专利名称：利用原料预处理和补料发酵生产高酶活碱性果胶酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产高酶活碱性果胶酶的方法，尤其涉及一种通过对补料培养基中的淀粉进行液化处理和补料分批发酵生产高酶活碱性果胶酶的方法，属于生物酶制备技术领域。
背景技术：
果胶酶(pectinases)是一类可分解植物细胞壁组分果胶质的酶系总称，从分解方式上可以将果胶酶分为果胶水解酶和果胶裂解酶，前者主要包括原果胶酶(PPase)、果胶酯酶(PE)、低聚半乳糖醛酸水解酶、聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、聚半乳糖醛酸酶(PG);后者主要包括聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)和聚甲基半乳糖醛酸裂解酶( PMGL)。人们常称的碱性果胶酶一般指果胶裂解酶中的聚半乳糖醛酸裂解酶。果胶裂解酶通过反式消去作用裂解果胶聚合体，在C-4位置上断开糖苷键，同时在C-5处消去一个H原子。从而产生一个A4:5不饱和键。目前对于果胶酶的研究已有大量的文献报道，其中研究时间较长的酸性果胶酶主要用于果胶组分的提取和果酒果汁的澄清，碱性果胶酶在制浆漂白，棉织物处理工艺中的应用取得了一定进展，特别是在麻类纤维的脱胶上的应用研究日趋增多。原麻是一种被各种胶质粘接在一起的片条状物，单纤维不易分开，因此在梳理纺纱之前必须对原麻进行脱胶处理。长期以来的脱胶方式主要是化学脱胶，其基本原理是利用原麻中纤维素和胶质成分对碱、无机酸和氧化剂的稳定性不同以去除原麻中的胶质成分。该方法的缺点在于剧烈的化学处理可能导致麻纤维受损，影响麻织物的优良品质，同时消耗大量的化工原料和热能，造成严重的环境污染。近年来，生物脱胶受到了较多的关注，其主要包括微生物脱胶，酶脱胶和生物-化学联合脱胶。其中酶脱胶因具有操作灵活性强，过程容易控制，便于添加脱胶助剂等优势而成为研究的重点。在碱性果胶酶的生产方面，日本学者Koki Horkoshi于1972年首次报道了嗜碱细菌可分泌碱性果胶酶，Junwei Cao, T. SaKai, Tohru Kobayashi等也相继分离筛选到产碱性果胶酶的菌株。我国从90年代初开始对碱性果胶酶进行了研究，已经报道的产生菌包括欧文氏菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、螺孢菌等，但研究工作主要停留在菌种筛选及对酶学性质的研究；在碱性果胶酶的发酵研究方面，大多停留在摇瓶条件优化，小型发酵罐产酶条件的初步优化研究上。刘曦等对高产碱性果胶酶枯草芽孢杆菌的产酶条件进行了优化，使酶活力提高到了 14. 82U mL—1 (碱性果胶酶高产菌株产酶条件的优化.生物技术，2008，18(6) :71-74.)。蒋红菊等对多粘类芽孢杆菌发酵产碱性果胶酶的培养基及发酵培养条件进行了优化，使酶活达到311U ml/1 (多粘类芽孢杆菌20185液态发酵产碱性果胶酶发酵条件的研究.中国酿造，2011,235:111-114.)。董云舟等在小型发酵罐中采用温度控制策略对碱性果胶酶进行发酵优化，使芽孢杆菌WSH03-09产碱性果胶酶的酶活达5. 99U mL—1 (芽孢杆菌发酵产碱性果胶酶温度控制策略.应用与环境生物学报，2005，11 (3) :359-362.)。刘慧娟等研究了不同温度(32-41。。)对芽孢杆菌WSHB04-02分批发酵生产碱性果胶酶动力学參数的影响，温度优化后可使碱性果胶酶的酶活达到53. OU mじ1，生产强度为3315U (h · L)—1 (芽孢杆菌发酵生产碱性果胶酶的温度控制策略·过程工程学报，2007，7(4) :786-789.)。中国专利ZL 03131952. I公开了ー株产碱性果胶酶的短小芽孢杆菌，液体深层发酵得到碱性果胶酶酶活力为ZOUmr1 ;中国专利ZL200410065807. X公开了ー种通过氧气在发酵液中的传递速率体积溶氧系数(1(卢)提高碱性果胶酶活力的方法，其酶活力达到了 40U mじ1。但上述报道的碱性果胶酶活力与エ业化要求还有一段距离。李祖明等对克劳氏芽孢杆菌进行了紫外诱变育种和固态发酵条件优化(高产碱性果胶酶菌株的育种及其发酵条件的研究.エ业微生物，2008, 38(3) :27-31.);中国专利 ZL 94105708. 9、CN 101096650B、ZL 200410073818. 2、CN 101235361A 公开了不同菌株固体发酵生产碱性果胶酶的方法，由于酶活力測定方法不一，产酶能力无法直观比较；同时也因为固体发酵设备要求高、エ艺复杂而鲜见其应用于エ业生产。ZL97109044公开了ー株嗜碱芽孢杆菌及其苎麻脱胶的方法，但由于脱胶时间长(16_24h)，果胶酶活力低也难于エ业化应用。ZL01106844. 2公开了ー株碱性果胶酶生产菌CCTCC N0:M200038，并将发酵所得酶液应用于苎麻脱胶，由于其发酵酶活力较低而未能应用于エ业化生产。因此进ー步优 化生产エ艺，通过发酵エ艺控制和优化提高碱性果胶酶酶活力和容积生产效率，降低碱性果胶酶的生产成本，是技术开发和工程放大的关键，也是促进碱性果胶酶エ业化应用的前堤。特别是对于高浓度底物的液体深层发酵エ艺优化和控制显得尤为重要。目前高产量的碱性果胶酶的报道多采用固体发酵(高底物浓度)，但其后续分离纯化过程复杂，酶蛋白得率较低，增加了生产成本。而高浓度底物液体深层发酵生产碱性果胶酶存在搅拌效率低,传质效果差等问题。补料发酵技术在降低初发酵液底物浓度和延长发酵产酶时间中得到了广泛的应用，其对发酵中后期细胞生长分裂、细胞活力的維持起到了重要作用，可有效提高或者稳定酶蛋白产量。在检索到的相关方法中，关于通过对原料进行预处理和补料发酵生产碱性果胶酶的方法还未见报道。
发明内容
针对现有技术中，液体发酵产生的碱性果胶酶活力低，成本高，不适合エ业化生产的不足，本发明的目的是提供ー种利用原料预处理和补料发酵生产高酶活碱性果胶酶的方法。本发明所述的利用原料预处理和补料发酵生产高酶活碱性果胶酶的方法，是通过对补料培养基中的淀粉进行液化处理和补料分批发酵提高碱性果胶酶酶活力及其生产效率，其步骤如下(I)种子培养在无菌的条件下，活化斜面菌种枯草芽孢杆菌CCTCC N0:M200038,并接种至50ml种子培养基中进行种子培养，36-37°C摇床震荡培养7_9h ；(2)初发酵将种子培养液接种至装有发酵培养基的7. 5L发酵罐,进行发酵培养，发酵罐装液量3-4L，接种量10%，温度33-34°C，通气量2. 5-4. 5L mirT1 ；(3)补料培养基中的淀粉预处理用中温淀粉酶对补料培养基中的淀粉进行液化处理，加酶量为20-45U g'液化温度为45-65°C，液化时间为20_40min ；(4)补料发酵初发酵至13_19h，按初发酵培养基体积量10-25%补加预处理后的补料培养基，继续发酵，温度为33-34°C，通气量2. 5-4. 5L min—1，发酵周期为36_48h ；
(5)粗酶液制备发酵完毕后，将发酵液12000rpm离心lOmin，上清液即为含有碱性果胶酶的粗酶液；上述种子培养基组成是葡萄糖8_13gじ1，酵母粉3_6gじ1，蛋白胨3_6gじ1，NaCl3-6g じ1，K2HPO4 8-12g じ1，pH 8. O ；上述发酵培养基组成是淀粉15_25gじ1，麦麸35_45gじ1，(NH4)2SO4 l_2gじ1，MgSO4 · 7H20 O. 5-1. 5g じ1 ；上述补料培养基组成是淀粉110-135gじ1，麦麸8-13g Λ (NH4)2SO4 6_14g ΛMgSO4 · 7H20 5-8g L'上述利用利用原料预处理和补料发酵生产高酶活碱性果胶酶的方法中所述补料培养基中淀粉浓度优选115_130gじ1。 步骤(3)所述中温淀粉酶加酶量优选25-40U g'液化温度优选50_60°C，液化时间优选25-35min。步骤(4)所述补加预处理后补料培养基的时间优选为初发酵至14-18h ;补加量优选为初发酵培养基体积量的10-20%，最优按初发酵培养基体积的20% —次性补加补料培养基。上述方法中涉及的在线參数测定溶氧(DO)、pH、温度采用电极在线自动控制，DO为相对溶氧水平，即在培养基未接种之前通气30min，使培养基达到饱和溶氧水平，此时DO标定为100%，饱和亚硫酸钠溶氧标定为0%。上述方法中涉及的离线參数测定生物量取发酵液ImL (以发酵液离心后上清作为对照)于比色管中加入IM的高氯酸ImL,沸水浴20min后,转至离心管中IOOOOrpm离心IOmin,取上清Iml定容到IOmL,于紫外分光光度计260nm处测定其吸光值测定吸光值，比照标准曲线计算菌体干重。标准曲线制作方法为稀释得到浓度梯度菌体，分别测定OD26tl,并对应称量菌体干重，以细胞干重为X轴，OD260为Y轴绘制标准曲线。碱性果胶酶(PGL)活性取5mL发酵液，与1200rpm，4°C离心lOmin，取上清用pH9. 6Gly-NaOH缓冲液稀释一定倍数后取20 μ L加入2mL O. 2% (w/v)的聚半乳糖醛酸溶液(用 pH 9. 6，含 O. 44mM CaCl2, O. 05M Gly-NaOH 缓冲液配置)，45°C反应 15min，用 3mL0. 03M磷酸溶液終止反应，于紫外分光光度计235nm处测定其吸光值。ー个标准酶活力単位(IU)定义为単位时间(Imin)使聚半乳糖醛酸裂解产生
Iμ mo I不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。其中不饱和半乳糖醛酸在波长235nm处的摩尔吸光系数为 4600 (M)0本发明的有益效果通过采用淀粉酶对补料培养基中的高浓度淀粉进行液化处理，有效降低了补料液的粘滞系数，提高了料液的流动性和携氧能力，降低了发酵罐搅拌阻力，为泵流加补料培养基提供了可能；同时提高底物中溶解糖浓度，使细胞迅速获得营养，快速分裂増殖，提高了枯草芽孢杆菌的生长速率。通过补料发酵延长菌体生长时间，提高生物量，延长碱性果胶酶的有效积累时间；使碱性果胶酶的单位酶活力达到了 531U mじ1，容积生产效率达到13U(ml -h)-1 (国内外未见报道)。该方法大大缩短了发酵周期，从而提高了发酵罐利用效率，降低了生产成本；该方法操作简单易行，为エ业化生产奠定了坚实的基础。发酵生产的碱性果胶酶初酶液可用于麻纤维原料的脱胶处理，能有效缩短甚至省去化学脱胶エ序，改善麻纤维产品的品质，减少废液对环境的污染。
图I为补料分批发酵对碱性果胶酶活力的影响。图2为补料培养基中淀粉原料淀粉酶液化处理对碱性果胶酶活力的影响。
具体实施例方式实施例I枯草芽孢杆菌CCTCC N0:M200038(申请人于2000年11月20日保藏于中国典型培养物中心(CCTCC)，相关专利见ZL01106844. 2)经斜面活化，挑起菌苔接种至装有种子培养 基的摇瓶进行培养，培养条件为300ml三角瓶装液量为50ml，发酵温度37°C，200rpm震荡培养8h。以接种量10%接种初发酵培养基，温度33-34°C，通气量2. 5-4. 5L mirT1。用中温淀粉酶对补料培养基中的淀粉进行液化处理，加酶量为25U g_S液化温度为60°C，液化时间为35min。初发酵至14h，按初发酵培养基体积的20%补加预处理以后的补料培养基，控制温度33-34°C，通气量2. 5-4. 5L mirT1。发酵周期为36_48h。发酵完毕后，将发酵液12000rpm离心lOmin，上清液即为含有碱性果胶酶的粗酶液；经实验測定，所述粗酶液最高碱性果胶酶活力为465U mじ1。发酵过程见图I。其中培养基配方如下种子培养基组成是葡萄糖8gじ1，酵母粉3gじ1，蛋白胨3g IANaCl 3gじ1，K2HP048g じ1，pH 8. O ；发酵培养基组成是淀粉15g じ1，麦麸 35g じ1，(NHz4)2SO4 Ig L—1，MgSO4 · 7H20
O.5gL 1 ；补料培养基组成是淀粉115gじ1，麦麸8gじ1，(NH4)2SO4 6gじ1，MgSO4 · 7H20 5gじ1。实施例2发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例I。预处理过程中，中温淀粉酶加酶量为32. 5U g—1，液化温度为55°C，液化时间为30min。初发酵至16h补料。发酵周期为36-48h，获得的粗酶液最高碱性果胶酶活力为531U mじ1。发酵过程见图I。其中培养基配方如下种子培养基组成是葡萄糖Ilgじ1，酵母粉4，5gじ1，蛋白胨4. 5gじ1，NaCl 4. 5gじ1，K2HPO4 IOg じ1，pH 8. O ；发酵培养基组成是淀粉20g じ1，麦麸 40g じ1，(NH4)2SO4 I. 5g L—1，MgSO4 · 7Η20lgL—1 ；补料培养基组成是淀粉122. 5gじ1，麦麸10. 5gじ1，(NH4)2SO4 IOgじ1，MgSO4 · 7Η206· 5g じ1。实施例3发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例I。预处理过程中，中温淀粉酶加酶量为40U g—1，液化温度为50°C，液化时间为25min。初发酵至18h补料。发酵周期为36_48h，获得的粗酶液最终碱性果胶酶活力为479Umじ1。发酵过程见图I。其中培养基配方如下种子培养基组成是葡萄糖13gじ1，酵母粉6gじ1,蛋白胨6gじ1, NaCl 6gじ1,K2HPO412g じ1，pH 8. O ；上述发酵培养基组成是淀粉25gじ1，麦麸45gじ1，(NH4) 2S04 2gじ1，MgSO4 · 7H20
I.5g じ1 ；上述补料培养基组成是淀粉130gじ1，麦麸13gじ1，(NH4) 2S04 14gじ1，MgSO4 · 7H208g じ1。实施例4将发酵培养基和补料培养基混合，进行分批发酵(即过程中未进行补料)，种子活 化、培养、接种量、发酵温度和通气量与实施例I相同。发酵48h，获得的粗酶液最終碱性果胶酶活力为203U mじ1。发酵过程见图I。与实施例1、2、3相比，本实施例获得的粗酶液碱性果胶酶酶活力明显较低。实施例5种子活化、培养及接种量同实施例1，在500mL三角瓶上进行补料发酵实验，实验组补料培养基中122. 5gじ1高浓度淀粉用中温淀粉酶进行液化处理，加酶量为45U g_S液化温度为65°C，液化时间为40min。以不进行淀粉酶处理作为对照。该条件下发酵60h，获得的粗酶液碱性果胶酶酶活力达到347U Hir10发酵过程见图2。实施例6发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例1，补料培养基中淀粉浓度为IlOgじ1，中温淀粉酶加酶量为20U g_\液化温度为60°C，液化时间为20min。初发酵至16h补料。发酵周期36-48h，获得的粗酶液最高碱性果胶酶活力为437U mじ1。实施例7发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例1，补料培养基中淀粉浓度为135gじ1，中温淀粉酶加酶量为45U g—1，液化温度为45°C，液化时间为30min。初发酵至16h补料，按照25%的初发酵培养基体积补加补料培养基。发酵周期36-48h，获得的粗酶液最高碱性果胶酶活力为421U mじ1。实施例8发酵方法、条件除以下变动之外，其余同实施例1，初发酵至14h按初发酵培养基体积的10%补加补料培养基，发酵周期36-48h，获得的粗酶液最高碱性果胶酶活力为340UmL ο
权利要求
1.一种利用原料预处理和补料发酵生产高酶活碱性果胶酶的方法，步骤是 (1)种子培养在无菌的条件下，活化斜面菌种枯草芽孢杆菌CCTCCN0:M200038,并接种至50ml种子培养基中进行种子培养，36-37°C摇床震荡培养7_9h ； (2)初发酵将种子培养液接种至装有发酵培养基的7.5L发酵罐，进行发酵培养，发酵罐装液量3-4L，接种量10%，温度33-34°C，通气量2. 5-4. 5L min—1 ； (3)补料培养基中的淀粉预处理用中温淀粉酶对补料培养基中的淀粉进行液化处理，加酶量为20-45U g'液化温度为45-65°C，液化时间为20_40min ； (4)补料发酵初发酵至13-19h，按初发酵培养基体积量10-25%补加预处理后的补料培养基，继续发酵，温度为33-34°C，通气量2. 5-4. 5L min—1，发酵周期为36_48h ； (5)粗酶液制备发酵完毕后，将发酵液12000rpm离心lOmin，上清液即为含有碱性果胶酶的粗酶液； 上述种子培养基组成是葡萄糖8-13g L—1，酵母粉3-6g L—1，蛋白胨3-6g L^1, NaCl3-6g L' K2HPO4 8-12g I71，pH 8. 0 ； 上述发酵培养基组成是淀粉15_25g L—1，麦麸35-45g L—1，(NH4)2SO4 l_2g L—1，MgSO4 7H20 0. 5-1. 5g L—1 ； 上述补料培养基组成是淀粉110-135g L—1，麦麸8-13g L—1，(NH4)2SO4 6_14g L—1，MgSO4 7H20 5-8g L'
2.如权利要求I所述利用原料预处理和补料发酵生产高酶活碱性果胶酶的方法，其特征在于，所述补料培养基中的淀粉浓度为115-130g L—1。
3.如权利要求I所述利用原料预处理和补料发酵生产高酶活碱性果胶酶的方法，其特征在于，步骤(3)所述中温淀粉酶的加酶量为25-40U g_\液化温度为50-60°C，液化时间为25_35min0
4.如权利要求I所述利用原料预处理和补料发酵生产高酶活碱性果胶酶的方法，其特征在于，步骤(4)所述补加预处理后补料培养基的时间为初发酵至14-18h，补加量为初发酵培养基体积量的10-20%。
全文摘要
本发明公开了一种利用原料预处理和补料发酵生产高酶活碱性果胶酶的方法，是通过对补料培养基中的淀粉进行液化处理和补料分批发酵实现。本发明方法明显提高了碱性果胶酶的单位体积酶活力和容积生产效率。通过对补料培养基中淀粉原料进行淀粉酶液化处理，大大降低了料液的粘滞系数，提高搅拌效率。通过补料发酵延长菌体对数生长期，提高了生物量。经实验检测，本方法得到了聚半乳糖裂解酶活力为531U mL-1的碱性果胶酶粗酶液，最高容积生产效率达到13U(mL·h)-1。本发明方法还具有成本低廉、发酵周期短、设备利用率高、工艺简单，适于规模化工业生产的特点。
文档编号C12N9/88GK102660527SQ20121017231
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者曲音波, 李雪芝, 赵建, 邹谋勇 申请人:山东大学