专利名称：一种补料批式培养高产微生物油脂的方法
技术领域：
本发明属于生物化工技术领域，特别涉及一种补料批式培养高产 微生物油脂的方法。
技术背景目前，全球性能源短缺与环境恶化日益严重，人们不得不从环境保 护与资源开发的角度出发，积极开发替代化石燃料的可再生新能源，生 物柴油就是一种具有很大发展潜力的可再生清洁能源。目前国内外对于 生物柴油制备的研究主要集中于植物油或餐饮废弃油脂方面，但利用植物油为原料成本高，其成本占到总生产成本的70% 85%，以餐饮废弃油 为原料，也存在原料难以收集和运输的困难，这些都严重地制约了生物 柴油的产业化进程，因此寻找一种廉价的原料成为了生物柴油产业化的微生物油脂(microbial oil)又称单细胞油脂(single cell oil), 是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定的条件下，利用碳水化合 物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源，在菌体内产生的大量油脂[l]。生 物柴油由各种动、植物油脂经酯化或转酯化工艺而得，而大部分微生物 油的脂肪酸组成和一般植物油相近，因此微生物油脂可替代植物油脂生 产生物柴油[2，3]。由于技术经济原因，过去单细胞油脂很少有规模化生 产的报道，但随着工业生物技术的发展，微生物油脂发酵从原料到过程 都在不断取得新的进展。最近美国国家可再生能源实验室(NREL)的报 告特别指出，微生物油脂发酵可能是生物柴油产业和生物经济的重要研 究方向。通过微生物发酵制备微生物油脂，不仅可为生物柴油的制备提供更 加廉价而广泛的原料，而且微生物具有细胞增殖快，生产周期短，生长 所需的原料丰富，价格便宜等优点，因此利用微生物发酵生产油脂作为 制备生物柴油的原料在未来生物柴油产业中将发挥重要的作用。目前， 微生物油脂主要采用批式发酵5—7天，油脂含量可达细胞干重的20 — 50%。因此，仍需要开发新的工艺，提高油脂含量和生物量，从而降低 生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种补料批式培养高产微生物油脂的方 法，提高油脂含量和生物量，从而降低生产成本。本发明所述补料批式培养高产微生物油脂的方法是在菌体对数生长中期向发酵培养基中补加碳源，并以C/^40同时进行氮源的补加，其微生物油脂含量可显著提高。具体工艺步骤如下(1)将保存在固体培养基中的粘红酵母斯达凯依酵母，被孢露，拉曼被孢霉等可产生微生物油脂的菌种接入种子培养基培养24—30h，以5 % — 10%的接种量接入发酵培养基；摇瓶培养温度25 —35°C,摇床转速 150—250r/min;发酵罐培养pH=6. 0，通气量0. 5 — 1. lvvm，搅拌转速 300—600r/min;(2) 发酵培养至菌体对数生长中期20—30h进行补料，向发酵培养 基中补加10g/L—20g/L葡萄糖、木糖或纤维素水解液碳源，并以C/N=40 同时进行硫酸氨或硝酸钾氮源的补加。(3) 发酵40 —120h结束，4°C， 3000-5000 r/min离心菌体，提取 微生物油脂进行测定。本发明所述的发酵菌种为粘红酵母，斯达凯依酵母，被孢霉，拉曼 被孢霉可产生微生物油脂的菌种。本发明的有益效果采用本发明的补料批式培养工艺，较批式培养 可显著提高微生物细胞油脂含量和油脂产量，降低了生产成本。且补料 方式简单易行，便于操作。
具体实施方式
实例l(1) 菌种粘红酵母(欣oflbtor"h 67〃"77j's，购自中科院微生物所)(2) 培养基a、 固体培养基酵母粉1%;蛋白胨2%;葡萄糖2%;琼脂:2%; PH=6。b、 种子培养基葡萄糖1. 5%; (NH4)2S04: 0. 2%;酵母粉0. 1%; KH2P04: 0. 7%; Na2HP04: 0.2%; MgS04: 0.15%; pH=6.0。 C、发酵培养基葡萄糖5%; (NH4)2S04: 0. 25%;酵母粉0. 1%; KH2P04: 0. 7%; Na2HP04: 0.2%; MgS04: 0.2%; CaCl2: 0.01%; FeCl3: 0.007%; pH=6.0。(3) 培养方式甘油管保藏的菌种转接至固体斜面培养基，3(TC下活化12小时。 种子培养采用有氧培养，使用500ml三角瓶，装液量50ml。培养温度 30°C，摇床转速180rpm。种子培养28h以5%接种量接入发酵培养基， 发酵培养使用1L发酵罐，装液量700ml，通气量l.Ovvm，搅拌转速 600rpm。在发酵进行到20h补加葡萄糖7g (补加量按10g/l计算)，同 时补加硫酸铵0. 33g (补加量按C/N=40计算)，以不补料的批式培养 为对照。(4) 发酵结果发酵55h，对照菌体生物量达到12.7g/1，油脂含量26.3%，油脂 产量3.3g/1。补料批式培养菌体生物量15.3g/1，油脂含量38.4%，油 脂产量5. 5g/1。采用补料培养较对照批式培养菌体生物量提高20. 5%， 油脂含量和产量分别提高46%和67%。 实例2(1) 菌种粘红酵母(朋oobz^2Y/7a 67""77&，购自中科院微生物所)(2) 培养基(A) 固体培养基 同实例1(B) 种子培养基葡萄糖1. 5%; KN03: 0. 3%;酵母粉0. 1%; KH2P04: 0. 7%; Na2HP04: 0.2%; MgS04: 0.15%; pH=6.0。(C) 发酵培养基葡萄糖5%;跳:0.4%;酵母粉0.1%; KH2P04: 0.7%; Na2HP04:0.2%; MgSO" 0.2%; CaCl2: 0.01%; FeCl3: 0.007%; pH二6.0。(3) 培养方式甘油管保藏的菌种转接至固体斜面培养基，3(TC下活化12小时。 种子培养采用有氧培养，使用500ml三角瓶，装液量50ml。培养温度 30°C，摇床转速180rpm。种子培养28h以5%接种量接入发酵培养基，
发酵培养使用1L发酵罐，装液量700ml，通气量l.Ovvm，搅拌转速 550rpm。在发酵进行到28h补加葡萄糖9. 8g (补加量按14g/l计算)， 同时补加硝酸钾0.71g (补加量按C/N二40计算)，以不补料的批式培 养为对照。 (4)发酵结果发酵60h，对照菌体生物量达到18.9g/1，油脂含量41.3%，油脂 产量7.8g/1。补料批式培养菌体生物量22.4g/1，油脂含量60.4%，油 脂产量13. 5g/1。采用补料培养较对照批式培养菌体生物量提高18. 5%， 油脂含量和产量分别提高46. 2%和73%。实例3(1) 菌种粘红酵母(欣W"07Y/7a67〃"/7"，购自中科院微生物所)(2) 培养基同实例l(A) 固体培养基 同实例1(B) 种子培养基 同实例2(C) 发酵培养基 同实例2(3) 培养方式种子培养同实例1，发酵培养采用5L发酵罐，装液 量3L，通气量1. Ovvm，搅拌转速520卬m。发酵进行到30h补加葡萄 糖60g (补加量按20g/l计算)，同时补加硝酸钾4. 35g (补加量按 C/N二40计算)。以不补料的批式培养为对照。(4) 发酵结果发酵66h，对照菌体生物量达到17.2g/1,油脂含量40%，油脂产 量6.9g/1。补料批式培养菌体生物量19.8g/1，油脂含量57.8%，油脂 产量11. 4g/1。采用补料培养较对照批式培养菌体生物量提高15.1%, 油脂含量和产量分别提高44. 5%和65. 2%。
权利要求
1.一种补料批式培养高产微生物油脂的方法，其特征在于在菌体对数生长中期向培养基中补加碳源，并以C/N＝40同时进行氮源的补加，工艺步骤如下(1)将保存在固体培养基中的粘红酵母斯达凯依酵母，被孢霉，拉曼被孢霉等可产生微生物油脂的菌种接入种子培养基培养24-30h，以5％-10％的接种量接入发酵培养基；摇瓶培养温度25-35℃，摇床转速150-250r/min；发酵罐培养pH＝6.0，通气量0.5-1.1vvm，搅拌转速300-600r/min；(2)发酵培养至菌体对数生长中期20-30h进行补料，向发酵培养基中补加10g/L-20g/L葡萄糖、木糖或纤维素水解液碳源，并以C/N＝40同时进行硫酸氨或硝酸钾氮源的补加。(3)发酵40-120h结束，4℃，3000-5000r/min离心菌体，提取微生物油脂进行测定。
2. 按照权利要求1所述方法，其特征在于，发酵菌种为粘红酵母斯 达凯依酵母，被孢霉，拉曼被孢霉等可产生微生物油脂的菌种。
全文摘要
一种补料批式培养高产微生物油脂的方法，属于生物化工技术领域。在以菌体对数生长中期向发酵培养基中补加碳源，并以C/N＝40同时进行氮源的补加，优点在于，其微生物油脂含量和产量可显著提高。且补料方式简单易行，便于操作。
文档编号C12P7/64GK101153299SQ20071012121
公开日2008年4月2日 申请日期2007年8月31日 优先权日2007年8月31日
发明者刘宏娟, 周玉杰, 墨玉欣, 张建安, 建 李, 程可可 申请人:清华大学