专利名称：甜菊糖苷的重组生产的制作方法
技术领域：
本公开涉及甜菊醇(steviol)和甜菊糖苷(steviol glycoside)的重组制备。具体来说，本公开涉及通过诸如重组微生物、植物或植物细胞的重组宿主制备甜菊醇和甜菊糖苷，比如甜叶悬钩子苷(rubusoside)和/或莱鲍迪苷(rebaudioside) A。本公开还提供了含有所述甜菊糖苷的组合物。
背景技术：
甜味剂是常用于食品、饮料或糖果业的为人熟知的成分。甜味剂既可以用于在生产过程中加入最终食品，也可以在适当稀释的情况下作为佐餐甜味剂或者作为烘培中糖的家用替代品来单独使用。甜味剂包括天然甜味剂(比如蔗糖、高果糖浆、糖蜜、枫糖浆和蜂蜜)和人工甜味剂(比如阿斯巴甜、糖精和蔗糖素)。甜菊提取物(stevia extract)是可以从常青灌木甜叶菊(Stevia rebaudiana)中分离和提取的一种天然甜味剂。甜菊在南美和亚洲被广泛种植用于商业生产甜菊提取物。纯化程度各不相同的甜菊提取物常常被作为食品中的高甜度甜味剂，或者混合或单独作为佐餐甜味剂。`甜菊植物(Stevia plant)的提取物含有莱鲍迪苷和其它带来甜味的甜菊糖苷，虽然不同产品批次之间每种糖苷的量往往不同。现有的商品中占优势的是莱鲍迪苷A，和量少一些的其它糖苷，比如莱鲍迪苷C、D和F。甜菊提取物还可能含有杂质，比如造成异味的来源于植物的化合物。这些异味根据食物系统或者目标用途会带来或多或少的问题。潜在的杂质包括色素、脂类、蛋白、酚类、糖类、斯巴醇和其它倍半萜烯、半日花烷型二萜类、单萜烯、癸酸、8，11，14- 二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、二十四烷、十八醇、豆留醇、β -谷留醇、α -和β -香树素、羽扇豆醇酯、β -香树脂醇乙酸乙酯、五环三萜、centauredin、quercitin、ep1- α -杜松醇、carophyllenes 和衍生物、β -松油職、β -谷留醇和赤霉素。发明概述本文提供了诸如微生物的重组宿主，所述重组宿主包含一或多个生物合成基因，这些基因的表达导致甜菊醇的产生。这类基因包括编码柯巴基焦磷酸合酶的基因、编码异贝壳杉烯合酶的基因、编码异贝壳杉烯氧化酶的基因，和编码甜菊醇合成酶的基因。重组宿主可以包含编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶双功能的基因代替编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因。这些基因中至少一个是重组基因。在一些实施方案中，重组宿主还包含编码香叶基香叶基(geranylgeranyl)焦磷酸合酶的基因。重组宿主还可以包含编码截短的HMG-CoA还原酶的基因和/或编码CPR的基因。这些基因中一或多个的表达可以是诱导性的。本文本一个方面提供了重组宿主，所述重组宿主包含编码UGT91D2多肽(例如UGT91D2e或UGT91D2m多肽)的重组基因。UGT91D2多肽与SEQ ID NO:5中给出的氨基酸序列可以有至少90%的同一性(例如，至少95%或99%同一性)。UGT91D2多肽可以包含位于 SEQ ID NO:5 的残基 1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380或387-473的至少一个氨基酸取代。例如，UGT91D2多肽包含位于选自SEQ ID NO:5的残基 30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427 和438中的一或多个残基的氨基酸取代。在一个实施方案中，UGT91D2多肽包含相对SEQ IDNO:5位于残基位点206的精氨酸、残基位点207的半胱氨酸。在一个实施方案中，UGT91D2多肽包含相对SEQ ID NO:5位于残基位点30的苯丙氨酸、残基位点93的谷氨酰胺、残基位点99的缬氨酸、残基位点122的苯丙氨酸、残基位点140的酪氨酸、残基位点142的半胱氨酸、残基位点148的苏氨酸、残基位点153的丙氨酸、残基位点156的丝氨酸、残基位点195的甲硫氨酸、残基位点196的谷氨酸、残基位点199的谷氨酸、残基位点211的甲硫氨酸、残基位点221的苯丙氨酸、残基位点286的丙氨酸、残基位点427的天冬酰胺或者残基位点438的丙氨酸。多肽可以具有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:95的氨基酸序列。本文描述的宿主还包含编码与SEQ ID NO:3给出的氨基酸序列有至少90%同一性的UGT85C多肽的重组基因。例如，UGT85C多肽可以包含位于SEQ ID勵:3的残基9、10、
13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444和471的一或多个氨基酸取代。本文描述的宿主还包含编码与SEQ ID NO:7给出的氨基酸序列有至少90%同一性的UGT76G多肽的重组基因。例如，UGT76G多肽可以包含位于SEQ ID NO:7的残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331 和 346 的一或多个氨基酸取代。本文本还提供了包含重组基因的重组宿主，所述重组基因编码的UGT85C多肽与SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列有至少90%同一性，并且有位于SEQ ID NO:3中的残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444和471的一或多个氨基酸取代。例如，UGT85C多肽可以包含位于SEQ ID NO:3的残基13、15、60、270、289和418的取代。例如，UGT85C多肽可以包含a)位于SEQ ID NO:3的残基13、60和270的取代；b)位于SEQ ID NO:3的残基60和87的取代；c)位于SEQ ID NO:3的残基65、71、220、243和270的取代；d)位于SEQ ID NO:3的残基 65、71、220、243、270 和 441 的取代；e)位于 SEQ ID NO:3 的残基 65、71、220、389 和 394的取代；f)位于SEQ ID NO:3的残基65、71、270和289的取代；g)位于SEQ ID NO:3的残基15和65的取代；h)位于SEQ ID NO:3的残基65和270的取代；i)位于SEQ ID NO:3的残基65和440的取代；j)位于SEQ ID NO:3的残基65和441的取代；k)位于SEQ ID NO:3的残基65和418的取代；1)位于SEQ ID NO:3的残基220、243、270和334的取代；或者m)位于SEQ ID NO:3的残基270和289的取代。本文本另一方面提供了包含重组基因的重组宿主，所述重组基因编码的UGT76G多肽与SEQ ID NO:7给出 氨基酸序列有至少90%同一性，并且有位于SEQ ID NO:7中残基 29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331 和 346 的一或多个氨基酸取代。例如，UGT76G 多肽可以包含 a)位于氨基酸残基 74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208 和 291 的取代；b)位于残基 74、87、
91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、
208、266、273、274、284、285 和 291 的取代；或者 c)位于残基 74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331 和 346 的取代。本文描述的任一种宿主还可以包含编码UGT74G1多肽的基因(例如，编码UGT74G1多肽的重组基因)。本文描述的任一种宿主还可以包含下述的一或多个:(i)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因；(ii)编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶双功能的基因、或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因；(iii)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因；(iv)编码甜菊醇合成酶的基因；(V)编码截短的HMG-CoA的基因；(vi)编码CPR的基因；(vii)编码鼠李糖合成酶的基因；(viii)编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因和(ix)编码UDP-葡糖醒酸脱羧酶的基因。(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)或(ix)基因中的至少一个是重组基因。在一些实施方案中，(i)、(ii)、(iii)和(iv)基因中的每一个都是重组基因。 本文本还提供了分离的核酸，其编码的多肽与SEQ ID NO:5中给出的氨基酸序列有至少90%序列同一性(例如,至少95%或99%序列同一性)。多肽可以包含位于SEQ IDNO:5 中残基 1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380 或 387-473的至少一个氨基酸取代。多肽可以包含位于SEQ ID勵:5中选自残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427 和 438 的一或多个残基的氨基酸取代。多肽可以包含位于SEQ ID NO:5中残基206的精氨酸，位于残基207的半胱氨酸和位于残基343的精氨酸。在一些实施方案中，多肽包含位于SEQ ID NO:5中的残基30的苯丙氨酸、残基93的谷氨酰胺、残基99的缬氨酸、残基122的苯丙氨酸、残基140的酪氨酸、残基142的半胱氨酸、残基148的苏氨酸、残基153的丙氨酸、残基156的丝氨酸、残基195的甲硫氨酸、残基196的谷氨酸、残基199的谷氨酸、残基211的甲硫氨酸、残基221的苯丙氨酸、残基286的丙氨酸、残基427的天冬酰胺或者残基438的丙氨酸。本文本另一方面提供了分离的多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO:5的氨基酸序列有至少90%同一性。本文本还提供了重组宿主，所述重组宿主包含(i)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因；(ii)编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶双功能的基因、或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因；(iii)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因；
(iv)编码甜菊醇合成酶的基因；其中所述基因中至少一个。当宿主被培养在使每个基因得以表达的条件下时可以产生甜菊醇，并且可以在培养基中积累到至少lmg/L。香叶基香叶基焦磷酸合酶与SEQ ID NOs =121-128中给出的每个氨基酸序列有90%以上的序列同一性。柯巴基焦磷酸合酶与SEQ ID NOs:129-131中给出的每个氨基酸序列有90%以上的序列同一性。异贝壳杉烯合酶与132-135中给出的每个氨基酸序列有90%以上的序列同一性。异贝壳杉烯氧化酶与138-141中给出的每个氨基酸序列有90%以上的序列同一性。甜菊醇合成酶与SEQ ID NOs:142-146中每个氨基酸序列有90%以上的序列同一性。宿主还可以包含编码截短的HMG-CoA的基因和/或编码CPR的基因。任一种重组宿主还可以包含编码UGT74G1多肽、UGT85C2多肽、UGT76G1多肽或UGT91D2多肽的基因中的一或多个。当任一种重组宿主被培养在使每个基因得以表达的条件下时可以产生至少一种甜菊糖苷。所述甜菊糖苷可以选自甜菊醇-13-0-葡萄糖苷、甜菊醇-19-0-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F和杜尔可苷(dulcoside)A。当在所述条件下培养时,甜菊糖苷可以累积到至少Img/升(例如至少IOmg/升或20mg/升)培养基。
任一种重组宿主还可以包含下述中的一或多个:i)编码脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)的基因；ii)编码D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)的基因；iii)编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)的基因；iv)编码4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)的基因；v)编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环焦磷酸合酶(MCS)的基因；vi)编码1-羟基-2-甲基-2 (E)-丁烯基4-焦磷酸合酶(HDS)的基因；或者vii)编码1-羟基-2-甲基-2 (E)-丁烯基4-焦磷酸还原酶(HDR)的基因。任一种重组宿主还可以包含下述中的一或多个:ix)编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因；x)编码截短的HMG-CoA还原酶的基因；xi)编码甲羟戊酸激酶的基因；xii)编码磷酸甲羟戊酸激酶的基因；或者xiii)编码甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因。在本文描述的任一种宿主中，一或多个基因的表达是可诱导的。本文描述的任一种宿主可以是微生物(例如糖酵母(比如酿酒酵母)或者大肠杆菌)，或者植物或植物细胞(例如，甜菊(比如甜叶菊)、中欧葫芦藓(Physcomitrella)或者烟草植物或植物细胞)。本文本另一方面提供了制备甜菊醇或甜菊糖苷的方法。所述方法包括将本文描述的宿主在基因得以表达的条件下生长在培养基中；和回收由宿主产生的甜菊醇或甜菊糖苷。培养步骤可以包括诱导一或多个所述基因的表达。甜菊醇或甜菊糖苷选自甜菊醇-13-0-葡萄糖苷、甜菊醇-19-0-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F和杜尔可苷A。本文还提供了制备甜菊醇或甜菊糖苷的方法。所述方法包括将微生物在香叶基香叶基焦磷酸合酶、柯巴基焦磷酸合酶、异贝壳杉烯合酶、异贝壳杉烯氧化酶、异贝壳杉烯酸13-轻化酶(kaurenoic acid 13-hydroxylase)基因和任选地 UGT74G1 和 / 或 UGT85C2 基因能够被表达的条件下生长在培养基中，和回收由微生物产生的甜菊醇或甜菊糖苷。微生物可以是糖酵母属物种(Saccharomyces spp)。在一些实施方案中，培养步骤包括诱导香叶基香叶基焦磷酸合酶、柯巴基焦磷酸合酶、异贝壳杉烯合酶、异贝壳杉烯氧化酶、异贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGT74G1和UGT85C2基因中的一或多个的表达。在一些实施方案中，回收步骤包括通过HPLC从培养基中纯化甜菊醇或甜菊糖苷。甜菊醇或甜菊糖苷可以是甜菊醇、甜叶悬钩子苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F或杜尔可苷A。本文还提供了包含一或多个生物合成基因的重组糖酵母属菌株，所述基因的表达导致对映-异贝壳杉烯(ent-kaurene)的产生。所述生物合成基因包括编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶双功能的基因，或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因。菌株在表达柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶时，即可产生对映-异贝壳杉烯。本文本另一方面提供了分离的核酸，其与SEQ ID NOs: 18-25、34-36、4-43、48、49、52-55、60-64、70-72、77或79中给出的每个核苷酸序列有90%以上的序列同一性(例如，95%或99%以上的序列同一性)。本文本还提供了重组宿主，其包含(i)编码UGT74G1的基因；(ii)编码UGT85C2的基因编码UGT76G1的基因；和(iv)编码UGT91D2的基因，其中至少一个所述基因是重组基因。在一些实施方案中，每个基因都是重组基因。当宿王在每个基因都能被表达的条件下培养时，可以产生至少一种甜菊糖苷。宿主还可以包含(a)编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶双功能的基因、或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因；(b)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因；(c)编码甜菊醇合成酶的基因；和(d)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因。甜菊糖苷可以是莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷E。本文本还提供了由所述宿主产生的甜菊糖苷组合物。相对甜菊提取物，所述组合物含有占全部甜菊糖苷重量4%以上的莱鲍迪苷D和含量减少的来自甜菊植物的杂质。相对甜菊提取物，所述组合物可以含有占全部甜菊糖苷重量4 %以上的莱鲍迪苷E和含量减少的来自甜菊植物的杂质。本文还提供了分离的核酸，其编码的多肽与UGT91D2e和UGT91D2m的氨基酸序列有90%以上的序列同一性，除了 UGT91D2m的氨基酸序列，并且分离的多肽与UGT91D2e或UGT91D2m的氨基酸序列有90%以上序列同一性，除了 UGT91D2m的氨基酸序列。本文本还提供了由本文描述的宿主产生的甜菊糖苷组合物。相对甜菊提取物，所述组合物含有的来自甜菊植物的杂质水平下降。本文本另一方面提供了重组宿主。所述宿主包含(i)编码UGT91D2的重组基因；
(ii)编码UGT74G1的重组基因；(iii)编码UGT85C2的重组基因；(iv)编码UGT76G1的重组基因；和(V)编码鼠李糖合成酶的基因，其中宿主被培养在每个基因都能得到表达的条件下时，产生至少一种甜菊糖苷。宿主还可以包含(a)编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶双功能的基因、或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因；(b)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因；(c)编码甜菊醇合成酶的基因；和(d)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因。甜菊糖苷可以是莱鲍迪苷C或杜尔可苷A。该文本还提供了由这样的宿主产生的甜菊糖苷组合物。相对甜菊提取物，所述组合物含有占甜菊糖苷总重15%以上的莱鲍迪苷C和含量减少的来自甜菊植物的杂质。还提供了由这样的宿主产生的甜菊糖苷组合物。相对甜菊提取物，所述组合物可以含有占甜菊糖苷总重15%以上的杜尔可苷A和含量减少的来自甜菊植物的杂质。本文本还提供了重组宿主。所述宿主包含⑴编码UGT91D2的重组基因；(ii)编码UGT74G1的重组基因编码UGT85C2的重组基因；(iv)编码UGT76G1的重组基因；(V)编码Μ)Ρ-葡萄糖脱氢酶的基因；和(vi)编码UDP-葡糖醛酸脱羧酶的基因，其中宿主当培养在每个基因都能被表达的条件下时，产生至少一种甜菊糖苷。宿主还可以包含(a)编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶 双功能的基因、或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因；(b)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因；(c)编码甜菊醇合成酶的基因；和(d)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因。所述甜菊糖苷可以是莱鲍迪苷F。本文本还提供了由这样的宿主产生的甜菊糖苷组合物。相对甜菊提取物，所述组合物可以含有占全部甜菊糖苷重量4%以上的莱鲍迪苷F和含量减少的来自甜菊植物的杂质。本文本另一方面提供了制备甜菊糖苷组合物的方法。所述方法包括将本文描述的宿主在每个基因都能得以表达的条件下生长在培养基中；和回收由所述宿主产生的甜菊糖苷组合物，其中相对野生型甜菊植物的甜菊糖苷组合物，回收到的组合物富含莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F或杜尔可苷A。宿主(例如微生物)产生的甜菊糖苷组合物相对甜菊提取物可能来自甜菊植物的杂质含量减少。本文本还提供了食品，所述食品包含的甜菊糖苷组合物相对野生型甜菊植物的甜菊糖苷组合物富含莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F或杜尔可苷A0本文本另一方面提供了鉴定某多态性是否与性状差异关联的方法。所述方法包括确定植物群体中的一或多个基因多态性是否与SEQ ID NO:5中给出的多肽及其功能同源物的基因座有关；和测量所述群体中植物的性状差异与所述群体中植物的一或多个基因多态性之间的相关性，从而确认所述一或多个基因多态性是否与性状差异关联。本文本再一方面提供了制备植物品系的方法。所述方法包括确定植物群体中的一或多个基因多态 性是否与SEQ ID NO:5中给出的多肽及其功能同源物的基因座关联；鉴定群体中的一或多个植物，所述植物中存在至少一个与性状差异关联的基因多态性；将鉴定到的一或多个植物自身或者与不同植物杂交产生种子；将从种子长出的至少一个子代植物自身或者与不同植物杂交；和再重复所述杂交步骤0-5个世代以得到所述植物品系，其中该植物品系中存在至少一个所述基因多态性。本文本还提供了将第二糖部分转移至甜菊糖苷中的葡萄糖的C-2,的方法。所述方法包括将甜菊糖苷与UGT91D2多肽和UDP-糖在适合第二糖部分转移到甜菊糖苷上的反应条件下进行接触。UGT91D2多肽与SEQ ID NO:5中给出的氨基酸序列有至少90%序列同一性(例如，至少95%或99% )。UGT91D2多肽可以包含位于SEQ ID NO:5中残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380 或 387-473 的至少一个氨基酸取代。UGT91D2多肽可以包含位于SEQ ID NO:5中选自残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427 和 438 中的一或多个残基的氨基酸取代。甜菊糖苷可以选自甜菊醇-13-0-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷和莱鲍迪苷A。甜菊糖苷可以是甜叶悬钩子苷，第二糖部分是葡萄糖，在转移了第二葡萄糖部分时产生甜菊苷。甜菊糖苷可以是甜菊苷，第二糖部分可以是葡萄糖，在转移了第二葡萄糖部分时产生莱鲍迪苷E。甜菊糖苷可以是甜菊苷，其中甜菊苷与UGT91D2多肽和UGT76G1多肽在适合产生莱鲍迪苷D的反应条件下进行接触。甜菊糖苷可以是甜菊醇-13-0-葡萄糖苷，通过转移所述第二葡萄糖部分而产生甜菊醇-1，2 二糖苷。甜菊糖苷可以是甜菊醇-13-0-葡萄糖苷，在转移了第二糖部分时产生甜菊醇-1，2-木二糖苷。甜菊糖苷可以是甜菊醇-13-0-葡萄糖苷，通过转移第二糖部分而产生甜菊醇-1，2-鼠李二糖苷。甜菊糖苷可以是莱鲍迪苷A，在转移了第二葡萄糖部分时产生莱鲍迪苷D。本文本另一方面提供了确定甜菊(Stevia)植物中存在多核苷酸的方法。所述方法包括将至少一个探针或引物对与来自甜菊植物的核酸进行接触，其中所述探针或引物对是编码UGT多肽的多核苷酸特异的，其中所述UGT多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO =USEQID NO:3或SEQ ID NO:7有至少90%的序列同一性；和确定所述甜菊植物中是否存在多核苷酸。本文本还提供了用于甜菊(Stevia)生物样品的基因分型的试剂盒。所述试剂盒包含能够特异扩增多核苷酸的引物对或者能够与多核苷酸特异杂交的探针，其中所述多核苷酸编码的 UGT 多肽与 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:USEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:7 有至少90%的序列同一性。本文还提供了包含一或多个生物合成基因的重组微生物，所述生物合成基因的表达会导致产生一或多种甜菊糖苷。所述生物合成基因包括编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因、编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因、编码异贝壳杉烯氧化酶的基因、编码甜菊醇合成酶的基因，和编码UGT74G1和/或UGT85C2的基因。所述基因中的至少一个是重组基因。微生物可以包含编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶双功能的基因代替编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因。重组微生物被培养在每个基因都能得以表达的条件下时，产生至少一种甜菊糖苷。所述甜菊糖苷可以是甜叶悬钩子苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、杜尔可苷B或者杜尔可苷A0重组微生物可以是糖酵母(例如酿酒酵母)，并且带有一或多个基因修饰，所述基因修饰使得相对没有这样的基因修饰的对照微生物，EXGl和EXG2糖苷水解酶的活性下降；并且带有一或多个基因修饰，所述基因修饰使得相对没有这样的基因修饰的对照微生物，麦角固醇生物合成下降。糖酵母被培养在每个基因都能得以表达的条件下时，产生甜叶悬钩子苷。甜叶悬钩子苷可以积累到至少IOmg/升培养基。糖酵母可以是被指定为CEY171、CEY191或CEY213的酿酒酵母菌株。重组微生物还可以包含编码SM1`2UGT的基因和编码UGT76G1的基因，并且在被培养在每个基因都能得以表达的条件下时，产生甜菊糖苷。所述甜菊糖苷可以是莱鲍迪苷A。本文还提供了重组微生物，其包含的一或多个生物合成基因在表达时导致产生至少一种甜菊糖苷。生物合成基因包括编码SM12UGT的基因、编码UGT74G1的基因、编码UGT76G1的基因和编码UGT85C2的基因。重组微生物被培养在每个基因都能得以表达的条件下时，产生莱鲍迪苷A或莱鲍迪苷B。培养基中的莱鲍迪苷A或莱鲍迪苷B可以累积到至少 lmg/L。本文还提供了重组微生物，其包含编码UGT91D2多肽的基因，例如重组UGT91D2基因。本文还提供了重组微生物，其包含编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因、编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶双功能的基因(或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因)、编码异贝壳杉烯氧化酶的基因、编码甜菊醇合成酶的基因、编码UGT74G1的基因、编码UGT85C2的基因、编码UGT76G1的基因和编码UGT91D2的基因。所述基因中的至少一个是重组基因。重组微生物在被培养在每个基因都能得以表达的条件下时，可以产生至少一种甜菊糖苷，例如莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B和/或莱鲍迪苷F。重组微生物在被培养在这种条件下时，可以累积至少20mg甜菊糖苷/升培养基。重组微生物可以是糖酵母(例如酿酒酵母)，并且带有一或多个基因修饰，所述基因修饰使得相对没有这样的基因修饰的对照微生物，EXGl和EXG2糖苷水解酶的活性下降；并且带有一或多个基因修饰，所述基因修饰使得相对没有这样的基因修饰的对照微生物，麦角固醇生物合成下降。本文还提供了重组微生物，其包含编码UGT74G1的基因、编码UGT85C2的基因、编码UGT76G1的基因和编码UGT91D2的基因。所述基因中的至少一个是重组基因。重组微生物在被培养在每个基因都能得以表达的条件下时，可以产生甜菊糖苷，例如莱鲍迪苷A或莱鲍迪苷B。莱鲍迪苷A或莱鲍迪苷B在培养基中可以累积到至少15mg/L。以上描述的重组微生物还可以包含编码脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)的基因，和/或编码D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)的基因，和/或编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)的基因，和/或编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)的基因，和/或编码4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2，4_环焦磷酸合酶(MCS)的基因，和/或编码1-羟基-2-甲基-2 (E)-丁烯基4-焦磷酸合酶(HDS)的基因，和/或编码1-羟基-2-甲基-2(E)- 丁烯基4-焦磷酸还原酶(HDR)的基因。以上描述的 重组微生物还可以包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因，和/或编码截短的HMG-CoA还原酶的基因，和/或编码甲羟戊酸激酶的基因，和/或编码磷酸甲羟戊酸激酶的基因，和/或编码甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因。除非另有定义，本文使用的所有科技术语均与发明所属领域的普通技术人员理解的含义形同。虽然与本文描述的类似或等同的方法和材料可以用于发明的实施，以下描述了合适的方法和材料。所有出版物、专利申请、专利和其它提及的参考文献均通过引用全部并入本文。有冲突的情况下，由本说明书包括定义决定。此外，材料、方法和实施例仅用于说明而非限制的目的。由以下详细描述，本发明的其它特征和优点是显而易见的。申请人保留按照专利法的标准做法，使用连接词“包含”、“基本由...构成”或者“由...构成替代地要求保护任一种公开的发明的权利。
图1是显示由香叶基香叶基焦磷酸生物合成甜菊醇的示意图。图2A-D显示由甜菊醇生物合成甜菊糖苷的代表性途径。图3显示了不同甜菊糖苷的化学结构。图4是酿酒酵母中rebA产生的示意图。图5是基因串联形成eYACs的不意图。图6显示了酵母菌株CEY13在各种培养条件下的甜叶悬钩子苷产量。图7显示了与甜叶悬钩子苷的文献记录数值相比，由酵母菌株CEY213产生的化合物的1H和13C NMR分析得到的数据。图8 是 UGT91D1 和 UGT91D2 氨基酸序列(SEQ ID NOs:14、16、12、5 和 10)的分别
序列比对。图9显示了含有质粒pMUS47的酵母CEY213在24和99小时培养后产生的莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜叶悬钩子苷。图1OA是显示上清液中RebA、甜叶悬钩子苷和19-SMG的浓度的曲线。图1OB是酵母细胞被饲喂100 μ M甜菊醇的试验中，在细胞沉淀中测量到的RebA、甜叶悬钩子苷和19-SMG的浓度的曲线。两个曲线中，第一组条带代表未标签的对照菌株；第二组条带代表含有UGT74G1、UGT76G1和UGT91D2e融合蛋白(其中每个UGT融合了 MDM2蛋白的N端的158个氨基酸)以及UGT85C2融合蛋白(其中合成PMI肽的四个重复与85C2的N末端符合读框融合)的菌株。Y轴是微摩尔单位的浓度。不同附图中同样的符号表示同样的元件。发明详述两种糖苷甜菊苷和莱鲍迪苷A是商品甜菊提取物中的主要化合物。甜菊苷据报道比莱鲍迪苷A的味道更苦，甜味淡一些，因此，优选在提取物制品中含有更高比例的莱鲍迪苷A。然而甜菊提取物组合物根据植物所生长的土壤和气候可能批次之间各不相同。取决于所来源的植物、气候条件和提取过程，商业制品中莱鲍迪苷A的量据报道在甜菊糖苷总含量的20-97%之间变化，一般> 50-80%，有时高达甜菊糖苷总量的> 95-97%。而且，甜菊提取物中还有其它不同量的甜菊糖苷，这使得通过提取和纯化从甜菊植物中制备具有一致口味的甜味剂更加复杂。例如，莱鲍迪苷B通常含量低于1-2%，而莱鲍迪苷C可能达到7-15%的水平。莱鲍迪苷D —般在2%或更低的水平，组合物中的莱鲍迪苷F —般是总甜菊糖苷的3.5%或更低。甚至据报道痕量的次要甜菊糖苷都会影响甜菊提取物的风味。此夕卜，人们认为甜菊植物中的一些杂质，即使浓度非常低，也可能给某些植物提取物商品带来异味。本文本基于这样的发现，即可以开发诸如植物细胞、植物或微生物的重组宿主来表达用于生物合成甜菊醇的多肽。并且，这类宿主可以表达适合产生甜菊糖苷(比如甜叶悬钩子苷和莱鲍迪苷A)的尿苷5' - 二磷酸(UDP)糖基转移酶。重组微生物是尤其有用的宿主。这些生物合成多肽在各种微生物框架的表达使得可以由能量和碳源(比如糖、醇、C02、H2和阳光)以持续、可重复的方式产生甜菊醇及其糖苷。重组宿主产生的各种甜菊糖苷的比例可以通过将预先选定的生物合成酶引入宿主并以合适的水平表达这些酶来具体决定，从而产生具有一致口味的甜味剂组合物。此外，重组宿主产生的甜菊糖苷的浓度预期比甜菊植物中产生的甜菊糖苷水平更高，这样可以提高下游纯化的效率。相对甜菊提取物中存在的杂质的量，这样的甜味剂组合物含有极少甚至没有源于植物的杂质。所述基因中至少有一个是重组基因，具体的重组基因取决于选中的种或菌株。为了增加甜菊醇和糖苷的产量，提高能量和碳源转化为甜菊醇及其糖苷的效率，和/或增强细胞培养物或植物的产率，可以包含上其它基因或生物合成模块。这类其它生物合成模块包括参与类萜前体、异戊烯基焦磷酸和二甲基烯丙焦磷酸的合成的基因。其它生物合成模块包括萜合酶和萜环化酶基因，比如编码香叶基香叶基焦磷酸合酶和柯巴基焦磷酸合酶的基因；这些基因可以是内源基因或者是重组基因。1.甜菊醇和甜菊糖苷生物合成多肽A.甜菊醇生物合成多肽甜菊提取物中存在的几种化合物，包括二萜甜菊醇和各种甜菊糖苷的化学结构如图3所示。以下表A中显示了它们的CAS编号。还可以参见Steviol Glycosides Chemicaland Technical Assessment 69th TECFA,由 Harriet Wallin 制作，Food Agric.0rg.(2007)。
表 A.
权利要求
1.重组宿主，其包含编码UGT91D2多肽的重组基因。
2.权利要求1所述的重组宿主，其中所述UGT91D2多肽是UGT91D2e或UGT91D2m。
3.权利要求1或2所述的重组宿主，其中所述UGT91D2多肽与SEQIDN0:5中给出的氨基酸序列有至少90%的同一性。
4.权利要求3所述的重组宿主，其中所述UGT91D2多肽与SEQID NO:5中给出的氨基酸序列有至少95%的同一性。
5.权利要求4所述的重组宿主，其中所述UGT91D2多肽与SEQID NO:5中给出的氨基酸序列有至少99%的同一性。
6.权利要求1-5中任一项所述的宿主，其中所述宿主是微生物。
7.权利要求6所述的宿主，其中所述微生物是糖酵母属微生物。
8.权利要求6所述的宿主，其中所述糖酵母属微生物是酿酒酵母。
9.权利要求6所述的宿主，其中所述微生物是大肠杆菌。
10.权利要求1-5中任一项所述的宿主，其中所述宿主是植物或植物细胞。
11.权利要求10所述的宿主，其中所述植物或植物细胞是甜菊、中欧葫芦藓或烟草植物或植物细胞。
12.权利要求11所述的宿主，其中所述甜菊植物或植物细胞是甜叶菊植物或植物细胞。
13.权利要求1-12中任一项所述的宿主，其中所述多肽包含位于SEQIDNO: 5中残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380 或 387-473 的至少一个氨基酸取代。
14.权利要求1-13中任一项所述的宿主，其中所述多肽包含位于SEQIDN0:5中选自残基 30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427 和438的一或多个残基的氨基酸取代。
15.权利要求14所述的宿主，其中所述多肽相对SEQID NO:5包含位于残基206的精氨酸，位于残基207的半胱氨酸和位于残基343的精氨酸。
16.权利要求14所述的宿主，其中所述多肽相对SEQID NO:5包含位于残基30的苯丙氨酸、残基93的谷氨酰胺、残基99的缬氨酸、残基122的苯丙氨酸、残基140的酪氨酸、残基142的半胱氨酸、残基148的苏氨酸、残基153的丙氨酸、残基156的丝氨酸、残基195的甲硫氨酸、残基196的谷氨酸、残基199的谷氨酸、残基211的甲硫氨酸、残基221的苯丙氨酸、残基286的丙氨酸、残基427的天冬酰胺或者残基438的丙氨酸。
17.权利要求1-15中任一项所述的宿主，其中所述多肽包含SEQIDNO:95的氨基酸序列。
18.权利要求1-12中任一项所述的宿主，其中所述多肽包含SEQID N0:5的氨基酸序列。
19.权利要求1-18中任一项所述的宿主，所述宿主还包含编码与SEQIDN0:3给出的氨基酸序列有至少90%同一性的UGT85C多肽的重组基因。
20.权利要求19所述的宿主，其中所述UGT85C多肽包含位于SEQIDN0:3的残基9、10、`13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、`418、420、440、441、444和471的一或多个氨基酸取代。
21.权利要求1-20中任一项所述的宿主，所述宿主还包含编码与SEQIDNO:7给出的氨基酸序列有至少90%同一性的UGT76G多肽的重组基因。
22.权利要求21所述的宿主，所述UGT76G多肽包含位于SEQID NO:7的残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331 和 346 的一或多个氨基酸取代。
23.重组宿主，所述宿主包含的重组基因编码的UGT85C多肽与SEQIDNO:3中给出的氨基酸序列有至少90%同一性，并且有位于SEQ ID NO:3中的残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444和471的一或多个氨基酸取代。
24.权利要求23所述的宿主，其中所述多肽包含位于SEQID NO:3的残基13、15、60、270,289和418的取代。
25.权利要求23所述的宿主，其中所述多肽包含a)位于SEQID NO:3的残基13、60和270的取代；b)位于SEQ ID NO: 3的残基60和87的取代；c)位于SEQ ID NO: 3的残基65、71、220、243 和 270 的取代；d)位于 SEQ IDNO:3 的残基 65、71、220、243、270 和 441 的取代；e)位于SEQ ID NO: 3的残基65、71、220、389和394的取代；f)位于SEQ ID NO: 3的残基65、71、270和289的取代；g)位于SEQ ID NO: 3的残基15和65的取代；h)位于SEQID NO:3的残基65和270的取代；i)位于SEQ ID NO:3的残基65和440的取代；j)位于SEQ ID NO: 3的残基65和441的取代；k)位于SEQ IDNO: 3的残基65和418的取代；1)位于SEQ ID NO: 3的残基220、243、270和334的取代；或者m)位于SEQ ID NO: 3的残基270和289的取代。
26.重组宿主，其包含的重组基因编码的UGT76G多肽与SEQID N0:7给出的氨基酸序列有至少90%同一性，并且有位于SEQ ID NO:7中残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、 194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331和346的一或多个氨基酸取代。
27.权利要求26所述的宿主，其中所述多肽含有a)位于氨基酸残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208 和 291的取代；b)位于残基 74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285 和 291 的取代；或者 c)位于残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331 和 346 的取代。
28.权利要求23-27中任一项所述的宿主，其中所述宿主是微生物。
29.权利要求28所述的宿主，其中所述微生物是糖酵母属微生物。
30.权利要求29所述的宿主，其中所述糖酵母属微生物是酿酒酵母。
31.权利要求28所述的宿主，其中所述微生物是大肠杆菌。
32.权利要求23-27中任一项所述的宿主，其中所述宿主是植物或植物细胞。
33.权利要求32所述的宿主，其中所述植物或植物细胞是甜菊、中欧葫芦藓或者烟草植物或植物细胞.
34.权利要求33所述的宿主，其中所述甜菊植物或植物细胞是甜叶菊植物或植物细胞。
35.权利要求1-34中任一项所述的宿主，所述宿主还包含编码UGT74G1多肽的基因。
36.权利要求35所述的宿主，其中所述编码所述UGT74G1多肽的基因是重组基因。
37.权利要求1-36中任一项所述的宿主,所述宿主还包含下述中的一或多个: (i)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因； ( )编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶双功能的基因，或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因； (iii)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因；和 (iv)编码甜菊醇合成酶的基因。
38.权利要求1-37中任一项所述的宿主，所述宿主还包含下述中的一或多个: (V)编码截短的HMG-CoA的基因； (vi)编码CPR的基因； (vii)编码鼠李糖合成酶的基因； (viii)编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因；和 (ix)编码UDP-葡糖醛酸脱羧酶的基因。
39.权利要求38 所述的宿主,其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)、(vii)、(viii)或(ix)中的至少一个基因是重组基因。
40.权利要求37所述的宿主，其中和(iv)中的每个基因都是重组基因。
41.分离的核酸，其编码与SEQID NO:5给出的氨基酸序列有至少90%同一性的多肽。
42.权利要求41所述的核酸，其中所述多肽与SEQID NO:5给出的氨基酸序列有至少95%同一性。
43.权利要求41或42所述的核酸，其中所述多肽与SEQID NO: 5给出的氨基酸序列有至少99%同一性。
44.权利要求41-43中任一项所述的核酸，其中所述多肽包含位于SEQIDN0:5中残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380 或 387-473 的至少一个氨基酸取代。
45.权利要求41-44中任一项所述的核酸，其中所述多肽包含位于SEQIDN0:5中选自残基 30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427和438中的一或多个残基的氨基酸取代。
46.权利要求41-45中任一项所述的核酸,其中所述多肽包含位于SEQIDNO: 5中残基206的精氨酸、残基207的半胱氨酸和残基343的精氨酸。
47.权利要求41-45中任一项所述的核酸，其中所述多肽包含位于SEQIDNO: 5的残基位点30的苯丙氨酸、残基位点93的谷氨酰胺、残基位点99的缬氨酸、残基位点122的苯丙氨酸、残基位点140的酪氨酸、残基位点142的半胱氨酸、残基位点148的苏氨酸、残基位点153的丙氨酸、残基位点156的丝氨酸、残基位点195的甲硫氨酸、残基位点196的谷氨酸、残基位点199的谷氨酸、残基位点211的甲硫氨酸、残基位点221的苯丙氨酸、残基位点286的丙氨酸、残基位点427的天冬酰胺或者残基位点438的丙氨酸。
48.分离的多肽，其具有与SEQID NO:5的氨基酸序列有至少90%同一性的氨基酸序列。
49.重组宿主，所述宿主包含: (i)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因； ( )编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶双功能的基因，或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因； (iii)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因；和 (iv)编码甜菊醇合成酶的基因； 其中所述基因中的至少一个是重组基因。
50.权利要求49所述的宿主，其中所述宿主被培养在每个所述基因都能得以表达的条件下时产生甜菊醇。
51.权利要求50所述的宿主，其中当培养在所述条件下时，所述甜菊醇累积到至少lmg/L培养基。
52.权利要求49-51中任一项所述的宿主，其中所述香叶基香叶基焦磷酸合酶与SEQID NOs: 121-128之一给出的氨基酸序列有90%以上的序列同一性。
53.权利要求49-52中任一项所述的宿主，其中所述柯巴基焦磷酸合酶与SEQIDNOs: 129-131之一给出的氨基酸序列有90%以上的序列同一性。
54.权利要求49-53中任一项所述的宿主，其中所述异贝壳杉烯合酶与SEQIDNOs: 132-135之一给出的氨基酸序列有90%以上的序列同一性。
55.权利要求49-54中任一项所述的宿主，其中所述异贝壳杉烯氧化酶与SEQIDNOs: 138-141之一给出的氨基酸序列之一有90%以上的序列同一性。
56.权利要求49-55中任一项所述的宿主，其中所述甜菊醇合成酶与SEQIDNOs: 142-146之一给出的氨基酸序列之一有90%以上的序列同一性。
57.权利要求49-56中任一项所述的宿主，还包含编码截短的HMG-CoA的基因。
58.权利要求49-57中任一项所述的宿主，还包含编码CPR的基因。
59.权利要求49-58中任一项所述的宿主，所述宿主还包含编码UGT74G1多肽的基因。
60.权利要求49-59中任一项所述的宿主，所述宿主还包含编码UGT85C2多肽的基因。
61.权利要求49-60中任一项所述的宿主，所述宿主还包含编码UGT76G1多肽的基因。
62.权利要求49-61中任一项所述的宿主，所述宿主还包含编码UGT91D2多肽的基因。
63.权利要求59-62中任一项所述的宿主，其中所述宿主当培养在每个所述基因都能得以表达的条件下时产生至少一种甜菊糖苷。
64.权利要求63所述的宿主，其中所述甜菊糖苷选自甜菊醇-13-0-葡萄糖苷、甜菊醇-19-0-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F和杜尔可苷A。
65.权利要求64所述的宿主，其中当培养在所述条件下时，所述甜菊糖苷累积到至少Img/升培养基。
66.权利要求65所述的宿主，其中当培养在所述条件下时，所述甜菊糖苷累积到至少IOmg/升培养基。
67.权利要求66所述的宿主，其中当培养在所述条件下时，所述甜菊糖苷累积到至少20mg/升培养基。
68.权利要求49-67中任一项所述的宿主,所述宿主还包含下述中的一或多个i)编码脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)的基因； )编码D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)的基因； iii)编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)的基因； iv)编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)的基因； V)编码4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环焦磷酸合酶(MCS)的基因； vi)编码1-羟基-2-甲基-2(E) - 丁烯基4-焦磷酸合酶(HDS)的基因； vii)编码1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-焦磷酸还原酶(HDR)的基因。
69.权利要求49-68中任一项所述的宿主,所述宿主还包含下述中的一或多个: ix)编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因； X)编码截短的HMG-CoA还原酶的基因； xi)编码甲羟戊酸激酶的基因； xii)编码磷酸甲羟戊酸激酶的基因； xiii)编码甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因。
70.权利要求49-69中任一项所述的宿主，其中所述基因中的一或多个是可诱导的。
71.权利要求 49-70中任一项所述的宿主，其中所述宿主是微生物、植物或植物细胞。
72.权利要求71所述的宿主，其中所述宿主是酿酒酵母。
73.生产甜菊醇或甜菊糖苷的方法，所述方法包括: a)将权利要求71或72所述的宿主在所述基因能够得以表达的条件下生长在培养基中；和 b)回收所述宿主产生的甜菊醇或甜菊糖苷。
74.权利要求73所述的方法，其中所述生长步骤包括诱导一或多个所述基因的表达。
75.权利要求73或74所述的方法，其中所述甜菊醇或甜菊糖苷选自甜菊醇-13-0-葡萄糖苷、甜菊醇-19-0-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F和杜尔可苷A。
76.重组糖酵母属菌株，其包含: (i)编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶双功能的基因，或者 ( )编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因； 其中所述菌株在表达所述柯巴基焦磷酸合酶和所述异贝壳杉烯合酶时即产生对映-异贝壳杉烯。
77.分离的核酸，其与SEQ ID N0s:18-25、34-36、4-43、48、49、52-55、60-64、70-72、77或79给出的核苷酸序列之一有90%以上的序列同一性。
78.重组宿主，所述宿主包含: ⑴编码UGT74G1的基因； ( )编码UGT85C2的基因； (iii)编码UGT76G1的基因；和 (iv)编码UGT91D2的基因， 其中所述基因中的至少一个是重组基因。
79.权利要求78所述的宿主，其中每个所述基因都是重组基因。
80.权利要求78或79所述的宿主，其中所述宿主当培养在每个所述基因都能得以表达的条件下时产生至少一种甜菊糖苷。
81.权利要求78-80中任一项所述的宿主，还包含 (a)编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶双功能的基因，或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因； (b)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因； (c)编码甜菊醇合成酶的基因； (d)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因。
82.权利要求78-81中任一项所述的宿主，其中所述甜菊糖苷是莱鲍迪苷A。
83.分离的核酸，其编码的多肽与UGT91D2e或UGT91D2m的氨基酸序列有90%以上的序列同一性，除去UGT91D2m的氨基酸序列。
84.分离的多肽，其与UGT91D2e或UGT91D2m的氨基酸序列有90%以上的序列同一性，除去UGT91D2m的氨基酸序列。
85.由权利要求78-81中任一项所述的宿主产生的甜菊糖苷组合物，所述组合物相对甜菊提取物含有的来自甜菊植物的杂质水平下降。
86.重组宿主，所述宿主包含: (i)编码UGT91D2的重组基因； ( )编码UGT74G1的重组基因； (iii)编码UGT85C2的重组基因；和 (iv)编码UGT76G1的重组基因；和 (v)编码鼠李糖合成酶的基因， 其中所述宿主当培养在每个所述基因都能得以表达的条件下时产生至少一种甜菊糖苷。
87.权利要求86所述的宿主，还包含 (a)编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶双功能的基因，或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因； (b)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因； (c)编码甜菊醇合成酶的基因；和 (d)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因。
88.权利要求86或87的宿主，其中所述甜菊糖苷是莱鲍迪苷C或杜尔可苷A。
89.由权利要求86或87所述的宿主产生的甜菊糖苷组合物，所述组合物含有占全部甜菊糖苷重量15%以上的莱鲍迪苷C，并且相对甜菊提取物而言来自甜菊植物的杂质水平下降。
90.由权利要求86或87所述的宿主产生的甜菊糖苷组合物，所述组合物含有占全部甜菊糖苷重量15%以上的杜尔可苷A，并且相对甜菊提取物而言来自甜菊植物的杂质水平下降。
91.重组宿主,所述宿主包含: (i)编码UGT91D2的重组基因； ( )编码UGT74G1的重组基因； iii)编码UGT85C2的重组基因；和(iv)编码UGT76G1的重组基因； 其中所述宿主当培养在每个所述基因都能得以表达的条件下时产生至少一种甜菊糖苷。
92.权利要求91所述的宿主，还包含 (a)编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶双功能的基因，或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因； (b)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因； (C)编码甜菊醇合成酶的基因；和 (d)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因。
93.权利要求91或92所述的宿主，其中所述甜菊糖苷是莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷E。
94.由权利要求91或92所述的宿主产生的甜菊糖苷组合物，所述组合物含有占全部甜菊糖苷重量4%以上的莱鲍迪苷D，并且相对甜菊提取物而言来自甜菊植物的杂质水平下降。
95.由权利要求91或92所述的宿主产生的甜菊糖苷组合物，所述组合物含有占全部甜菊糖苷重量4%以上的莱鲍迪苷E，并且相对甜菊提取物而言来自甜菊植物的杂质水平下降。
96.重组宿主，所述宿主包含: (i)编码UGT91D2的重组基因； ( )编码UGT74G1的重组基因； (iii)编码UGT85C2的重组基因； (iv)编码UGT76G1的重组基因； (V)编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因；和 (vi)编码UDP-葡糖醛酸脱羧酶的基因， 其中所述宿主当培养在每个所述基因都能得以表达的条件下时产生至少一种甜菊糖苷。
97.权利要求96所述的宿主，还包含 (a)编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶双功能的基因，或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因； (b)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因； (c)编码甜菊醇合成酶的基因；和 (d)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因。
98.权利要求96或97所述的微生物，其中所述甜菊糖苷是莱鲍迪苷F。
99.由权利要求96或97所述的宿主产生的甜菊糖苷组合物，所述组合物含有占全部甜菊糖苷重量4%以上的莱鲍迪苷F，并且相对甜菊提取物而言来自甜菊植物的杂质水平下降。
100.产生甜菊糖苷组合物的方法，其包括: a)将权利要求86-88、91-93或96-98中任一项所述的宿主在每个所述基因都能够得以表达的条件下生长在培养基中；和 b)回收所述宿主产生的甜菊糖苷组合物,其中所述组合物相对野生型甜菊植物的甜菊糖苷组合物而言，富含莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F或杜尔可苷A。
101.权利要求100所述的方法，其中所述微生物产生的所述甜菊糖苷组合物相对甜菊提取物而言，来自甜菊植物的杂质含量下降。
102.食品，其包含相比于野生型甜菊植物的甜菊糖苷组合物而言富含莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F或杜尔可苷A的甜菊糖苷组合物。
103.鉴定多态性是否与性状差别关联的方法，所述方法包括: a)确定植物群体中的一或多个基因多态性是否与SEQID NO:5中给出的多肽及其功能同源物的基因座关联；和 b)测量所述群体中植物的所述性状的差别与所述群体的植物中所述一或多个基因多态性的存在之间的相关性，从而确认所述一或多个基因多态性是否与所述性状的差别关联。
104.制备植物品系的方法，所述方法包括: a)确定植物群体中的一或多个基因多态性是否与SEQID NO:5中给出的多肽及其功能同源物的基因座关联； b)鉴定所述群体中的一或多个植物，所述植物中存在至少一个与性状差异关联的基因多态性； c)将鉴定到的一或多个所述植物自交或者与不同植物杂交产生种子； d)将从种子长出的至少一个子代植物自交或者与不同植物杂交；和 e)将步骤c)和d)再重复0-5个世代以得到所述植物品系，其中所述植物品系中存在至少一个所述基因多态性。
105.给甜菊糖苷中的葡萄糖的C-2’转移第二个糖部分的方法，所述方法包括将甜菊糖苷与UGT91D2多肽和UDP-糖在适合第二个糖部分转移到所述甜菊糖苷上的反应条件下进行接触。
106.权利要求105所述的方法，其中所述UGT91D2多肽与SEQID NO:5给出的氨基酸序列有至少90%同一性。
107.权利要求106所述的方法，其中所述UGT91D2多肽与SEQID NO:5给出的氨基酸序列有至少95%同一性。
108.权利要求107所述的方法，其中所述UGT91D2多肽与SEQID NO: 5给出的氨基酸序列有至少99%同一性。
109.权利要求105-108中任一项所述的方法，其中所述多肽包含位于SEQID NO:5中残基 1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202,215-380 或 387-473 的至少一个氨基酸取代。
110.权利要求105-109中任一项所述的方法，其中所述多肽包含位于SEQID NO:5中选自残基 30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427和438的一或多个残基的氨基酸取代。
111.权利要求105-110中任一项所述的方法，其中所述甜菊糖苷选自甜菊醇-13-0-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷和莱鲍迪苷A。
112.权利要求111所述的方法，其中所述甜菊糖苷是甜叶悬钩子苷，其中所述第二糖部分是葡萄糖，并且在转移了所述第二葡萄糖部分时产生甜菊苷。
113.权利要求111所述的方法，其中所述甜菊糖苷是甜菊苷，其中所述第二糖部分是葡萄糖，并且在转移了所述第二葡萄糖部分时产生莱鲍迪苷E。
114.权利要求111所述的方法，其中所述甜菊糖苷是甜菊苷，其中甜菊苷与所述UGT91D2多肽和UGT76G1多肽在所述合适的反应条件下进行接触以产生莱鲍迪苷D。
115.权利要求111所述的方法，其中所述甜菊糖苷是甜菊醇-13-0-葡萄糖苷，并且在转移了所述第二葡萄糖部分时产生甜菊醇-1，2 二糖苷。
116.权利要求111所述的方法，其中所述甜菊糖苷是甜菊醇-13-0-葡萄糖苷，并且在转移了所述第二糖部分时产生甜菊醇-1，2-木二糖苷。
117.权利要求111所述的方法，其中所述甜菊糖苷是甜菊醇-13-0-葡萄糖苷，并且在转移了所述第二糖部分时产生甜菊醇-1，2-鼠李二糖苷。
118.权利要求111所述的方法，其中所述甜菊糖苷是莱鲍迪苷A，并且在转移了所述第二葡萄糖部分时产生莱鲍迪苷D。
119.确定甜菊植物中是否存在某多核苷酸的方法，所述方法包括: a)将至少一个探针或引物对与来自所述甜菊植物的核酸进行接触，其中所述探针或引物对是特异于编码UGT多肽的多核苷酸的，其中所述UGT多肽与SEQ ID N0:5、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 7有至少90%序列同一性，和 b)确定所述甜菊植物中是否存在所述多核苷酸。
120.用于甜菊生物 样品基因分型的试剂盒，所述试剂盒包含对多核苷酸特异扩增的引物对或者特异结合的探针，其中所述多核苷酸编码的UGT多肽与SEQ ID NO:5, SEQ IDNO: 1、SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO: 7 有至少 90% 序列同一性。
全文摘要
本文公开了经过改造能够表达编码甜菊醇生物合成酶和UDP-糖基转移酶(UGTs)的新型重组基因的重组微生物、植物和植物细胞。这些微生物、植物或植物细胞可以产生甜菊醇或甜菊糖苷(例如甜叶悬钩子苷或莱鲍迪苷A)，作为食品中的天然甜味剂和膳食补充剂。
文档编号C12P7/58GK103179850SQ201180038475
公开日2013年6月26日 申请日期2011年6月2日 优先权日2010年6月2日
发明者G.M.基肖尔, M.莫申, P.M.希克斯, J.汉森, J.霍顿-拉森, E.H.汉森, M.D.米克尔森, S.塔瓦雷斯, C.布洛姆 申请人:伊沃瓦营养学股份有限公司