLC45A3的外显子1和ELK4的外显子2的变异体1，其接头处长度为325bp(SEQ ID NO :1)，而图Ic和SEQ ID NOS :2_5所示的变异体2_5的接头处的长度分别为615bp、379bp、371bp和774bp。也可以对RT-PCR的产物进行测序，以评价融合转录子的同一性。可替换地，还可以在杂交或者扩增类的分析例如RT-PCR、FISH中使用那些根据特定变体的接头序列而专门设计的引物或者探针，从而对特定的融合转录子变异体的存在与否及其水平进行评价。为了举例之目的，SEQ ID NOS 1_5示出了 5个融合转录子变异体的接头序列，其中接头点以星号示出，SLC45A3和ELK4之间的共有核苷酸以下划线示出。
变异体1 :SLC45. A3 (外显子1) -ELK4 (外显子2)
AACCTGGAGATTTAAAAGCCGCCGGCTGGCGCGCGTGGGGGGCAAGGAA
GGGGGGGCGGAACCAGCCTGCACGCGCTGGCTCCGGGTGACAGCCGCGC
GCCTCGGCCA*G*CTCATTGCTATGGACAGTGCTATCACCCTGTGGCAGTT
CCTTCTTCAGCTCCTGCAGAAGCCTCAGAACAAGCACATGATCTGTTGGA
CCTCTAATGATGGGCAGTTTAAGCTTTTGCAGGCAGAAGAGGTGGCTCGT
CTCTGGGGGATTCGCAAGAACAAGCCTAACATGAATTATGACAAACTCAG
CCGAGCCCTCAGATACTATTATGTAAAG(SEQ ID NO :1)
变异体2 :SLC45A3 (外显子1) -SLC45A3 (外显子2的起点)-ELK4 (外显子2)
AACCTGGAGATTTAAAAGCCGCCGGCTGGCGCGCGTGGGGGGCAAGGAA
GGGGGGGCGGAACCAGCCTGCACGCGCTGGCTCCGGGTGACAGCCGCGC
GCCTCGGCCAGGATCTGAGTGATGAGACGTGTCCCCACTGAGGTGCCCCA
CAGCAGCAGGTGTTGAGCATGGGCTGAGAAGCTGGACCGGCACCAAAGG
GCTGGCAGAAATGGGCGCCTGGCTGATTCCTAGGCAGTTGGCGGCAGCAA
GGAGGAGAGGCCGCAGCTTCTGGAGCAGAGCCGAGACGAAGCAGTTCTG
GAGTGCCTGAACGGCCCCCTGAGCCCTACCCGCCTGGCCCACTATGGTCC
AGAGGCTGTGGGTGAGCCGCCTGCTGCGGCACCGGAAAGCCCAGCTCTTG
CTGGTCAACCTGCTAACCTTTGGCCTGGAGGTGTGTTTGGCCGCAGGCATC
ACCTATGTGCCGCCTCTGCTGCTGGAAGTGGGGGTAGAGGAGAAGTTCAT
GACCATGGTGCTG*GCTCATTG*CTATGGACAGTGCTATCACCCTGTGGCA
GTTCCTTCTTCAGCTCCTGCAGAAGCCTCAGAACAAGCACATGATCTGTTG
GACCTCTAATGATGGGCA(SEQ ID NO 2)
变异体3 :SLC45A3(外显子1)-SLC45A3 (外显子2的起点)-SLC45A3 (外显子2的终
9点)-ELK4(外显子2)
AACCTGGAGATTTAAAAGCCGCCGGCTGGCGCGCGTGGGGGGCAAGGAA
GGGGGGGCGGAACCAGCCTGCACGCGCTGGCTCCGGGTGACAGCCGCGC
GCCTCGGCCAGGATCTGAGTGATGAGACGTGTCCCCACTGAGGTGCCCCA
CAGCAGCTCTTGCTGGTCAACCTGCTAACCTTTGGCCTGGAGGTGTGTTTG
GCCGCAGGCATCACCTATGTGCCGCCTCTGCTGCTGGAAGTGGGGGTAGA
GGAGAAGTTCATGACCATGGTGCTG*GCTCATTG*CTATGGACAGTGCTAT
CACCCTGTGGCAGTTCCTTCTTCAGCTCCTGCAGAAGCCTCAGAACAAGC
ACATGATCTGTTGGACCTCTAATGATGGGCA(SEQ ID NO :3)
变异体4 :SLC45A3(外显子1)-SLC45A3 (外显子2的起点)-SLC45A3 (外显子4的终点)-SLC45A3和ELK4-ELK4(外显子2)之间的基因间序列 AACCTGGAGATTTAAAAGCCGCCGGCTGGCGCGCGTGGGGGGCAAGGAA GGGGGGGCGGAACCAGCCTGCACGCGCTGGCTCCGGGTGACAGCCGCGC GCCTCGGCCAGGATCTGAGTGATGAGACGTGTCCCCACTGAGGTGCCCCT ACAC*ACTGGCCTCCCTCTACCACCGGGAGAAGCAG*TGGAGGACTTTTG ACCCGTCTCCTCACCTTCTGATACACACCAACCAACCAGTCAACCAGCCA TTGCTGTTTACTGGATACCT*GCTCATTGCTATGGACAGTGCTATCACCCT GTGGCAGTTCCTTCTTCAGCTCCTGCAGAAGCCTCAGAACAAGCACATGA TCTGTTGGACCTCTAATGATGGGCA(SEQ ID NO :4)
变异体5 :SLC45A3 (外显子3的终点-)-SLC45A3 (外显子4) -SLC45A3和ELK4-ELK4 (外显子2)之间的来源于5' RACE的基因间序列
TGGGCCCCACCGAGCCAGCAGAAGGGCTGTCGGCCCCCTCCTTGTCGCCC CACTGCTGTCCATGCCGGGCCCGCTTGGCTTTCCGGAACCTGGGCGCCCTG CTTCCCCGGCTGCACCAGCTGTGCTGCCGCATGCCCCGCACCCTGCGCCG GCTCTTCGTGGCTGAGCTGTGCAGCTGGATGGCACTCATGACCTTCACGCT GTTTTACACGGATTTCGTGGGCGAGGGGCTGTACCAGGGCGTGCCCAGAG CTGAGCCGGGCACCGAGGCCCGGAGACACTATGATGAAGGCGTTCGGAT GGGCAGCCTGGGGCTGTTCCTGCAGTGCGCCATCTCCCTGGTCTTCTCTCT GGTCATGGACCGGCTGGTGCAGCGATTCGGCACTCGAGCAGTCTATTTGG CCAGTGTGGCAGCTTTCCCTGTGGCTGCCGGTGCCACATGCCTGTCCCACA GTGTGGCCGTGGTGACAGCTTCAGCCGCCCTCACCGGGTTCACCTTCTCAG CCCTGCAGATCCTGCCCTACACACTGGCCTCCCTCTACCACCGGGAGAAG CAG*TGGAGGACTTTTGACCCGTCTCCTCACCTTCTGATACACACCAACCA ACCAGTCAACCAGCCATTGCTGTTTACTGGATACCT*GCTCATTGCTATGG ACAGTGCTATCACCCTGTGGCAGTTCCTTCTTCAGCTCCTGCAGAAGCCTC AGAACAAGCACATGATCTGTTGGACCTCTAATGATGGGCAGTTTAAGCTT TTGCAGGCAGAAGAGGTGG(SEQ ID NO :5)
融合转录子可以包含数个接头，这些接头一般不会在天然的SLC45A3或者ELK4 mRNAs中检测到。参见例如变异体4和变异体5。为了对特定融合转录子进行检测，可以根据接头位点周围的序列来设计引物或者探针。这些引物在本申请中也可以称为“接头-特异的”引物。一般来讲，接头处-特异的寡聚核苷酸引物或者探针在长度上至少应该是14或者 15个核苷酸，或者16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或者更多个核苷酸。接头处-特异的寡聚核苷酸引物或者探针被设计成与接头处具有足够的同一性，从而使引物或者探针在严格条件下能够特异性的与接头进行杂交。在一些特定实施例中，接头-特异的引物或者探针从接头一侧算起其包含至少3个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或者12个核苷酸。如果融合接头含有一个或者多个为两个连接的核苷酸所共有，则接头-特异的引物应该包括此等共有的所述一个或多个核苷酸，并且还应该包括从共有的核苷酸一侧算起的至少3个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或者12个核苷酸。在其它实施例中，尤其是对于基于扩增反应的检测，接头-特异的引物被设计成可以靶向更多的融合的5'伴侣而只能靶向较少的融合的3'伴侣，从而使得引物与天然的非融合SLA45A3或者ELK4 mRNA 之间的杂交最小化。换句话说，引物具有较大的5'部分，其可以与接头序列的一侧发生杂交而非与引物的3'部分杂交，该引物的3'部分其可以与接头的另一侧发生杂交。举例来讲，长度为18个核苷酸的接头-特异的引物可以包含长为12-14个核苷酸且与接头序列的一侧相对应的5'部分，以及长为4-6个核苷酸且与接头序列的另一侧相对应的3'部分。在一些特定实施例中，接头-特异的引物根据一接头来进行设计，在该接头处 SLC45A3部分和ELK4部分进行了融合。在一个实施例中，接头-特异的引物根据变异体1 (SEQ ID NO 1)的接头序列来进行设计。在一个特定实施例中，引物包含至少14到18个核苷酸，并包含SLC45A3外显子1 中正好位于变异体1接头点“G”核苷酸前方的至少4个或者5个核苷酸，以及ELK4外显子 2中正好位于接头点“G”核苷酸后方的至少4个或者5个核苷酸。在一些实施例中，接头-特异的引物根据变异体2_3(SEQ ID NO :2_3)的接头序列来设计。在一个特定实施例中，引物包含至少14到18个核苷酸，以及包含SLC45A3外显子 2中正好位于变异体2或者3接头点上的“GCTCATTG”共有片段的前方的至少3个或者4个核苷酸，以及ELK4外显子2中紧跟在接头点上共有片段后面的至少3或者4个核苷酸。类似地，可以将那些根据鉴定得到的变异体的接头氨基酸序列专门设计的多肽用于制备抗体，这些抗体可以用于检测特定的融合蛋白变异体是否存在以及存在的水平。如上所述，为了得到更加准确的诊断结果，基于检测SLC45A3-ELK4融合分子的诊断方法可以同其它的诊断方法组合使用。其它诊断方法包括，例如测定其它与癌症相关的融合分子，含有与前列腺癌相关的基因融合分子，例如雄激素调节的跨膜蛋白酶-丝氨酸 2(TMPRSS2)基因与转录因子ETS家族中的基因(例如ERG)之间形成的基因融合分子，这些融合分子已经记载在已公开的第2007/0212702号美国申请中，以及SLC45A3基因和ERG 基因之间形成的融合分子。在以下实施例的实验中，没有检测到TMPRSS2-ERG基因融合和 SLC45A3-ELK4融合转录子之间存在相互排斥表达的情况。此外，还观察到数个具有较高 SLC45A3-ELK4转录水平的样品的ERG重排呈现阴性。相应地，对SLC45A3-ELK4融合分子进行检测这可以为那些基于检测包含ERG在内的融合分子(包括，TMPRSS2-ERG基因融合) 的诊断方法提供有利的补充。融合分子检测的技术和方法
融合核苷酸分子可以通过各种已知的核酸类技术来进行检测，包括杂交技术(例如液相杂交、原位杂交(ISH)比如荧光ISH(FISH)、生物芯片(microarry)、Northern杂交和 Southern杂交)；扩增反应(例如聚合酶链式反应(PCR)，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、 转录介导的扩增方法(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和核酸序列依赖性扩增(NASBA))以及测序。融合蛋白的检测可以通过检测各种已知的可以用来检测蛋白的分析物来实现，包括例如，免疫分析(例如免疫沉淀、Western杂交、ELISA、免疫组化、免疫细胞化学和流式细胞技术)。组合物和试剂念本发明还提供了可用在上述诊断方法中的组合物和试剂盒，包括，例如适合用于扩增反应的引物或者引物对、适合用于杂交的探针，其包括接头-特异的引物和探针，以及抗体。引物对可以包括接头-特异的引物和非接头-特异的引物。引物和探针可以使用能够产生可检测信号或者能够固定在固相载体上的试剂或者化合物进行标记。其它用涂在另一个实施例中，本发明还提供了一种筛选抗癌化合物的方法。具体地说，该方法是通过检测候选化合物在癌细胞中降低SLC45A3-ELK4融合分子表达水平或者抑制 SLC45A3-ELK4融合分子生物功能的能力来筛选出合适的化合物。这一方法可以通过在体外使用具有高水平SLC45A3-ELK4融合分子的癌细胞系来实现。候选化合物例如可以包括，核酸分子、小的有机分子和抗体。鉴定出来的化合物可以降低融合分子的mRNA水平或者蛋白水平。在另一个实施例中，本发明提供了一种治疗以高水平的SLC45A3-ELK4融合分子为特征的癌症的方法。高水平的SLC45A3-ELK4融合分子可以在特殊的组织或者器官，和/ 或者血液或者尿液样品中检测到。治疗方法包括给予癌症患者某一试剂，该试剂能够抑制融合分子的生物功能，或者降低融合分子的水平。该试剂可以是小分子、siRNA、反义核苷酸或者抗体中的任意一种，亦或者是它们的组合。siRNAs是指小干扰RNAs，其可以包括长约 18-30或者20-25个核苷酸的双链区域。双链区域中的一条链与靶标RNA分子相同或者基本同源。双链区域可以由两条独立的RNA链形成或者由一个单独的RNA分子形成(即发夹结构)。在一个实施例中，抗癌试剂包含siRNA，其被设计成靶向SLC45A3-ELK4融合转录子中的接头区域。以下实施例可以参考作为本申请内容一部分的附图，这些附图通过图示的方式对可能实施的特定实施方式进行了说明。对这些实施方式进行详细描述的目的是为了使本领域技术人员能够实施本发明，应该理解的是，在不脱离本发明精神的前体下还可以使用其它实施方式来实施本发明。因此，以下对实施方式的描述不应对本发明构成任何限制，本发明的范围由所附的权利要求书确定。
实施例在以下实施例中，所有的细胞系均购自American Type Culture Collection(ATCC ,Manassas, VA) 0根据供应商的使用手册培养细胞。按照以下方式进行组织样品处理和RNA提取使用苏术精和伊红(H&E)玻片对癌症范围和肿瘤等级(Gleason评分)进行评估。从相应的冷冻组织块切取1. 5mm的皮区，对含有高密度癌症病灶(< 10% 间质的或者其它的非肿瘤组织的污染物)的区域进行评分。根据制造商提供的操作方法，利用 TRIzol 试剂(Invitrogen，Invitrogen, Carlsbad, CA)分离 RNA。然后对 RNA 进行DNase核酶处理Qnvitrogen)并使用NanoDrop8000分光光度计进行定量(Thermo Scientific, Wilmington, DE)。最后，使用生物芯片分析系统 2100 (Agilent Technologies Inc.，Santa Clara, CA))对RNA的特性进行检测。
实施例1 前列腺癌、良性前列腺组织和LNCaP细胞系中SLC45A3-ELK4 mRNA的表达。使用TAQMAN方法对SLC45A3-ELK4转录子的表达进行筛选。这一方法靶向SLC45A3 的外显子1和ELK4外显子2，这是基于SLC45A3和ETVl和ETV5之间的融合接头(图la)来实现的，需要注意的是这两个已知的野生型ELK4 mRNA变异体(NM_001973和NM_021795)在 3'区域处的区别。首先，从以下材料中筛选得到RNA:31个前列腺癌组织样品、6个良性前列腺组织样品和11个细胞系。其中该11个细胞系包括，恶性前列腺细胞系(LNCaP、PC-3、 22Rvl、VCaP、NCI-H660、DU-145)、非前列腺细胞系(人上皮样肾腺癌细胞系ACHN、Caki-I、 A-498、HK-2)，以及非恶性前列腺上皮细胞系(RWPE-I)。尽管SLC45A3-ELK4 mRNA转录子的表达非常低(图lb)，但几乎所有的样品都是可以检测到的。三个前列腺癌样品表现出 SCL45A3-ELK4的高表达，其表达水平要比良性前列腺组织计算得到的平均水平高10倍。剩下的前列腺癌样品表现出与良性组织样品相似的低水平的SLC45A3-ELK4 mRNA水平。在被检测的所有前列腺样品中，内源性的ELK4 mRNA水平变化较大。内源性的ELK4 mRNA水平和 SLC45A3-ELK4 mRNA水平之间有很好的总相关性(r = 0. 86)，有些样品中这两个转录子的表达值具有明显差异(例如，样品423_(、20_1\522_0、91_1\1702_(、1765_4、似8_4和1701_ A)。在PC-3和LNCaP细胞以及人上皮样肾腺癌细胞系ACHN中，发现SLC45A3-ELK4水平相对增加。
实施例2 前列腺癌中SLC45A3-ELK4 mRNA变异体的检测。为了表征SLC45A3-ELK4转录子的组成，使用对应于SLC45A3外显子1和ELK4外显子2的引物，进行常规的RT-PCR实验，然后对扩增产物进行cDNA测序，其中扩增产物来自以下样品35个前列腺癌样品、6个良性样品、6个前列腺癌细胞系(NCI-H660、VCaP、PC3、 LNCaP, DU145、22-RV1)和1个良性细胞系(RWPE-I)。参见图2。鉴于这一方法敏感度较低，所以只有多数样品得到一主产物，该主产物由SLC45A3外显子1以及与其融合在一起的ELK4外显子2组成(图lc，见下面所示的变异体1的接头序列)。检测到三个罕见的产物，其由SLC45A3的不同外显子以及与其融合在一起的ELK4外显子2组成。发现了一种意料之外的扩增产物(变异体4)，其由SLC45A3外显子1、2和4的全部或者部分组成，且所述的这些外显子的全部或者部分与来自染色体1区域的84个碱基对发生融合，并在其后面还跟着ELK4外显子2，其中所述染色体1区域将SLC45A3和ELK4分隔开来。为了使用无偏方法验证SLC45A3-ELK4mRNA的表达，对样品1701_A进行5 ‘ RNA连接酶介导的cDNA 末端快速扩增(RACE)。还鉴定得到了另一种SLC45A3-ELK4 mRNA变异体(变异体5)，该变异体由SLC45A3外显子1-3组成，这些外显子融合到与前述相同的84个碱基对序列上， 并在其后面跟着ELK4外显子2。与前列腺癌中表现出的其它融合不同，这些数据所代表的 SLC45A3-ELK4融合是异质的，其中有些融合可以在其融合转录子内含有基因间染色体序列。
常规RT-PCR。在以下条件下对SLC45A3-ELK4转录子讲行定件检测使用Platinum Taq DNA聚合酶试剂盒(Invitrogen)并以50ng cDNA作为模板，反应体积为25 μ 1。PCR反应使用的引物是SLC45A外显子1中的正向引物(5 ‘ -CCGCGGAGTAACCTGGAGATTT-3 ‘，SEQ ID NO 37)和 ELK4 外显子 2 中的反向引物(5' -TGCCCATCATTAGAGGTCCAACAG-3 ‘，SEQ ID NO 38)；链式反应的循环条件是94°C下预变性2分钟，94°C下30秒，56°C下30秒，68°C下 1分钟，共计40个循环，最后在68°C下进行10分钟终延伸。使用2. 5%的琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。cDNA泖丨序。使用MinElute 凝胶分离试剂盒Oliagen)分离与预期的融合转录子尺寸相对应的DNA片段，然后在康奈尔大学生命科学中心实验室(伊萨卡，纽约州)的DNA 测序设施中对该DNA片段进行测序。
实施例3 利用非停入的方法对SLC45A3-ELK4 mRNA进行检测。利用SLC45A3-ELK4 TAQMAN方法，对14个经过预活检和直肠指检后的尿液样品进行检测，该尿液样品来自具有患前列腺癌高风险的男性。根据活检的前列腺组织的病理学报告，14个待测样品中的8个被诊断为前列腺癌(图Id)。对8个相应尿液样品中的6个和6个样品中的2个中的SLC45A3-ELK4转录子的水平进行检测，检测结果表明灵敏度为 75%，特异性为67%，其中，所述6个样品来自预活检未显示有前列腺癌的男性。有趣的是， 如同在前列腺组织中所看到的，只有在几个前列腺癌相关的样品中检测到高水平表达(> 10倍)。下表1是所有14个被分析样品中具有足够高TCFLl值的样品的例联表。根据该表，通过检测尿液中SLC45A3-ELK4水平来作为前列腺癌生物标志物方法的敏感度为75%， 特异性为67%，是否为前列腺癌根据活检材料的结果来确定。
表权利要求
1.一种检测生物样品中与前列腺癌有关的融合分子的方法，其包括提供含有核酸的生物样品，并检测融合转录子的水平，所述融合转录子代表SLC45A3 mRNA的5'部分和ELK4 mRNA的3'部分之间的融合，其中，当所述融合转录子的水平高于对照水平时，表示生物样品中存在前列腺癌细胞或者来自前列腺癌细胞的核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品选自由前列腺组织、血液、尿液、精液、 前列腺分泌物和前列腺细胞组成的组。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品来自经过直肠指检的患者的尿液。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述SLC45A3mRNA的5'部分包含SLC45A3 mRNA 的外显子1的至少一部分。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述SLC45A3mRNA的5'部分包含SLC45A3 mRNA 的外显子1和至少一部分外显子2。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述SLC45A3mRNA的5'部分包含，SLC45A3 mRNA的外显子1和至少一部分外显子2，还包含至少一种以下组件SLC45A3 mRNA的外显子3或者外显子4或者它们的一部分。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述ELK4mRNA的3'部分包含所述ELK4 mRNA 的外显子2的至少一部分。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述ELK4mRNA的3'部分包含所述ELK4 mRNA 的外显子2和外显子北。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述ELK4mRNA的3'部分包含所述ELK4 mRNA 的外显子2、外显子3a、外显子4和外显子5。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，融合转录子的检测通过使用以下方法实现核酸扩增的方法、核酸杂交的方法，或者核酸扩增和核酸杂交结合的方法。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，融合转录子的检测通过使用核酸扩增方法实现，该方法选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、转录介导的扩增方法(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和核酸序列依赖性扩增(NASBA)。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，核酸扩增方法通过使用第一引物和第二引物来完成，其中，所述第一引物特异于SLC45A3 mRNA外显子1的一部分或者特异于SLC45A3 mRNA外显子1所述部分的完全互补序列，所述第二引物特异于ELK4 mRNA外显子2的一部分或者特异于ELK4 mRNA外显子2的所述部分的完全互补序列。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述核酸扩增方法通过使用这样的引物来完成，该引物包含至少一种特异于SLC45A3-ELK4融合转录子中SLC45A3序列和ELK4序列之间的接头的引物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述引物特异于任意一种如SEQID NOS 1-5 所示的变异体的SLC45A3序列和ELK4序列之间的接头。
15.根据权利要求10所述的方法，其中，所述杂交方法选自原位杂交、微点隈杂交、液相杂交和Northern杂交组成的组。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述杂交方法通过使用寡聚核苷酸探针来完成，该寡聚核苷酸探针特异于SLC45A3-ELK4融合转录子中SLC45A3序列和ELK4序列之间的接头。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述探针特异于任意一种SEQID N0S:1_5所示的变异体所含有的SLC45A3序列和ELK4序列之间的接头。
18.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括检测TMPRSS22和ERG基因组序列之间的基因融合。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测步骤使用表2中公开的寡聚核苷酸的任意组合，所述寡聚核苷酸选自SEQ ID NOS 9-36组成的组。
20.一种用于检测与前列腺癌相关的融合分子的组合物，其包含至少一种以下组份(a)寡聚核苷酸，其含有可以与接头杂交的序列，在该接头处SLC45A3mRNA的5'部分和ELK4 mRNA的3'部分发生融合；(b)可以与SLC45A3mRNA的5'部分进行杂交的第一寡聚核苷酸，以及可以与ELK4 mRNA的3'部分进行杂交的第二寡聚核苷酸；(c)特异于一表位的抗体，该表位对应于SLC45A3-ELK4融合转录子编码的嵌合蛋白接头处上的氨基酸序列；或者(d)抗体，其特异于SLC45A3-ELK4融合转录子所编码的嵌合蛋白。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中，组(a)的寡聚核苷酸可以与变异体1(SEQ ID NO :1)、变异体 2 (SEQ ID NO 2)、变异体 3 (SEQ ID NO 3)、变异体 4 (SEQ ID NO 4)或者变异体5(SEQ ID NO 5)的接头发生特异性杂交；或者可以与SEQ ID Nos. 1-5中的任意一条序列的完全互补序列中存在的与接头序列完全互补的序列特异性杂交。
22.根据权利要求20所述的组合物，其中，组(b)中的第一和第二寡聚核苷酸选自表2 公开的寡聚核苷酸的组合，所述寡聚核苷酸选自SEQ ID NOS :9-36组成的组。
23.一种治疗患者前列腺癌的方法，其包括给予患者一试剂，该试剂能够抑制融合转录子的生物功能或者降低融合转录子的水平，所述融合转录子中SLC45A3 mRNA的5'部分与 ELK4 mRNA的3'部分相融合。
24.一种鉴定可用于治疗患者前列腺癌的试剂的方法，其包括提供具有高水平的融合转录子的细胞，该融合转录子中SLC45A3 mRNA的5'部分与ELK4 mRNA的3'部分相融合；将所述细胞暴露给候选试剂；从而鉴定出那些能够抑制融合转录子的生物功能或者降低融合转录子水平的试剂。
全文摘要
本申请涉及与前列腺癌相关的RNA转录子，该转录子是人SLC45A3核酸和人ELK4核酸的融合体。本申请还提供了可以用来检测与癌症相关的人SLC45A3和ELK4遗传序列形成的融合转录子的组合物和方法，以及用于治疗癌症的组合物和方法。
文档编号C12N15/62GK102439174SQ201080017474
公开日2012年5月2日 申请日期2010年2月19日 优先权日2009年2月19日
发明者D·S·瑞克曼, M·A·鲁宾, 多罗泰·菲戈 申请人:康奈尔大学