9-甲基反式链霉戊二酰亚胺及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备9-甲基反式链霉戊二酰亚胺的方法，包括以下步骤：Ⅰ培养：采用补料分批培养方式培养具有产生戊二酰亚胺类抗生素的链霉菌属的微生物，获得发酵液；Ⅱ分离：将发酵液过滤心，然后以石油醚和丙酮的混合物为洗脱液层析滤液，得到9-甲基反式链霉戊二酰亚胺粗品；Ⅲ精制：将9-甲基反式链霉戊二酰亚胺粗品通过工业反向色谱柱，以甲醇溶液展开，得到洗脱液，洗脱液通过HPLC法检测提纯，得到9-甲基反式链霉戊二酰亚胺精品。本发明的方法采用两步层析法，可使发酵液中的S632A2和S632A3完全分开，提高了S632A3的收率，采用补料分批培养方式可使发酵液中的产物浓度较高，并可提高培养基中营养物质的利用率。
【专利说明】9-甲基反式链霉戊二酰亚胺及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及通过培养具有产生戊二酰亚胺类抗生素的链霉菌属的微生物提纯制备9-甲基反式链霉戊二酰亚胺的方法以及由此方法得到的9-甲基反式链霉戊二酰亚胺。
【背景技术】
[0002]现在已知微生物产物可产生具有广泛结构特征和具有抗炎等药理活性的多种物质。戊二酰亚胺类抗生素(S632A)是由链霉菌产生的一类具有多种生物学活性的酰亚胺类化合物，现已报道分离到的大约20多种该类抗生素中，结构差别主要在戊二酰亚胺六元环连接的侧链不同，侧链的另一端多以环状结构结束。9-甲基反式链霉戊二酰亚胺(S632A3)是由链霉菌S632 (Streptomyces hygroscopicus S632)产生的一种具有多种生物学活性的戊二酰亚胺类化合物。研究表明，抗生素S632A3具有抗真菌、抗病毒、抗肿瘤以及抗炎等多种药理活性。
[0003]通常采用对链霉菌S632的发酵液分离提纯的方法获得S632A3，S632发酵液中的S632A是具有S632A2 (9-甲基反霉戊二酰亚胺)和S632A3两中同分异构体的混合体，现有的分离纯化方法一般为一次层析法很难将S632A2和S632A3完全分开，获得的主要组分为S632A2，致使S632A3的收率很低。因此有必要提供一种具有较高收率的制备S632A3的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种工艺周期短、收率高的制备9-甲基反式链霉戊二酰亚胺的方法以及由此方法得到的9-甲基反式链霉戊二酰亚胺。
[0005]根据本发明的一个方面，提供了一种制备9-甲基反式链霉戊二酰亚胺的方法，该方法包括以下步骤:I培养:采用补料分批培养方式培养具有产生戊二酰亚胺类抗生素的链霉菌属的微生物，获得发酵液；II分离:将发酵液过滤，然后以石油醚和丙酮的混合物为洗脱液层析滤液，得到9-甲基反式链霉戊二酰亚胺粗品JII精制:将9-甲基反式链霉戊二酰亚胺粗品利用工业反向色谱柱，以甲醇溶液展开，得到洗脱液，洗脱液通过HPLC法(HighPerformance Liquid Chromatography高效液相色谱法)检测提纯,得到9_甲基反式链霉戊二酰亚胺精品。由此，步骤III中采用工业反相色谱柱、HPLC法检测提纯，两次层析提纯可使发酵液中的S632A2和S632A3完全分开，提高了 S632A3的收率，步骤I中采用补料分批培养方式培养微生物，可使发酵液中的产物浓度较高，并可提高培养基中营养物质的利用率，且补料分批培养方式操作工艺简单。
[0006]在一些实施方式中，在步骤I中，补料分批培养的培养基的pH值为6.8，培养温度为30~。C，培养时间为4~6天，在培养的第3天向培养基中添加补料培养基。由此，培养基PH值为6.8、培养温度为30°C便于微生物大量产生代谢物，在培养的第3天补料有益于维持微生物产生代谢物，并可提高培养基的利用率。
[0007]在一些实施方式中，补料培养基包括以重量百分比计的甘油6.0%、葡萄糖5%、蛋白胨5%，余量为水。由此，补料培养基可补充原培养基中消耗量大的营养物质，并可促进微生物代谢。
[0008]在一些实施方式中，在步骤I中，补料分批培养的培养基包括以重量百分比计的甘油3.0%,葡萄糖0.8%, 土豆淀粉0.2%,黄豆饼粉2.0%,蛋白胨1%，NaCl0.5%, CaCO30.2%,余量为水。由此，培养基中的营养成分便于微生物大量繁殖，其中NaCl可维持培养基渗透压，CaCO3可调节培养基pH。
[0009]在一些实施方式中,在步骤I中，在补料分批培养前还包括种子培养，种子培养基包括以重量百分比计的甘油4.0%，葡萄糖1%，土豆淀粉0.5%，黄豆饼粉2.0%，干酵母0.5%，NaCl0.5%，余量为水，种子培养基的pH值为6.8。由此，种子培养可使微生物由适应期进入对数期，便于在补料分批培养时快速繁殖。
[0010]在一些实施方式中，在步骤II中，滤液层析前还包括下述步骤:采用溶媒提取法、大孔树脂吸附法或层析法将滤液提纯。由此，滤液层析前的提纯可提高层析的效率。
[0011]在一些实施方式中，在步骤III中，HPLC条件为:液相流速为4ml/min、液相温度为18~22°C、检测波长为560nm。由此，高效液相色谱法中利用检测波可对S632A3进行有效的分析，液相流速为4ml/min可提闻提纯的效率。
[0012]在一些实施方式中，在步骤III中，工业反向色谱柱的固相为粒度50 μ m的十八烷基硅烷键合硅胶，甲醇溶液为35%(体积百分比)甲醇溶液。由此，工业反相色谱柱可对9-甲基反式链霉戊二酰亚胺粗品进一步提纯。
[0013]相应地，本发明还提供了一种根据上述方法得到的9-甲基反式链霉戊二酰亚胺，
其化学结构式为: [0014]
【权利要求】
1.制备9-甲基反式链霉戊二酰亚胺的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: I培养:采用补料分批培养方式培养具有产生戊二酰亚胺类抗生素的链霉菌属的微生物，获得发酵液； II分离:将发酵液过滤，然后以石油醚和丙酮的混合物为洗脱液层析滤液，得到9-甲基反式链霉戊二酰亚胺粗品； III精制:将9-甲基反式链霉戊二酰亚胺粗品利用工业反向色谱柱，以甲醇溶液展开，得到洗脱液，洗脱液通过HPLC法检测提纯，得到9-甲基反式链霉戊二酰亚胺精品。
2.根据权利要求1所述的制备9-甲基反式链霉戊二酰亚胺的方法，其特征在于，在步骤I中，补料分批培养的培养基的PH值为6.8，培养温度为30°C，培养时间为4~6天，在培养的第3天向培养基中添加补料培养基。
3.根据权利要求2所述的制备9-甲基反式链霉戊二酰亚胺的方法，其特征在于，所述补料培养基包括以重量百分比计的甘油6.0%、葡萄糖5%、蛋白胨5%，余量为水。
4.根据权利要求2述的制备9-甲基反式链霉戊二酰亚胺的方法，其特征在于，在步骤I中，补料分批培养的培养基包括以重量百分比计的甘油3.0%，葡萄糖0.8%，土豆淀粉0.2%，黄豆饼粉2.0%，蛋白胨1%，NaCl0.5%, CaCO30.2%，余量为水。
5.根据权利要求1所述的制备9-甲基反式链霉戊二酰亚胺的方法，其特征在于，在步骤I中，在补料分批培养前还包括种子培养，种子培养基包括以重量百分比计的甘油4.0%，葡萄糖1%，土豆淀粉0.5%，黄豆饼粉2.0%，干酵母0.5%，NaCl0.5%，余量为水，种子培养基的pH值为6.8。
6.根据权利要求1所述`的制备9-甲基反式链霉戊二酰亚胺的方法，其特征在于，在步骤II中，滤液层析前还包括下述步骤:采用溶媒提取法、大孔树脂吸附法或层析法将滤液提纯。
7.根据权利要求1所述的制备9-甲基反式链霉戊二酰亚胺的方法，其特征在于，在步骤III中，HPLC法的条件为:液相流速为4ml/min，液相温度为18~22°C，检测波长为560nm。
8.根据权利要求1所述的制备9-甲基反式链霉戊二酰亚胺的方法，其特征在于，在步骤III中，所述工业反向色谱柱的固相为粒度50ym的十八烷基硅烷键合硅胶，所述甲醇溶液为35% (体积百分比)甲醇溶液。
9.一种根据权利要求1所述的方法得到的9-甲基反式链霉戊二酰亚胺，其化学结构式为:
O
OH、個
/Η
ο
【文档编号】C12P17/12GK103525882SQ201310460498
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】邓洪斌 申请人:无锡华奈生物科技有限公司