利用微生物生产甜菊糖苷类化合物的方法
【专利摘要】本发明涉及利用微生物生产甜菊糖苷类化合物的方法。本发明首次揭示了甜菊糖苷类化合物异源生物合成的关键酶，应用牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)，古巴焦磷酸合成酶(CDPS)和贝壳烯合成酶(KS)或双功能贝壳烯合酶(CPS/KS)，贝壳烯氧化酶(KO)，细胞色素P450氧化还原蛋白(CPR)，贝壳烯酸-13α-羟化酶，UGT85C2糖基转移酶，和UGTB1/IBGT糖基转移酶；以及可选地还应用UGT74G1糖基转移酶，和/或UGT76G1糖基转移酶，进行甜菊糖苷类化合物的异源生物合成。
【专利说明】利用微生物生产甜菊糖苷类化合物的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于合成生物学领域；更具体地，本发明涉及利用微生物生产甜菊糖苷类化合物的方法。
【背景技术】
[0002]莱鲍迪苷A(RebA)是从甜叶菊(Stevia rebaudiana)中提取的新型天然甜味剂，它具有甜度高，热值含量低，稳定性好等特点。莱鲍迪苷A与其它甜菊糖苷相比，它的甜度最高，约为蔗糖的450倍以上，热值仅为蔗糖的1/300。莱鲍迪苷A甜度高、色泽洁白、甜味纯正、无异味，因此它是一种蔗糖以及化学合成甜味剂的天然最佳替代品，被国际上誉为“世
界第三糖源”。
[0003]目前从甜叶菊中分离得到的甜菊糖苷类化合物的结构式如图1所示，随着Rl、R2为不同，产生不同侧链修饰的的甜菊糖苷类化合物，具体见表1。甜菊糖中莱鲍迪苷A含量越高，甜味就越纯正，也就受越多的消费者青睐，因此在甜菊糖生产过程中必须提高产品中莱鲍迪苷A的含量。
[0004]表1、从甜叶菊分离的甜菊糖苷类化合物
【权利要求】
1.一种分离的多肽，其特征在于，所述的多肽是非甜叶菊来源的糖基转移酶，用于催化在甜菊糖苷类化合物的O-葡萄糖残基的C-2’再转移上一个糖。
2.如权利要求1所述的糖基转移酶，其特征在于，其氨基酸序列与甜叶菊来源的具有同一功能的酶的氨基酸序列一致性不大于95%。
3.如权利要求1所述的糖基转移酶，其特征在于，所述的非甜叶菊来源糖基转移酶来源于斯塔摩酵母(Starmerella bomb i col a)或甘薯(Ipomoea batatas)
4.如权利要求3所述的来源于斯塔摩酵母的糖基转移酶，其特征在于，具有如SEQIDNO:41的氨基酸序列(称为UGTB1)或在SEQ ID NO:41基础上经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的同功能衍生蛋白。
5.如权利要求3所述的来源于甘薯的糖基转移酶，其特征在于，具有如SEQID N0:51所示的氨基酸序列(称为IBGT)，或在SEQ ID NO:51基础上经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的同功能衍生蛋白。
6.一种分离的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码如权利要求1-5所述多肽。
7.如权利要求6所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列具有:(I)如SEQID NO:42所示的序列，或与SEQ ID N0:42同源度在70%及以上的序列;(2)如SEQ ID NO:52所示的序列，或与SEQ ID NO: 52同源度在在70%及以上的序列。
8.如权利要求7所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列具有:(I)如SEQID NO:42所示的序列，或与SEQ ID N0:42同源度在80%及以上的序列；(2)如SEQ ID NO:52所示的序列，或与SEQ ID NO:52同源度在在80%及以上的序列。
9.一种如权利要求1-5种任一项所述的非甜叶菊来源的糖基转移酶的用途，用于在宿主细胞中重组表达以制备甜菊糖苷类化合物，其特征在于，催化在甜菊糖苷类化合物的O-葡萄糖残基的C-2’再转移上一个糖。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的糖基转移酶的催化底物包括但不限于甜菊醇-13-0-葡萄糖苷(又称甜菊醇单糖苷)、甜茶素(又称甜叶悬钩子苷)、甜菊糖苷、莱鲍迪苷A ;优选的，催化甜菊醇单糖苷生成甜菊醇双糖苷。
11.一种合成甜菊糖苷类化合物的方法，其特征在于，在宿主细胞中重组表达如权利要求1-10任一项中所述的糖基转移酶或核苷酸序列。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞还含有下述中的一个或多个: (a)栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶， (b)选自以下⑴或(II)的酶:(1)古巴焦磷酸合成酶和贝壳烯合成酶，(II)双功能贝壳烯合酶， (C)贝壳烯氧化酶， (d)细胞色素P450氧化还原蛋白， (e)贝壳烯酸-13α-羟化酶， (f)UGT85C2糖基转移酶， (h)UGT74Gl糖基转移酶， (i)UGT76Gl糖基转移酶。
13.如权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述的的宿主细胞还含有包括以下酶的基因表达盒:1-脱氧木糖-5-磷酸合成酶，2-甲基赤藓糖-4-磷酸胞苷转移酶，2-甲基赤藓糖_2，4-环二磷酸合成酶和异戊烯焦磷酸异构酶。
14.如权利要求11-13任一所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞选自:原核微生物细胞或真核微生物细胞。
15.如权利要求14所述的原核微生物是:大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌；更佳地，所述大肠杆菌选自:BL21、BLR、DH10B、HMS, CD43、JM109、DH5 α或Noveblue ;或所述的真核微生物细胞是:酵母菌、霉菌、担子菌；所述的酵母菌是:毕赤酵母，酿酒酵母，乳酸克鲁维酵母。较佳地，所述的毕赤酵母选自GSl 15、MC100-3、SMDl 163、SMDl 165、SMDl 168 或 ΚΜ71 ;较佳地，所述的酿酒酵母选自 W303、CEN.ΡΚ2、S288c、FY834 或S1949 ;较佳地，所述的乳酸克鲁维`酵母选自GG799。
【文档编号】C12P19/56GK103710318SQ201310460493
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2012年9月29日
【发明者】王勇, 熊智强, 李诗渊, 汪建峰 申请人:中国科学院上海生命科学研究院