专利名称：通过抑制针对胶质细胞衍生神经营养因子(gdnf)的天然反义转录物来治疗gdnf相关的疾病的制作方法
技术领域：
本申请要求保护提交于2009年2月12日的美国临时申请第61/152，239号的权益，所述申请案通过引用以其整体结合于本文中。本发明的实施方案包括调节⑶NF和相关分子的表达和/或功能的寡核苷酸。
背景技术：
DNA-RNA和RNA-RNA杂交对于核酸功能的许多方面(包括DNA复制、转录和翻译) 而言为重要的。杂交对于探测特定核酸或者改变其表达的各种技术而言亦为主要的。反义核苷酸例如通过与靶RNA杂交来扰乱基因表达，从而干扰RNA剪接、转录、翻译和复制。 反义DNA具有附加的特征，该特征为DNA-RNA杂合体充当核糖核酸酶H消化的底物，该活性存在于大多数细胞类型中。可将反义分子递送到细胞中，这与寡脱氧核苷酸(ODN)的情况一样，或者它们如RNA分子一样可由内源基因表达。FDA最近批准了一种反义药物， VITRAVENE (用于治疗巨细胞病毒视网膜炎)，这反映了反义物具有治疗应用。发明概述提供本概述以呈现本发明的概述，从而简要地指出本发明的性质和实质。在理解以下的情况下提出本概述其不会用于解释或限制权利要求的范围或含义。在一个实施方案中，本发明提供通过使用靶定天然反义转录物的任何区域的反义寡核苷酸来抑制天然反义转录物的作用，引起相应有义基因的增量调节的方法。本文也考虑天然反义转录物的抑制可通过siRNA、核酶和小分子来达到，认为所述siRNA、核酶和小分子在本发明的范围之内。一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中的GDNF多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括用长度为5-30个核苷酸的反义寡核苷酸接触所述细胞或组织，其中所述寡核苷酸与以下多核苷酸的反向互补序列具有至少50%的序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO :2的核苷酸1-237或SEQ ID NO :3的核苷酸1-1246或SEQ ID NO 4的核苷酸1-684(图3)或者SEQ ID NO 42的核苷酸1-400或SEQ ID NO 43的核苷酸1-619或SEQ ID NO 44的核苷酸1-813之内的5_30个连续核苷酸；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的GDNF多核苷酸的功能和/或表达。在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸靶定GDNF多核苷酸的天然反义序列，例如 SEQ ID NO 2-4和42-44所述的核苷酸，以及其任何变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。反义寡核苷酸的实例如SEQ ID NO 5-34所述(图4)。另一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中GDNF多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括用长度为5-30个核苷酸的反义寡核苷酸接触所述细胞或组织，其中所述寡核苷酸与GDNF多核苷酸的反义物的反向互补序列具有至少50%的序列同一性；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中⑶NF多核苷酸的功能和/或表达。另一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中GDNF多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括用长度为5-30个核苷酸的反义寡核苷酸接触所述细胞或组织，其中所述寡核苷酸与GDNF反义多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50%的序列同一性；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中⑶NF多核苷酸的功能和/或表达。在优选的实施方案中，组合物包含一种或多种与有义和/或反义GDNF多核苷酸结合的反义寡核苷酸。在另一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸包含一个或多个经修饰或取代的核苷酸。在另一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸包含一个或多个经修饰的键。在又一个实施方案中，所述修饰核苷酸包含经修饰的碱基，其包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’ -0-甲基、氟或碳、亚甲基或其他锁定核酸(LNA)分子。优选地，所述修饰核苷酸为锁定核酸分子，包括a-L-LNA。在另一个优选的实施方案中，将所述寡核苷酸经皮下、肌内、静脉内或腹膜内给予
^^ ο在另一个优选的实施方案中，将所述寡核苷酸在药物组合物中给予。治疗方案包括至少一次向患者给予反义化合物；然而，可将此治疗修改成在一段时间内包含多次给药。 所述治疗可与一种或多种其它类型的疗法组合。在另一个优选的实施方案中，将所述寡核苷酸封装到脂质体中或附着于载体分子 (例如胆固醇、TAT肽)。其它方面描述于下文。附图
简述图 1图IA 为实时PCR结果的图表，显示相比于对照，用硫代磷酸寡核苷酸处理HUVEC 细胞后⑶NF mRNA的倍数变化+标准偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine 2000 引入。表示为 CUR-Ol 17、CUR-Ol 18、CUR-Ol 19、CUR-0120、CUR-0121 和 CUR-0122 的条分别对应用SEQ ID NO 5-10处理的样品。图IB 为实时PCR结果的图表，显示相比于对照，用硫代磷酸寡核苷酸处理HUVEC 细胞后⑶NF mRNA的倍数变化+标准偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine 2000引入。实时PCR结果显示⑶NF反义物的水平在用⑶R-Ol 17处理后显著减少。表示为 CUR-Ol 17和CUR-Ol 18的条分别对应用SEQ ID NO 5和6处理的样品。图IC 为实时PCR结果的图表，显示相比于对照，用硫代磷酸寡核苷酸处理IfepG2 细胞后⑶NF mRNA的倍数变化+标准偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine 2000引入。表示为CUR-0741至CUR-0764的条分别对应用SEQ ID NO 11-34处理的样品。图ID 为实时PCR结果的图表，显示相比于对照，用硫代磷酸寡核苷酸处理Vero 细胞后⑶NF mRNA的倍数变化+标准偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine 2000引入。表示为CUR-0741至CUR-0764的条分别对应用SEQ ID NO 11-34处理的样品。图IE 为实时PCR结果的图表，显示相比于对照，用硫代磷酸寡核苷酸处理CHP212 细胞后⑶NF mRNA的倍数变化+标准偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine 2000 引入。表示为 CUR-0751、CUR-0752、CUR-0753、CUR-0120、CUR-0121 和 CUR-0117 的条分别对应用SEQ ID NO :21、22、23、8、9和5处理的样品。图2显示SEQ ID NO 1 人类(Homo sapiens)胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)、转录物变体3、mRNA(NCBI检索号NM_199234. 1)，以及SEQ ID NO 45显示⑶NF的基因组序列(外显子用大写字母显示，内含子用小写字母显示)。图3显示SEQ ID NO 2 天然反义序列(AW883557. 1 (A))SEQ ID NO :3:天然反义序列(BM547433 (PR))SEQ ID NO 4 天然反义序列(BX505687)图4显示反义寡核苷酸，SEQ ID NO :5_34。*指硫代磷酸酯键。图 5 显示 SEQ ID NO :35_41。图6显示SEQ ID NO 42 天然反义序列(AW883557. 1 (A))可变剪接 aSEQ ID NO :43 天然反义序列(AW883557. 1 (A))可变剪接 bSEQ ID NO 44 天然反义序列(AW883557. 1 (A))可变剪接 c发明详述参考用于说明的示例应用在下文中描述本发明的数个方面。应当理解的是，陈述许多具体细节、关系和方法来提供对本发明的充分理解。然而，在相关领域的普通技术人员将容易地认识到，可在不含一个或多个具体细节的情况下实施本发明或者可用其他方法来实施本发明。本发明不受行为或事件的排序限制，因为一些行为可以不同的顺序进行和/ 或与其他行为或事件同时进行。此外，并非所有说明性的行为或事件对实施本发明的方法都为必需的。本文公开的所有基因、基因名称和基因产物意图对应来自任何物种的同源物，对该物种而言本文公开的组合物和方法为适用的。因此，该术语包括但不限于来自人和小鼠的基因和基因产物。理解的是，当公开来自具体物种的基因或基因产物时，意图此公开仅为示范性的，并且除非其出现的文段中明确指示，否则不应理解为限制。因此，例如，对于本文公开的在一些实施方案中有关哺乳动物核酸和氨基酸序列的基因而言，意图包括来自其他动物(包括但不限于其他哺乳动物、鱼类、两栖动物、爬行动物和鸟类)的同源和/或直向同源基因和基因产物。在优选的实施方案中，所述基因或核酸序列为人的。定义本文所用的术语仅以描述具体的实施方案为目的而不意图限制本发明。除非文段另有明确指示，否则本文所用的单数形式“一”、“一个”和“所述”也意图包括复数形式。此外，就术语“包括的”、“包括”、“具有的”、“具有”、“含有”或其变型在详述和/或权利要求中所用的程度而言，这类术语意图以类似于术语“包含”的方式是包括在内的。术语“约”或“大约”意为在由本领域普通技术人员所确定的具体值的可接受误差范围之内，这部分取决于该值是如何测定或确定的，即，测量系统的限制。例如，按照本领域的实践，“约”可意为在1之内或大于1的标准偏差。或者，“约”可意为高达给定值的20%， 优选10%，更优选5%，和还更优选1 %的范围。或者，具体地关于生物系统或过程，该术语可意为在值的一个数量级之内，优选在值的5倍之内，更优选在2倍之内。当本申请和权利要求描述具体值时，除非另作说明，否则应假设术语“约”意为在具体值的可接受误差范围之内。本文所用的术语“mRNA”意为目前已知的靶定基因的mRNA转录物，以及任何可阐明的其它转录物。“反义寡核苷酸”或“反义化合物”意为与另一个RNA或DNA (靶RNA、DNA)结合的 RNA或DNA分子。例如，如果其为RNA寡核苷酸，则其通过RNA-RNA相互作用结合另一个RNA 靶标并改变靶RNA的活性(Eguchi等，(1991) Ann. Rev. Biochem. 60，631-652)。反义寡核苷酸可增量调节或减量调节特定多核苷酸的表达和/或功能。该定义意在包括从治疗、诊断或其他观点来看有用的任何外源RNA或DNA分子。这类分子包括例如反义RNA或DNA分子、 干扰RNA(RNAi)、微小RNA、诱饵RNA分子、siRNA、酶促RNA、治疗用编辑RNA(therapeutic editing RNA)以及激动剂和拮抗剂RNA、反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列 (EGS)寡核苷酸、可变剪接物(alternate splicer)、引物、探针以及其他与靶核酸的至少一部分杂交的寡聚化合物。因此，可将这些化合物以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。在本发明的文段中，术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA) 或其模拟物的寡聚物或聚合物。术语“寡核苷酸”，也包括天然和/或经修饰单体或键 (linkage)的线性或环状寡聚体，包括脱氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和α-异头物形式、 肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能够通过单体与单体相互作用的规律模式(例如沃森-克里克(Watson-Crick)型碱基配对、Ho0gsteen或反 Hodgsteen型碱基配对等)特异地结合靶多核苷酸。寡核苷酸可为“嵌合的”，即，由不同的区组成。在本发明的文段中，“嵌合的”化合物为寡核苷酸，其包含两个或更多个化学区，例如，DNA区、RNA区、PNA区等。每个化学区由至少一个单体单元(即，在寡核苷酸化合物的情况下为核苷酸)组成。这些寡核苷酸典型地包含至少一个区，其中所述寡核苷酸为经修饰的以表现出一种或多种所需特性。寡核苷酸的所需特性包括但不限于，例如增强的对核酸酶降解的抗性、增强的细胞摄取和/或增强的对靶核酸的结合亲和力。因此寡核苷酸的不同区可具有不同的特性。本发明的嵌合寡核苷酸可形成为两种或更多种如上所述的寡核苷酸、修饰寡核苷酸、寡聚核苷和/或寡核苷酸类似物的混合结构。寡核苷酸可由可“全符合状态(in “register”)”地连接或通过间隔物连接的区组成，所述“全符合状态”地连接即此时单体像在天然DNA —样连续地连接。所述间隔物意在构成区之间的共价“桥”，并在优选的情况下具有不超过约100个碳原子的长度。所述间隔物可携带不同的功能性，例如具有正或负电荷的、具有特殊的核酸结合特性(嵌入剂、沟黏合剂、毒素、荧光团等)、为亲脂的、诱导特殊的二级结构如例如诱导α -螺旋的含丙氨酸的肽。本文所用的“⑶NF”和“胶质细胞衍生神经营养因子”包括所有家族成员、突变体、 等位基因、片段、种类(species)、编码和非编码序列、有义和反义多核苷酸链等。本文所用的措词“胶质细胞衍生神经营养因子”、“胶质细胞系衍生神经营养因子”、“胶质细胞-衍生神经营养因子”、“星形胶质细胞衍生营养因子”、“ATF”、“ATF1”、 “ATF2”、“HFBl-GDNF”、“hOTNF，m⑶NF，在文献中都被认为相同且在本申请中可交换地使用。本文所用的术语“对......特异的寡核苷酸”或“靶定......的寡核苷酸”是指具
有以下序列的寡核苷酸，该序列(i)能够与靶定基因的一部分形成稳定的复合体，或(ii)能够与靶定基因的mRNA转录物的一部分形成稳定的双链体。复合体和双链体的稳定性可通过理论计算和/或体外测定来确定。用于确定杂交复合体和双链体的稳定性的示例性测定法描述于下文实施例中。本文所用的术语“靶核酸”包括DNA、从这类DNA转录的RNA (包括前mRNA和mRNA)， 以及从这类RNA衍生的cDNA、编码序列、非编码序列、有义或反义多核苷酸。寡聚化合物与其靶核酸的特异性杂交干扰核酸的正常功能。这种通过特异地与靶核酸杂交的化合物对该靶核酸功能的调节，一般称为“反义”。待干扰的DNA功能包括例如复制和转录。待干扰的 RNA功能，包括所有的生活机能，例如，RNA向蛋白质翻译位点的易位、蛋白质自RNA的翻译、 产生一种或多种mRNA种类的RNA剪接，以及可由RNA参与或促进的催化活性。对靶核酸功能的这类干扰的整体效果为对编码产物或寡核苷酸表达的调节。RNA干扰“RNAi ”由双链RNA (dsRNA)分子介导，该分子具有与其“靶”核酸序列的序列特异性同源性(Caplen，N. J.等，(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 :9742-9747)。在本发明的某些实施方案中，介体为5-25个核苷酸的“小干扰”RNA双链体(siRNA)。siRNA通过称为切酶的 RNA 酶对 dsRNA 的加工得到(Bernstein, E.等，(2001) Nature 409:363-366)。 siRNA双链体产物被募集到叫做RISC(RNA诱导的沉默复合体)的多蛋白siRNA复合体中。 不希望受任何具体理论所约束，认为随后RISC被引向靶核酸(适当地为mRNA)，其中siRNA 双链体以序列特异性的方式相互作用来介导催化方式的切割(Bernstein，Ε.等，Q001) Nature 409 :363-366 ；Boutla，A.等，(2001)Curr. Biol. 11 :1776-1780)。可依照本发明使用的小干扰RNA，可根据本领域众所周知和普通技术人员熟悉的程序来合成和使用。用于本发明的方法中的小干扰RNA适当地包含约1-约50个核苷酸(nt)。在非限制性实施方案的实例中，siRNA可包含约5-约40nt、约5-约30nt、约10-约30nt、约15-约25nt、或约 20-25个核苷酸。适当寡核苷酸的挑选通过使用电脑程序来促进，该程序自动比对核酸序列并指出具有同一性或同源性的区。将这类程序用于比较通过例如搜索诸如GenBank等的数据库或通过测序PCR产物而获得的核酸序列。对来自一系列物种的核酸序列的比较，允许选择在物种之间显示适度同一性的核酸序列。在未测序基因的情况下，进行DNA印迹来确定在靶物种和其他物种的基因之间的同一性程度。如本领域众所周知的，通过在不同的严格程度下进行DNA印迹，可能获得同一性的近似衡量。这些程序允许选择以下寡核苷酸，其对待控制的受试者中的靶核酸序列表现出高度的互补性，并且对其他物种中的相应核酸序列表现出较低程度的互补性。本领域的技术人员将认识到，在挑选用于本发明的适当的基因区方面具有相当大的自由。“酶促 RNA"意为具有酶活性的 RNA 分子(Cech，(1988) J. American. Med. Assoc.沈0，3030-3035)。酶促核酸(核酶)通过首先结合靶RNA来起作用。这类结合通过酶促核酸的靶结合部分进行，所述靶结合部分保持紧密靠近进行切割靶RNA的分子的酶部分。因此，酶促核酸首先识别而后通过碱基配对结合靶RNA，且一旦结合到正确的位点，即进行酶促切割靶RNA。“诱饵RNA”意为模拟配体的天然结合域的RNA分子。因此诱饵RNA与天然结合靶标竞争与特异性配体的结合。例如，已显示HIV反式激活应答(TAR)RNA的过表达可充当“诱饵”并有效地结合HIV tat蛋白，从而阻止其结合到在HIV RNA中编码的TAR序列
1(Sullenger等，(1990) Cell，63，601-608)。这意指特定实例。本领域的技术人员将认识到， 这只是一个实例，而其他的实施方案可使用本领域一般已知的技术容易地产生。本文所用的术语“单体”通常指以下单体，其通过磷酸二酯键或其类似物连接以形成大小范围从少量单体单元(例如从约3-4)到约数百个单体单元的寡核苷酸。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯等，如下文更充分地描述。术语“核苷酸”涵盖天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸。本领域的技术人员应清楚的是，先前认为“非天然存在”的多种核苷酸后来已在自然中发现。因此，“核苷酸”不仅包括已知的含嘌呤和嘧啶杂环的分子，而且还包括其杂环类似物和互变异构体。其他类型的核苷酸的说明性实例为以下分子，其含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮杂黄嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、N4, N4-桥亚乙基胞嘧啶(ethanocytosin)、N6, N6-桥亚乙基_2，6_ 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷和在Bermer等美国专利第5，432，272号中描述的“非天然存在的”核苷酸。术语“核苷酸”意在涵盖这些实例以及其类似物和互变异构体中的每一个和全部。尤其令人关注的核苷酸为含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸，其被认为是有关人中的治疗和诊断应用的天然存在核苷酸。核苷酸包括天然 2，-脱氧和 2，-羟基糖，例如，如 Kornberg 和 Baker，DNA 复制(DNA Replication)，第 2 版(Freeman，San Francisco, 1992)中所述的以及其类似物。提及核苷酸的“类似物”包括具有经修饰的碱基部分和/或经修饰的糖部分的合成核苷酸(参见例如，由Scheit，核苷酸类似物(Nucleotide Analogs), John Wiley, New York，1980 ;Freier 禾口 Altmann， (1997)Nucl. Acid. Res. ,25(22), 4429-4443, Toulme, J. J. , (2001)Nature Biotechnology 19 :17-18 ；Manoharan Μ. , (1999)Biochemica et Biophysica Acta 1489 :117-139 ；Freier S. Μ. , (1997)Nucleic Acid Research,25 4429-4443,Uhlman,E. ， (2000)Drug Discovery & Development，3 :203-213,Herdewin P.， (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev. , 10 :297-310 —般描述的)；2，-0，3，-C-连接的[3.2.0] 二环阿糖核苷(参加例如 N. K Christiensen.等，(1998) J.Am. Chem. Soc., 120 :5458-5463 ；Prakash TP,Bhat B. (2007)Curr Top Med Chem. 7(7) :641-9 ；Cho EJ 等， (2009) Annual Review of Analytical Chemistry，2，24H64)。这类类似物包括设计以增强结合特性的合成核苷酸，所述结合特性为例如双链体或三链体稳定性、特异性等。本文所用的“杂交”意为寡聚化合物的基本上互补链的配对。一种配对的机理涉及寡聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基(核苷酸)之间的氢键合，其可为沃森-克里克、Ho0gsteen或反Hoegsteen氢键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶为互补的核苷酸，其通过形成氢键配对。杂交可在各种环境下发生。反义化合物为“可特异地杂交的”，如果所述化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能而导致功能和/或活性的调节，并且在需要特异性结合的条件下存在足够程度的互补性来避免所述反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合，所述条件即在体内测定或治疗性处理情况中的生理条件下，以及其中在体外测定情况下进行测定的条件下。本文所用的短语“严格杂交条件”或“严格条件”是指以下条件，在该条件下本发明的化合物与其靶序列杂交，但与最少数量的其他序列杂交。严格条件为序列依赖的且在不同环境下将不同，在本发明的文段中，在其下寡聚化合物与靶序列杂交的“严格条件”由寡聚化合物的性质和组成以及正在其中研究它们的试验来确定。一般而言，严格杂交条件包括低浓度(< 0. 15M)的含有诸如Na++或K++等无机阳离子的盐(即，低离子强度)、温度高于20°C _25°C、低于寡聚化合物靶序列复合体的Tm，以及存在变性剂，例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜，或去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)。例如，杂交率对于每甲酰胺减少1. 1%。高严格杂交条件的实例为0. IX氯化钠-柠檬酸钠缓冲液(SSC)/0. 1% (w/v) SDS、60°C下达30分钟。本文所用的“互补的”是指在一条或两条寡聚链上两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果在反义化合物的某个位置上的核碱基能够与在靶核酸的某个位置上的核碱基氢键合，所述靶核酸为DNA、RNA或寡核苷酸分子，则认为所述寡核苷酸和所述靶核酸之间氢键合的位置为互补位置。当可彼此氢键合的核苷酸占据了每个分子中足够数量的互补位置时，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子为彼此互补的。因此，“可特异性杂交的”和“互补的”为以下术语，其用于表示在足够数量的核苷酸上有足够程度的精确配对或互补性，使得稳定和特异的结合发生在寡聚化合物和靶核酸之间。据本领域了解，寡聚化合物的序列不需要与其可特异地杂交的靶核酸的序列 100%互补。此外，寡核苷酸可在一个或多个区段上杂交，使得间插或邻近的区段不涉及杂交事件(例如，环结构、错配或发夹结构)。本发明的寡聚化合物包含与其靶定的靶核酸序列内的靶区至少约70 %、或至少约75 %、或至少约80 %、或至少约85 %、或至少约90 %、或至少约95%、或至少约99%的序列互补性。例如，其中反义化合物的20个核苷酸中有18个与靶区互补且因而会特异地杂交的反义化合物，表示90%互补性。在此实例中，余下的非互补核苷酸可与互补核苷酸是聚簇或散布的且不需要彼此邻接或邻接互补核苷酸。因此，长度为18个核苷酸的反义化合物具有4(四)个非互补核苷酸，该非互补核苷酸位于与靶核酸完全互补的两个区的侧翼，所述反义化合物会具有与靶核酸77. 8%的总互补性，因此落入本发明的范围内。反义化合物与靶核酸区的互补性百分比可使用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序常规地确定(Altschul等，(1990) J. Mol. Biol.，215，403-410 ;Zhang 和 Madden，(1997)Genome Res.，7，649-656)。同源性、序列同一性或互补性百分比可通过例如Gap程序(Wisconsin序列分析包，Unix操作系统版本8， Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)使用默认设置来确定，该程序使用 Smith 和 Waterman 的算法(Adv. Appl. Math.，(1981) 2，482-489)。本文所用的术语“解链温度(Tm) ”是指以下温度，在限定的离子强度、pH和核酸浓度下，在该温度下平衡时50%与靶序列互补的寡核苷酸与靶序列杂交。典型地，对于短寡核苷酸(例如，10-50个核苷酸)而言严格条件为以下条件，其中盐浓度至少为约0.01-1. OM Na离子浓度(或其他盐)，pH 7. 0-8. 3且温度至少为约30。。严格条件也可通过外加诸如甲酰胺等去稳定剂来达到。本文所用的“调节”意为在基因表达方面的增加(刺激)或减少(抑制)。术语“变体”，当用于多核苷酸序列的情况下时，可包括有关野生型基因的多核苷酸序列。此定义也可包括，例如，“等位基因的”、“剪接”、“物种”或“多态的”变体。剪接变体可具有与参比分子显著的同一性，但因为在mRNA加工期间外显子的可变剪接而通常具有更多或更少数量的多核苷酸。对应的多肽可具有附加的功能域或不存在域。物种变体为在不同物种之间不同的多核苷酸序列。本发明中尤其实用的是野生型基因产物的变体。变体可由核酸序列中的至少一个突变产生并可导致产生改变的mRNA或者其结构或功能可能改变或不变的多肽。任何给定的天然或重组基因可不具有、具有一个或许多等位基因形式。 产生变体的常见突变变化一般归因于核苷酸的自然缺失、添加或取代。这些变化类型中的每一个可单独或与其他类型联合发生，在给定序列中发生一次或多次。产生的多肽一般将具有相对于彼此的显著的氨基酸同一性。多态变体为在给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变化。多态变体也可包括“单核苷酸多态性”(SNP)或单碱基突变，其中多核苷酸序列因一个碱基而不同。SNP的存在可指示例如具有疾病状态倾向(即与抗性相对的易感性)的某个种群。衍生多核苷酸包括经过化学修饰的核酸，例如用烷基、酰基或氨基置换氢。衍生物 (例如，衍生寡核苷酸)可包含非天然存在的部分，例如改变的糖部分或糖间键。这些中示例性的是硫代磷酸酯及本领域已知的其他含硫的种类。衍生核酸也可含有标记，包括放射性核苷酸、酶、荧光剂、化学发光剂、显色剂、底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒，等等。“衍生的”多肽或肽为经修饰的多肽或肽，例如，通过糖基化、聚乙二醇化、磷酸化作用、硫酸盐化作用、还原/烷基化、酰化、化学偶联或温性福尔马林处理。也可将衍生物修饰以含有可检测标记(直接地或间接地)，包括但不限于放射性同位素、荧光和酶标记。本文所用的术语“动物”或“患者”意在包括例如人、棉羊、麋鹿、鹿、长耳鹿、貂、哺乳动物、猴、马、牛、猪、山羊、狗、猫、大鼠、小鼠、鸟、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蜘蛛类。“哺乳动物”涵盖通常在医疗护理下的温血哺乳动物(例如，人和驯养动物)。实例包括猫科动物、犬、马、牛科动物和人，以及仅仅人。“处理”或“治疗”涵盖对哺乳动物中疾病状态的治疗，并包括(a)防止疾病状态出现于哺乳动物中，特别是当这类哺乳动物倾向于疾病状态但尚未诊断为患有该疾病状态时；(b)抑制疾病状态，例如，阻止其发展；和/或(C)减轻疾病状态，例如，引起疾病状态的退行直到达到所需的终末点。治疗也包括改善疾病的症状(例如，减少疼痛或不适)，其中这类改善可直接或可非直接地影响疾病(例如，原因、传递、表达等)。本文所用的术语“癌症”是指任何恶性肿瘤，具体地在肺、肾脏或甲状腺中产生的恶性肿瘤。癌症自身表现为包含癌症恶性细胞的“肿瘤”或组织。肿瘤的实例包括肉瘤或癌，例如但不限于纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤(Ewing' s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、 腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏肿瘤(Wilms' tumor)、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、 成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。如上所述，本发明特别地允许肺、肾脏和甲状腺肿瘤的鉴别诊断。多核苷酸和寡核苷酸组合物和分子靶标在一个实施方案中，靶标包括胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)的核酸序列，包括但不限于与GDNF有关的有义和/或反义非编码和/或编码序列。神经营养因子的胶质衍生⑶NF家族包括四个成员胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白(neurturin)、artemin和pers印hin(PSPN)。GDNF家族配体通过受体传导信号，该受体由GPI连接的GFRa亚基和跨膜受体酪氨酸激酶RET组成。为了激活跨膜受体酪氨酸激酶Ret，每个GDNF家族神经营养因子优先地与糖基-磷脂酰肌醇(GPI) 连接的⑶NF家族α-受体(GFR α 1-4)之一结合。⑶NF为这样的蛋白，其可在神经胶质细胞中鉴定到或从神经胶质细胞中获得，且表现出神经营养活性。更具体地说，GDNF为这样的多巴胺能(dopiminergic)神经营养蛋白，其特征部分地在于其增加黑质多巴胺能神经元胚胎前体的多巴胺摄取的能力，并进一步在于其促进副交感和交感神经细胞生存的能力。在优选的实施方案中，将反义寡核苷酸用于预防或治疗这样的疾病或病症，所述疾病或病症与治疗解耦蛋白活性增加或减少相关的疾病有关。可用由使用反义化合物获得的干细胞再生的细胞/组织治疗的疾病实例包括缺陷性神经发生有关的疾病或病症； 神经变性疾病或病症(例如，阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩侧索硬化等)；神经精神障碍(抑郁症、精神分裂症、精神分裂症样精神障碍(schizofreniform disorder)、情感分裂性精神障碍和妄想性障碍；焦虑性障碍例如惊恐性障碍、恐怖症(包括广场恐怖症)、强迫性神经失调、创伤后应激障碍、双相性精神障碍、神经性厌食、神经性贪食、中枢神经系统的自身免疫性疾病(例如，多发性硬化)、记忆丧失、长期或短期记忆障碍、良性健忘、儿童学习障碍、闭合性颅脑损伤、注意力缺陷障碍、对病毒感染的神经元反应、脑损伤、发作性睡病、睡眠障碍(例如，昼夜节律障碍、失眠症和发作性睡病)；神经中断或神经损伤、脑脊髓神经索(CNS)中断和脑或神经细胞损伤、与AIDS有关的神经功能缺损、以运动和/或发声性抽搐(vocal tic)为特征的运动和抽搐障碍(例如，图雷特精神障碍(Tourette' s disorder)、慢性运动或发声性抽搐障碍、短时抽搐性障碍和刻板型活动障碍)、物质滥用病症(例如，物质依赖、物质滥用以及物质滥用/依赖的后遗症，例如物质诱发的心理障碍、物质戒断和物质诱发的痴呆或遗忘症)、外伤性脑损伤、耳鸣、神经痛(例如，三叉神经痛)、疼痛(例如，慢性疼痛、慢性炎性痛、与关节炎有关的疼痛、纤维肌痛、背痛、癌症相关的疼痛、与消化性疾病有关的疼痛、与克罗恩氏病有关的疼痛、与自身免疫性疾病有关的疼痛、与内分泌疾病有关的疼痛、与糖尿病神经病变有关的疼痛、幻肢痛、自发性疼痛、慢性术后疼痛、慢性颞下颂疼痛、灼痛、疱疹后神经痛、AIDS相关的疼痛、 I和II型复杂性区域疼痛综合征、三叉神经痛、慢性背痛、与脊髓损伤有关的疼痛、与药物摄入有关的疼痛和复发性急性疼痛、神经性疼痛)、在诸如糖尿病、MS和运动神经元病等疾病中导致neurodysthesias的不适当的神经元活性、共济失调、肌肉强直(痉挛状态)、 颞下颚关节功能障碍、奖赏缺陷综合征(Reward deficiency syndrome, RDQ、由酒精或物质滥用(例如，摇头丸(ecstacy)、去氧麻黄碱等)引发的神经毒性、精神发育迟缓或认知缺损(例如，非综合征性X连锁精神发育迟缓、脆性X综合征、唐氏综合征、孤独症)、失语症、贝尔氏麻痹(Bell’ s palsy)、传染性海绵样脑病、脑炎、年龄相关性黄斑变性、ondine 综合征、WAGR综合征、听力损失、婴儿型脊髓性肌萎缩、慢性近端型脊肌萎缩、格-巴综合征、多系统萎缩(希-德(Shy Drager)综合征)、雷特综合征、癫痫、脊髓损伤、中风、低氧、 缺血、脑损伤、糖尿病神经病变、肾病或肾功能障碍、周围神经病、神经移植并发症、运动神经元病、周围神经损伤、肥胖症、代谢综合征、癌症、湿疹、肠能动性障碍、先天性巨结肠、失弛缓症、食道痉挛、硬皮病(与食道平滑肌部分的肌肉萎缩、下2/3的食道体部的收缩无力和下食道括约肌机能不全有关，但是也由免疫抑制剂的治疗引发)、十二指肠溃疡、佐-埃 (Zollinger-Ellison)综合征、胃酸分泌过多、吸收不良病症(malabsorptive disorder)、 表皮和基质创伤愈合障碍和/或瘢痕形成障碍、进行性肌营养不良(例如，杜兴肌营养不良、贝克尔肌营养不良、埃-德(Emery-Dreifuss)肌营养不良、面肩肱型肌营养不良、 肩胛肱骨型肌营养不良、肢带肌营养不良、Von Graefe-Fuchs肌营养不良、眼咽肌营养不良、强直性肌营养不良和先天性肌营养不良)、先天性或后天性肌病、贫血(包括大红细胞性贫血和再生障碍性贫血)；血小板减少；发育不全；弥散性血管内凝血(DIC)；脊髓发育不良；免疫性(自身免疫性)血小板减少性紫癜(ITP)、HIV诱发的ITP、血小板增多性 (thrombocytotic)疾病、病毒感染、神经肿瘤学疾病或病症、神经免疫学疾病或病症和神经耳科疾病或病症、耳蜗感觉细胞损伤、缺陷性听觉、嗜铬细胞瘤、2型多发性内分泌瘤病、脑视网膜血管瘤病(VHL)、1型神经纤维瘤病；以及与老化和衰老有关的疾病或病症。在一个优选的实施方案中，寡核苷酸对于GDNF的多核苷酸(其包括但不限于非编码区)而言为特异的。⑶NF靶标包括⑶NF的变体；⑶NF的突变体，包括SNP ；⑶NF的非编码序列；等位基因、片段等。优选所述寡核苷酸为反义RNA分子。依照本发明的实施方案，靶核酸分子不单独限于GDNF多核苷酸，而是扩展到GDNF 的任何同种型、受体、同源物、非编码区等。 在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸靶定GDNF靶标的天然反义序列(针对编码和非编码区的天然反义物)，所述GDNF靶标包括但不限于其变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。优选所述寡核苷酸为反义RNA或DNA分子。在另一个优选的实施方案中，本发明的寡聚化合物也包括变体，其中在所述化合物的一个或多个核苷酸位置上存在不同的碱基。例如，如果第一个核苷酸为腺嘌呤，则可产生在此位置含有胸苷、鸟苷、胞苷或其他天然或非天然核苷酸的变体。这可在所述反义化合物的任何位置上完成。然后使用本文所述的方法来检测这些化合物以确定其抑制靶核酸的表达的能力。在一些实施方案中，反义化合物与靶标之间的同源性、序列同一性或互补性为约 50%-约60%。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约60% -约70%。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约70% -约80%。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约80% -约90%。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约90%、约92%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%。反义化合物在以下情况时为可特异性杂交的所述化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能而引起活性损失，并且在需要特异性结合的条件下存在足够程度的互补性以避免所述反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合。这类条件包括，即，在体内测定或治疗性处理情况中的生理条件，以及其中在体外测定情况下进行测定的条件。反义化合物，不论DNA、RNA、嵌合的、取代的等等，在以下情况时为可特异性杂交的所述化合物与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能而引起效用损失， 并且在需要特异性结合的条件下存在足够程度的互补性以避免所述反义化合物与非靶序列的非特异性结合，所述条件即在体内测定或治疗性处理情况中的生理条件下，以及在体外测定情况下在其中进行测定的条件下。
在另一个优选的实施方案中，靶定⑶NF调节⑶NF的表达或功能，⑶NF包括但不限于使用例如PCR、杂交等鉴定和扩增的反义序列、一个或多个如SEQ ID N0:2、3或4所述的序列，等等。在一个实施方案中，表达或功能与对照相比为增量调节的。在另一个优选的实施方案中，表达或功能与对照相比为减量调节的。在另一个优选的实施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID NO :5_34所述的核酸序列， 包括使用例如PCR、杂交等鉴定和扩增的反义序列。这些寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷酸、较短或较长的片段、经修饰的键等。经修饰的键或核苷酸间键的实例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一个优选的实施方案中，所述核苷酸包括磷衍生物。可连接到本发明的修饰寡核苷酸中的糖或糖类似物部分的磷衍生物(或经修饰的磷酸基)，可为单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、链烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备，以及它们掺入到核苷酸、修饰核苷酸和寡核苷酸中本身也为已知的且无需在此描述。反义物的特异性和敏感性也被本领域的技术人员用于治疗用途。已将反义寡核苷酸用作在动物和人的疾病状态治疗中的治疗部分。已将反义寡核苷酸安全和有效地施用给人，并且目前正在进行许多临床试验。因此已确定寡核苷酸可为有用的治疗形式，其可将经配置以在用于治疗细胞、组织和动物尤其人的治疗方案中有用。在本发明的实施方案中，寡聚反义化合物(具体地寡核苷酸)结合到靶核酸分子并调节由靶基因编码的分子的表达和/或功能。待干扰的DNA功能包括例如复制和转录。 待干扰的RNA功能包括所有的生活机能，例如RNA向蛋白质翻译位点的易位、蛋白质自RNA 的翻译、产生一种或多种mRNA种类的RNA剪接，以及可由RNA参与或促进的催化活性。所述功能可被增量调节或受抑制，这取决于所需的功能。反义化合物包括反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列(EGQ寡核苷酸、 可变剪接物、引物、探针和与靶核酸的至少一部分杂交的其他寡聚化合物。因此，这些化合物可以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。在本发明的情况下，将反义化合物靶定到特定的核酸分子可为多步过程。所述过程通常以鉴定待调节其功能的靶核酸开始。此靶核酸可为，例如其表达与特定病症或疾病状态有关的细胞基因(或从基因转录的mRNA)，或来自传染剂的核酸分子。在本发明中，所述靶核酸编码胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)。靶定过程通常也包括确定靶核酸内的至少一个靶区、区段或位点以用于发生反义相互作用，使得产生所需的效应，例如，表达的调节。在本发明的文段中，术语“区”定义为具有至少一个可识别结构、功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸区内为区段。“区段”定义为在靶核酸内区的较小或亚部分。本发明所用的“位点”定义为靶核酸内的位置。在优选的实施方案中，反义寡核苷酸结合到胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF) 的天然反义序列并调节胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF) (SEQ ID NO 1)的表达和/或功能。反义序列的实例包括SEQ ID N0:2-34。表1显示可用于本发明的方法中的示例性反义寡核苷酸。表 权利要求
1.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中胶质细胞衍生神经营养因子(⑶NF)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与至少一种长度为约5-约30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与以下多核苷酸的反向互补序列具有至少50%序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO :2的核苷酸1-237或SEQ ID NO :3的核苷酸1-1246或SEQ ID NO 4的核苷酸1-684(图3)或者SEQ ID NO 42的核苷酸1-400或SEQ ID NO 43的核苷酸1-619或SEQ ID NO 44的核苷酸1-813之内的约5-约30个连续核苷酸；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中胶质细胞衍生神经营养因子(⑶NF)多核苷酸的功能和/或表达。
2.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中胶质细胞衍生神经营养因子(⑶NF)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与至少一种长度为约5-约30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)多核苷酸的天然反义物的反向互补序列具有至少50%序列同一性；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)多核苷酸的功能和/或表达。
3.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中胶质细胞衍生神经营养因子(⑶NF)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与至少一种长度为约5-约30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少 50%序列同一性；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)多核苷酸的功能和/或表达。
4.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中胶质细胞衍生神经营养因子(⑶NF)多核苷酸的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与靶定胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)多核苷酸的天然反义寡核苷酸的区的至少一种反义寡核苷酸接触；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)多核苷酸的功能和/或表达。
5.权利要求4的方法，其中胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)的功能和/或表达在体内或体外相对于对照增加。
6.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶定胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)多核苷酸的天然反义序列。
7.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶定核酸序列，所述核酸序列包括胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)多核苷酸的编码和/或非编码核酸序列。
8.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶定胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)多核苷酸的重叠和/或非重叠序列。
9.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸包含一种或多种选自以下的修饰至少一种经修饰的糖部分、至少一种经修饰的核苷间键、至少一种经修饰的核苷酸及其组合。
10.权利要求9的方法，其中所述一种或多种修饰包括至少一种选自以下的经修饰糖部分2’ -0-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’ -甲氧基修饰的糖部分、2’ -0-烷基修饰的糖部分、二环糖部分及其组合。
11.权利要求9的方法，其中所述一种或多种修饰包括至少一种选自以下的经修饰核苷间键硫代磷酸酯、2’ -0-甲氧基乙基(MOE)、2’ -氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其组合。
12.权利要求9的方法，其中所述一种或多种修饰包括至少一种选自以下的经修饰核苷酸肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、阿糖核酸(FANA)、其类似物、衍生物和组合。
13.权利要求1的方法，其中所述至少一种寡核苷酸包含至少一个如SEQID NO :5-34 所述的寡核苷酸序列。
14.一种在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中胶质细胞衍生神经营养因子 (GDNF)基因的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与至少一种长度为约5-约30个核苷酸的短干扰RNA(SiRNA)寡核苷酸接触，所述至少一种siRNA寡核苷酸对胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)多核苷酸的反义多核苷酸有特异性，其中所述至少一种siRNA寡核苷酸与胶质细胞衍生神经营养因子 (⑶NF)多核苷酸的反义和/或有义核酸分子的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少 50%序列同一性；和，在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)的功能和/或表达。
15.权利要求14的方法，其中所述寡核苷酸与至少约五个连续核酸的序列具有至少 80%序列同一性，所述序列与胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)多核苷酸的反义和/或有义核酸分子互补。
16.一种在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中胶质细胞衍生神经营养因子 (GDNF)的功能和/或表达的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与至少一种长度为约5-约30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，所述反义寡核苷酸对胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)多核苷酸的有义和/或天然反义链的非编码和/或编码序列特异，其中所述至少一种反义寡核苷酸与至少一个如SEQ ID NO 1-4所述的核酸序列具有至少50%序列同一性；和，在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)的功能和/或表达。
17.一种合成的、经修饰的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含至少一种修饰，其中所述至少一种修饰选自至少一种经修饰的糖部分、至少一种经修饰的核苷酸间键、至少一种经修饰的核苷酸及其组合；其中所述寡核苷酸为在体内或体外与胶质细胞衍生神经营养因子 (GDNF)基因杂交并与正常对照相比调节所述基因的功能和/或表达的反义化合物。
18.权利要求17的寡核苷酸，其中所述至少一种修饰包括选自以下的核苷酸间键硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、 磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其组合。
19.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一种硫代磷酸酯核苷酸间键。
20.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键的骨架。
21.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸，所述经修饰的核苷酸选自肽核酸、锁定核酸(LNA)、其类似物、衍生物和组合。
22.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多种修饰，其中所述修饰包括选自以下的经修饰的核苷酸硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其组合。
23.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多种修饰，其中所述修饰包括选自以下的经修饰的核苷酸肽核酸、锁定核酸(LNA)、其类似物、衍生物和组合。
24.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一种选自以下的经修饰的糖部分2’ -0-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’ -甲氧基修饰的糖部分、2’ -0-烷基修饰的糖部分、二环糖部分及其组合。
25.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多种修饰，其中所述修饰包括选自以下的经修饰的糖部分2’ -0-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’ -甲氧基修饰的糖部分、 2’ -0-烷基修饰的糖部分、二环糖部分及其组合。
26.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有至少约5-约30个核苷酸的长度且与胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)多核苷酸的反义和/或有义链杂交，其中所述寡核苷酸与胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少约20%序列同一性。
27.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF) 多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少约80%序列同一性。
28.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在体内或体外与至少一种胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)多核苷酸杂交并与正常对照相比调节所述多核苷酸的表达和/或功能。
29.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个如SEQID NO :5_34所述的序列。
30.一种组合物，所述组合物包含对一种或多种胶质细胞衍生神经营养因子(⑶NF)多核苷酸特异的一种或多种寡核苷酸，所述多核苷酸包括反义序列、互补序列、等位基因、同源物、同种型、变体、衍生物、突变体、片段或其组合。
31.权利要求30的组合物，其中所述一种或多种寡核苷酸与如SEQID NO :5_34所述核苷酸序列中的任一个相比，具有至少约40 %序列同一性。
32.权利要求30的组合物，其中所述一种或多种寡核苷酸中的至少一种包含如SEQID NO :5-34所述的核苷酸序列。
33.权利要求32的组合物，其中如SEQID NO :5_34所述的寡核苷酸包含一种或多种修饰或取代。
34.权利要求33的组合物，其中所述一种或多种修饰选自硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、 肽核酸、锁定核酸(LNA)分子及其组合。
35.一种预防或治疗与至少一种胶质细胞衍生神经营养因子(⑶NF)多核苷酸和/或至少一种其编码产物有关的疾病的方法，所述方法包括给患者施用治疗有效剂量的至少一种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸与所述至少一种胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)多核苷酸的天然反义序列结合，并调节所述至少一种胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)多核苷酸的表达；从而预防或治疗与至少一种胶质细胞衍生神经营养因子(⑶NF)多核苷酸和/或至少一种其编码产物有关的疾病。
36.权利要求35的方法，其中与至少一种胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)多核苷酸有关的疾病选自缺陷性神经发生有关的疾病或病症；神经变性疾病或病症(例如，阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩侧索硬化等)；神经精神障碍(抑郁症、精神分裂症、精神分裂症样精神障碍、情感分裂性精神障碍和妄想性障碍；焦虑性障碍例如惊恐性障碍、恐怖症(包括广场恐怖症)、强迫性神经失调、创伤后应激障碍、双相性精神障碍、神经性厌食、神经性贪食、中枢神经系统的自身免疫性疾病(例如，多发性硬化)、记忆丧失、 长期或短期记忆障碍、良性健忘、儿童学习障碍、闭合性颅脑损伤、注意力缺陷障碍、对病毒感染的神经元反应、脑损伤、发作性睡病、睡眠障碍(例如，昼夜节律障碍、失眠症和发作性睡病)；神经中断或神经损伤、脑脊髓神经索(CNS)中断和脑或神经细胞损伤、与AIDS有关的神经功能缺损、以运动和/或发声性抽搐为特征的运动和抽搐障碍(例如，图雷特精神障碍、慢性运动或发声性抽搐障碍、短时抽搐性障碍和刻板型活动障碍)、物质滥用病症(例如，物质依赖、物质滥用以及物质滥用/依赖的后遗症，例如物质诱发的心理障碍、物质戒断和物质诱发的痴呆或遗忘症)、外伤性脑损伤、耳鸣、神经痛(例如，三叉神经痛)、疼痛 (例如，慢性疼痛、慢性炎性痛、与关节炎有关的疼痛、纤维肌痛、背痛、癌症相关的疼痛、与消化性疾病有关的疼痛、与克罗恩氏病有关的疼痛、与自身免疫性疾病有关的疼痛、与内分泌疾病有关的疼痛、与糖尿病神经病变有关的疼痛、幻肢痛、自发性疼痛、慢性术后疼痛、慢性颞下颂疼痛、灼痛、疱疹后神经痛、AIDS相关的疼痛、I和II型复杂性区域疼痛综合征、三叉神经痛、慢性背痛、与脊髓损伤有关的疼痛、与药物摄入有关的疼痛和复发性急性疼痛、 神经性疼痛)、在诸如糖尿病、MS和运动神经元病等疾病中导致neurodysthesias的不适当的神经元活性、共济失调、肌肉强直(痉挛状态)、颞下颚关节功能障碍、奖赏缺陷综合征 (RDS)、由酒精或物质滥用(例如，摇头丸、去氧麻黄碱等)引发的神经毒性、精神发育迟缓或认知缺损(例如，非综合征性X连锁精神发育迟缓、脆性X综合征、唐氏综合征、孤独症)、 失语症、贝尔氏麻痹、传染性海绵样脑病、脑炎、年龄相关性黄斑变性、ondine综合征、WAGR 综合征、听力损失、婴儿型脊髓性肌萎缩、慢性近端型脊肌萎缩、格-巴综合征、多系统萎缩 (希-德综合征)、雷特综合征、癫痫、脊髓损伤、中风、低氧、缺血、脑损伤、糖尿病神经病变、 肾病或肾功能障碍、周围神经病、神经移植并发症、运动神经元病、周围神经损伤、肥胖症、 代谢综合征、癌症、湿疹、肠能动性障碍、先天性巨结肠、失弛缓症、食道痉挛、硬皮病(与食道平滑肌部分的肌肉萎缩、下2/3的食道体部的收缩无力和下食道括约肌机能不全有关， 但是也由免疫抑制剂的治疗引发)、十二指肠溃疡、佐-埃综合征、胃酸分泌过多、吸收不良病症、表皮和基质创伤愈合障碍和/或瘢痕形成障碍、进行性肌营养不良(例如，杜兴肌营养不良、贝克尔肌营养不良、埃-德肌营养不良、面肩肱型肌营养不良、肩胛肱骨型肌营养不良、肢带肌营养不良、Von Graefe-Fuchs肌营养不良、眼咽肌营养不良、强直性肌营养不良和先天性肌营养不良)、先天性或后天性肌病、贫血(包括大红细胞性贫血和再生障碍性贫血)；血小板减少；发育不全；弥散性血管内凝血(DIC)；脊髓发育不良；免疫性(自身免疫性)血小板减少性紫癜(ITP)、HIV诱发的ITP、血小板增多性疾病、病毒感染、神经肿瘤学疾病或病症、神经免疫学疾病或病症和神经耳科疾病或病症、耳蜗感觉细胞损伤、缺陷性听觉、嗜铬细胞瘤、2型多发性内分泌瘤病、脑视网膜血管瘤病(VHL)、1型神经纤维瘤病；以及与老化和衰老有关的疾病或病症。
37. 一种鉴定和选择用于体内施用的至少一种寡核苷酸的方法，所述方法包括选择与疾病状态有关的靶多核苷酸；鉴定包含至少五个连续核苷酸的至少一种反义寡核苷酸， 所述连续核苷酸与所选的靶多核苷酸或与所选靶多核苷酸的反义多核苷酸互补；在严格杂交条件下，测定所述反义寡核苷酸与所述靶多核苷酸或所选靶多核苷酸的反义多核苷酸的杂合体的热解链温度；以及基于获得的信息选择用于体内施用的至少一种寡核苷酸。
全文摘要
本发明涉及反义寡核苷酸，具体而言，其通过靶定胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)的天然反义多核苷酸，调节胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)的表达和/或功能。本发明还涉及这些反义寡核苷酸的鉴定及其在治疗与GDNF表达有关的疾病和病症中的用途。
文档编号C12N15/113GK102439149SQ201080017106
公开日2012年5月2日 申请日期2010年2月12日 优先权日2009年2月12日
发明者C·科伊托, J·科拉德, 谢尔曼 O·霍尔科瓦 申请人:欧科库尔纳有限责任公司