专利名称：用于核酸的合成和/或检测的组合物、试剂盒及方法
用于核酸的合成和/或检测的组合物、试剂盒及方法相关申请的交叉参考本申请要求2010年6月21日提交的美国临时申请号61/357，031在35U.S. C. 119(e)下的优先权的利益，将所述临时申请通过引用整体并入本文。背景本公开内容涉及用于核酸的合成和/或检测的组合物、试剂盒及方法。对于许多医学、诊断和法医应用，特定DNA序列的扩增是使其能够在其以极低量存在于其中的样品中被检测或使其能够从所述样品分离所必需的。最近，特定基因的体外扩增已提供了强大的成本较低的方法以促进利用子生物学技术的治疗性蛋白质的生产，并且同样可用于基因疗法。聚合酶链式反应(PCR)技术公开于美国专利号4，683，202;4, 683，195;4, 800，159和4，965，188中。PCR法也描述于Saiki等人，1985，Science230:1350中。以其最简单形式，PCR是用于使用两个寡核苷酸引物酶促合成特定DNA序列的体外方法，所述两个引物与相反链杂交并且侧翼连接靶DNA的目标区域。重复系列的反应步骤(包括模板变性、引物退火和通过DNA聚合酶进行的退火引物的延伸)导致其末端由引物的5’末端界定的特定片段的指数积累。PCR能够选择性富集特定DNA序列至IO9倍。
商购可得的PCR预混合物(master mix)提高了效率并且减小了与高通量分析所需的大量PCR反应的装配相关的错误。此类预混合物包含对于所有PCR反应是共同的试剂的组合。例如，预混合物可包含缓冲剂、盐例如MgCl2、脱氧核苷三磷酸(dNTP)和热稳定性DNA聚合酶。每一个孔可包含共同的预混合物以及特定靶核酸和引物对。通常，以浓缩液或冻干粉(当装配终反应时，所述浓缩液或冻干粉随后被稀释或溶解)的形式制备和分配预混合物。为了进行准确分析，PCR预混合物应当提供可靠的、坚实的和可重现的PCR结果。此外，PCR预混合物应当允许检测低拷贝靶核酸。PCR预混合物还应当允许进行快速PCR反应循环以允许快速筛选核酸(例如，DNA和cDNA)。此外，PCR预混合物还应当能够在环境温度或室温下在实验台上是稳定的，以便PCR反应不必在装配后立即扩增。核酸样品的来源包括但不限于例如衣服、土壤、纸、金属表面、空气、水、植物部分以及人和/或动物皮肤、头发、血液、血清、粪便、奶、唾液、尿和/或其它分泌液体。此类来源还可包含抑制PCR扩增的化合物。因此，需要鉴定阻断或减弱在核酸样品的来源中发现的组分对PCR扩增的抑制的试剂。概述本文中公开了用于通过聚合酶链式反应合成和/或检测核酸的组合物、试剂盒和方法，所述组合物、试剂盒和方法包括DNA聚合酶和PCR抑制剂阻断剂。PCR抑制剂阻断剂减缓由多种通常在包含通过PCR分析的核酸的样品中发现的化合物引起的PCR的抑制。本文中公开的组合物、试剂盒和方法确保在大范围靶核酸浓度上的灵敏可靠的PCR结果。组合物还允许在快速PCR热循环中获得快速结果。组合物还提供了可在室温下稳定长达72小时或更长时间的装配的PCR反应。本文中公开了包含热稳定性DNA聚合酶和PCR抑制剂阻断剂的组合物，其中PCR抑制剂阻断剂以有效地增强装配的PCR对PCR抑制剂的耐受性的量存在。本文中还提供了包括含有热稳定性DNA聚合酶和PCR抑制剂阻断剂的组合物的试剂盒，其中PCR抑制剂阻断剂以有效地增强装配的PCR对PCR抑制剂的耐受性的量存在。本文中还公开了包括含有热稳定性DNA聚合酶和PCR抑制剂阻断剂、引物和标记的探针的组合物的试剂盒，其中PCR抑制剂阻断剂以有效地增强装配的PCR对PCR抑制剂的耐受性的量存在。本文中还公开了用于核酸合成的方法，包括将含有热稳定性DNA聚合酶和PCR抑制剂阻断剂探针的组合物与核酸样品和引物混合，和使用核酸样品作为模板合成核酸，其中PCR抑制剂阻断剂以有效地增强装配的PCR对PCR抑制剂的耐受性的量存在；和使用核酸样品作为模板合成核酸。在一些实施方案中，合成可在将组合物与核酸样品和引物混合长达72小时后发生。 本文还公开了用于装配聚合酶链式反应(PCR)的方法，包括向反应容器中添加含有热稳定性DNA聚合酶和PCR抑制剂阻断剂的组合物，其中PCR抑制剂阻断剂以有效地增强装配的PCR对PCR抑制剂的耐受性的量存在；和向反应容器中添加核酸样品和引物。本文还公开了用于通过聚合酶链式反应(PCR)扩增核酸的方法，包括向反应容器中添加含有热稳定性DNA聚合酶和PCR抑制剂阻断剂的组合物，其中PCR抑制剂阻断剂以有效地增强装配的PCR对PCR抑制剂的耐受性的量存在；向反应容器中添加核酸样品和引物；和对核酸样品进行PCR。本文还公开了用于通过聚合酶链式反应(PCR)检测核酸的方法，包括将含有热稳定性DNA聚合酶和PCR抑制剂阻断剂的组合物添加至反应容器中，其中PCR抑制剂阻断剂以有效地增强装配的PCR对PCR抑制剂的耐受性的量存在；向反应容器中添加核酸样品和引物；对核酸样品进行PCR ;和检测扩增的靶。本文还公开了用于阻断PCR抑制剂对聚合酶链式反应(PCR)的抑制的方法，包括向反应容器中添加含有热稳定性DNA聚合酶和PCR抑制剂阻断剂的组合物，其中PCR抑制剂阻断剂以有效地增强装配的PCR对PCR抑制剂的耐受性的量存在，其中组合物阻断PCR抑制剂对PCR的抑制；向反应容器中添加核酸样品和引物；和对核酸样品进行PCR。本文还公开了用于减少PCR抑制剂对聚合酶链式反应(PCR)的运行时间的方法，包括向反应容器中添加含有热稳定性DNA聚合酶和PCR抑制剂阻断剂的组合物，其中PCR抑制剂阻断剂以有效地增强装配的PCR对PCR抑制剂的耐受性的量存在，其中组合物减少PCR的运行时间；向反应容器中添加核酸样品和引物；和对核酸样品进行PCR。上述和其它特征通过下列附图和详细描述来举例说明。附图描述
图1显示了比较使用2X浓度的本文中公开的组合物的实施方案和商业组合物TAQMAN 通用PCR预混合物进行的一组13个TAQMAN 基因表达测定的循环阈值(Ct)的曲线。图2显示来自在Applied Biosystems7500快速实时PCR系统上于ΓΝI TAQMAN .基因表达测定中使用2X浓度的本文中公开的组合物的实施方案在4个重复反应中扩增的人cDNA的系列稀释物的实时PCR的代表性扩增曲线。图3显示作为在终反应物的装配后(A)和在30° C将装配的终反应物温育72小时后(B)，使用2X浓度的本文中公开的组合物的实施方案在B2MTAOMAN 基因表达测定的4个重复反应中扩增的人cDNA的系列稀释物的PCR循环的函数的ARn的曲线。图4，图框A显示了 cDNA的终浓度(ng/μ L)的函数的Ct的曲线，该曲线将使用2Χ浓度的公开的组合物的实施方案进行的系列稀释物的单靶(β_肌动蛋白基因(ACTB)或外源内部阳性对照(IPC)靶)PCR反应TAQMAN 基因表达测定与使用2X浓度的公开的组合物的实施方案进行的系列稀释物的双重靶(ACTB和IPC)PCR反应TAQMAN .基因表达测定相比较。 图4，图框B显示了作为cDNA的终浓度(ng/μ L)的函数的Ct的曲线，该曲线将使用2Χ浓度的公开的组合物的实施方案进行的系列稀释物的单靶(β-肌动蛋白基因(ACTB)或内源内部阳性对照(IPC)靶)PCR反应TAQMAN 基因表达测定与使用要求保护的组合物的实施方案进行的系列稀释物的双重靶(ACTB和IPOPCR反应TACJMAN 基因表达测定相比较。图5显示了作为使用2X浓度的公开的组合物的实施方案在AppliedBiosystems7900H 快速实时 PCR 系统上进行的 Let7_c TAQMAN MicroRNA 测定的4个重复反应的系列稀释物的实时PCR的终核酸浓度的函数的Λ Rn对PCR循环的扩增曲线(上图框)和Ct的标准曲线(下图框)。图6显示了使用2Χ浓度的公开的组合物的实施方案在AppliedBiosystems7300实时PCR系统上进行的FNl TAQMAN 基因表达测定的4个重复实时pcr反应中扩增的人cDNA的系列稀释物的Λ Rn对PCR循环的曲线图。图7Α显示了柱形图，该图显示对于8个存在10-50 μ M的血色素的单重(上图框)或双重(下图框)TAQMAN 基因表达测定测量的ct。图7B显示了柱形图，该图显示了对于8个存在10-50 μ M的血色素的单重和双重(上图框)TAQMAN 基因表达测定测量的dct和对于8个存在10-50 μ M的血色素的双重vie对照TAQMAN 基因表达测定测量的ct。图8显示了柱形图，该图显示在添加剂BSA和鱼胶存在或不存在的情况下，在不存在腐殖酸或存在15ng/20 μ L反应物的腐殖酸的情况下对于2个TAQMAN .基因表达测定测量的平均ct。图9显示了柱形图，该图显示在添加剂BSA和鱼胶存在或不存在的情况下，在肝素不存在和存在O. OIU/μ L的肝素的情况下对于3个TAQMAN 基因表达测定测量的平均Ct。图10显示了单重和双重扩增反应在快速热循环条件下的结果。详述本公开内容总地说来涉及用于检测和/或定量核酸的即可使用的试剂混合物、试剂盒和方法。已开发了具有预料之外的优良性质的改进的组合物。本发明组合物提供了装配的聚合酶链式反应(PCR)预混合物，当所述预混合物在标准PCR仪上运行时与利用标准试剂混合物装配的PCR相比较显示优良的灵敏性、准确性、动态范围和特异性。在一些实施方案中，利用本文中公开的组合物装配的PCR的优良灵敏性允许减少在FAST或标准PCR仪上的PCR运行时间。此外，在一些实施方案中，本文中公开的组合物提供了在室温(例如，23-30° C)下具有长达72小时的极长的稳定性的装配的PCR，该特征有益于高通量液体处理系统的用户获得的结果的准确性。在一些实施方案中，本文中公开的组合物对于许多检测核酸的测定是有用的。例如，组合物可用于用于检测基因表达、miCToRNA(miRNA)表达或基因分型的基于PCR的测定。还公开了包括组合物的试剂盒，同样地包括了使用所述组合物和试剂盒的方法。在一个实施方案中，组合物包含热稳定性DNA聚合酶和PCR抑制剂阻断剂，其中PCR抑制剂阻断剂以有效地增强装配的PCR对PCR抑制剂的耐受性的量存在。在实施方案中，PCR抑制剂阻断剂为蛋白质。适当的蛋白质包括白蛋白和明胶。在一些实施方案中，PCR抑制剂阻断剂选自血清白蛋白、鱼胶或上述物质的组合，其中组分以有效地增强装配的PCR对PCR抑制剂的耐受性的量存在。血清白蛋白可来自任何动物，例如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)。在实施方案中，组合物以这样的浓度包含白蛋白，以便其在装配的PCR(例如，工作溶液)中的浓度为约O. 05mg/mL至约O. 8mg/mL、约O. lmg/mL至约O. 6mg/mL,更特别地约O. 2mg/mL至约O. 4mg/mL,以这样的浓度包含明胶以便其在装配的PCR中的浓度为约O. 05%(w/v)至约O. 8%(w/v),更特别地约O. 2%(w/v)至约O. 4%(w/v)或上述浓度的组合。在另一个实施方案中，PCR抑制剂阻断剂可以是浓度约O. 3mg/mL的白蛋白和浓度约O. 3%(w/v)的明胶。在一个实施方案中，白蛋白为BSA，明胶为鱼胶。在一些实施方案中，本文中使用的热稳定性DNA聚合酶当经历升高的温度，进行实现单链核酸的去稳定作用或在PCR扩增过程中实现双链核酸的变性所必需的时间时，不被不可逆地灭活。酶的不可逆变性是指大体上失去了酶活性。优选地热稳定性DNA聚合酶在例如进行PCR扩增通常所需要的条件下在约90° -100°C下将不会发生不可逆变性。在一些实施方案中，组合物还可包含另外的组分例如甘油、牛明胶、NaN3、缓冲剂、盐、dNTP、表面活性剂和/或一般地任何阳离子、阴离子、两性离子和/或非离子型去垢剂、用于热启动PCR的试剂、使定量实时DNA检测测定的样品间和/或孔间变化最小的被动参考对照和/或尿卩密唳-DNA糖基化酶。组合物还可包含拥挤试剂(crowding agent)例如Ficoll70、糖原和聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，甘油可以以这样的浓度存在于组合物中，以便其在装配的PCR中的浓度为约6至约11%(w/v)，特别地约8. 5%(w/v)。牛明胶可以以这样的浓度存在于组合物中，以便其在装配的PCR中的浓度为约0.3至约0.7%(w/v)，特别地约0.5%(w/v)。NaN3可以以这样的浓度存在于组合物中，以便其在装配的PCR中的浓度为约O. 007至约O. 013%(w/V)，特别地约 0.01% (w/v) 。组合物可包含缓冲剂和/或盐溶液来提供适当的pH和离子条件以维持DNA聚合酶的稳定性。术语"稳定"和"稳定性"，如本文中所用，通常意指在将酶或包含酶的组合物在约室温(例如，约20°C至约25°C )的温度下贮存约3天后，在约4°C的温度下贮存约I周后，在约-20°C的温度下贮存约2至6个月后，以及在约_80°C的温度下贮存约6个月或更长时间后，使组合物例如酶组合物保留至少70%，优选至少80%，最优选至少90%的原始酶活性(以单位表示)。此类缓冲剂的实例可包括例如TRIS、TRICINE、BIS-TRICINE、HEPES、MOPS、TES、TAPS、PIPES和CAPS。此类盐溶液的实例可包括例如氯化钾、醋酸钾、硫酸钾、硫酸铵、氯化铵、醋酸铵、氯化镁、醋酸镁、硫酸镁、氯化锰、醋酸锰、硫酸锰、氯化钠、醋酸钠、氯化锂和醋酸锂。应理解，许多缓冲剂和盐溶液在本领域是已知的，包括例如未在本文中明确公开的那些。 在另一个实施方案中，可以以浓缩原液的形式提供通组合物。如本文中所用，术语"浓缩原液"意指在需要进一步稀释以达到用于进行特定功能(例如核酸的扩增)的溶液的最佳浓度的浓度。如本文中所用，“工作溶液”可用于指具有进行特定功能的最佳浓度的溶液。例如，组合物可以是约2X、约3X、约4X、约5X、约6X、约IOX等的原液。在一些优选实施方案中，组合物可需要高于2X、高于3X、高于4X、高于5X、高于6X、高于IOX等的稀释度以成为用于核酸合成法的工作浓度或最佳浓度。可在组合物中提供dNTP。组合物中包含的每一种dNTP的浓度应当为这样的浓度以便在装配的PCR中获得约O. 15mM至约O. 65mM的dNTP的浓度。包含的dNTP可以是dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP。各个dNTP的浓度不必相同。在实施方案中，dATP、dCTP、dGTP以这样的浓度存在于组合物中以便每一种dNTP在装配的PCR中的浓度为约O. 15至约O. 35mM，特别地约O. 25mM，并且dUTP以这样的浓度存在于组合物中，以便其在装配的PCR中的浓度为约O. 35至约O. 65mM，特别地为O. 5mM。非离子型去垢剂可以为例如TRITON X-100 、NonidetP_40 (NP-40)、TWEEN20 或Bri j35。非离子型去垢剂可以以这样的浓度存在于组合物中以便其在装配的PCR中的浓度为约O. 007至约O. 013%(w/v)，特别地约O. 01%(w/v)。在一些实施方案中，TWEEN-20以这样的浓度存在于组合物中以便其在装配的PCR中的浓度为约O. 007%(w/v)。用于热启动PCR的试剂可以是抗体、适体、发夹型引物或隔离石蜡珠。用于热启动pcr的石蜡珠是商购可得的，例如AmpliWax PCRGemioo和AmpliWax pcrGem50 (Applied Biosystems)。适当的适体的选择可通过本领域已知的方法来进行或可使用商购可得的适体。类似地，适当的发夹型引物的选择可通过本领域已知的方法来进行或可使用商购得的引物。可通过本领域已知的方法产生或选择用于热启动PCR的抗体。或者，可使用商购可得的抗体，例如对于任何Taq-衍生的DNA聚合酶是有效的TaqStart抗体(Clontech)，包括天然、重组和N末端缺失突变体。可通过本领域已知的方法,或对于商业产品按照制造商所推荐的方法确定装配的PCR中用于热启动PCR的试剂的适当浓度。以允许其用作可检测对照的浓度包含使定量实时核酸检测测定的样品间和/或孔间变化减小至最小的被动参考对照。在实施方案中，将参照发色团，特别地荧光基团用作被动参考对照。在实施方案中，参照发色团为染料ROX(InvitiOgen)。可以以这样的浓度将ROX包含在组合物中，以便其在终装配的PCR中的浓度为约40至约80nM，特别地约60nM。可将尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)包含在组合物中。该酶可从许多商业来源例如Invitrogen>EnzymatiCs>New England Biolabs、Genscript 或 USB 商购获得。可将 UNG 以这样的量包含在组合物中，以便其在终装配的PCR中的浓度为约0. 005至约0. 015U/y L，特别地约0. OlU/μ L0在实施方案中，组合物包含热稳定性DNA聚合酶、PCR抑制剂阻断剂的组合、缓冲盐溶液、热启动组分、dNTP、甘油、非离子型去垢剂和被动参照染料。可替换或修饰组分。
在一些实施方案中，当在约-20° C贮存至少5. 5个月时，公开的组合物是稳定的。可将组合物包装在能够保持组合物并且不会与组合物的组分明显相互作用的适当的容器中。容器可以是被设计来允许由个人或由液体操作仪容易地分配剂型的容器。还可将组合物容器包装至多包(mult1-pack)单元中。本文中还公开了包括组合物的试剂盒。试剂盒可进一步包含用于一个或多个测定中以合成、检测或定量核酸的试剂。在实施方案中，除所述组合物外，试剂盒还可包括特异于DNA靶的PCR扩增的引物对以及特异于DNA靶的探针。例如，探针可以是TAQMAN 探针、HydrolEasy 探针、小沟结合(MGB)探针、锁核酸(LNA)探针或循环探针技术(CPT)探针。在另一个实施方案中，试剂盒还可包括对照核酸样品，以及特异于对照核酸样品上的DNA靶的PCR扩增的引物对。还可在试剂盒中包括用于检测扩增的探针。视情况而定，可在各个容器中或单个容器中提供除组合物外的试剂盒的组分。可有利地提供使用试剂盒的说明书和方案。可将公开的组合物和试剂盒用于多种检测或定量核酸的基于PCR的测定。例如，可将组合物用于基因表达测定(例如，TA0MAN 基因表达测定)、miRNA测定(例如，TAQMAN MicroRNA测定)、基因分型测定(例如，TA0MAN 药物代谢基因分型测定或TAQMAN SNP基因分型测定)或RNA定量测定(例如，两步逆转录-聚合酶链式反应测定)和TAQMAN 低密度阵列测定。本文中还公开了使用试剂浓度和试剂盒的方法。在实施方案中，用于装配聚合酶链式反应(PCR)的方法包括将包含热稳定性DNA聚合酶和PCR抑制剂阻断剂的组合物添加至反应容器，其中PCR抑制剂阻断剂以有效地增强装配的PCR对PCR抑制剂的耐受性的量存在；和将核酸样品和引物添加至反应容器中。反应容器的实例包括微量离心管、孔板(wellplate)中的孔、毛细管或微流控芯片。在实施方案中，用于利用聚合酶链式反应(PCR)扩增核酸的方法包括将包含热稳定性DNA聚合酶和PCR抑制剂阻断剂的组合物添加至反应容器，其中PCR抑制剂阻断剂以有效地增强装配的PCR对PCR抑制剂的耐受性的量存在；将核酸样品和引物添加至反应容器中；和对核酸样品进行PCR，其中在将组合物、核酸样品和引物添加至反应容器后长达72小时才进行PCR。在一些实施方案中，用于扩增靶核酸的方法可以是其中同时扩增多个靶的多重PCR扩增。扩增的靶的数目可达到10个靶，特别地达到6个靶，更特别地达到3个靶，更特别地2个靶。在实施方案中，多重化的靶之一是用于扩增的内源或外源内部阳性对照。一般而言，PCR热循环包括在高温下的初始变性步骤，随后是被设计来允许模板变性、引物退火和通过聚合酶进行的退火引物的延伸的重复的系列的温度循环。通常，开始时将样品在约95° C的温度下加热约2至10分钟以使双链DNA样品变性。随后，在每一个循环开始时，取决于样品和使用的仪器类型，将样品变性约10至60秒。变性后，使引物在更低的温度(从约40° C至约60° C)下与靶DNA退火，进行约20至60秒。通常在约60° C至约72° C范围内的温度下进行聚合酶对引物的延伸。用于延伸的时间量将取决于扩增子的大小和用于扩增的酶的类型，并且可通过常规实验容易地确定。此外，可将退火步骤与延伸步骤组合，从而导致两步骤循环。热循环在PCR测定中还可包括另外的温度变动。用于测定的循环次数取决于许多因素，包括使用的引物、存在的样品DNA的量及热循环条件。用于任何测定的循环次数可由本领域技术人员使用常规实验容易地确定。任选地，可在完成热循环后加上终延伸步骤以确保所有扩增产物的合成。在一个实施方案中，使用本文中公开的组合物进行PCR扩增的示例性热循环条件如下UNG步骤(任选的):50°C , 2分钟活化95O ,20 秒(变性:95-970C /1-3 秒)(延伸:60-620C /20-30 秒)x40 个循环 在一个实施方案中，当本文中公开的组合物用于TAQMAN 低密度阵列(TLDA)平台时，推荐在92°C下活化10分钟。可在“标准”PCR仪例如 Applied Biosystems7900HT,7500 和 7300 标准 PCR 系统上，或“快速叩CR 仪例如 Applied BiosystemsStepOne,StepOne Plus、7500 和 7900HT 快速实时PCR系统上进行利用公开的组合物的PCR。核苷酸。如本文中所用，“核苷酸”是指碱基-糖-磷酸组合。“核苷”是指碱基-糖组合。核苷酸是核酸序列(例如DNA和RNA)的单体单位。术语核苷酸包括脱氧核糖核苷和核糖核苷的单、二和三磷酸形式及其衍生物。术语核苷酸具体地包括脱氧核糖核苷三磷酸例如dATP，dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP或其衍生物。此类衍生物包括例如[a S]dATP, 7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP。术语核苷酸，如本文中所用，还指二脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。适用于本发明组合物的核苷酸的实例包括但不限于dUTP，dATP，dTTP, dCTP, dGTP, dITP, 7-脱氮-dGTP, a-硫代-dATP, a-硫代-dTTP, a-硫代-dGTP, a-硫代-dCTP 或其衍生物，其全都可从来源包括Life Technologies (Carlsbad, CA)、NewEnglandBioLabs (Beverly, Mass.)和 Sigma Chemical Company (SaintLouis, Mo.)商购获得。此类dNTP可不被标记，或它们可通过利用本领域已知的方法将其与放射性同位素(例如，3H、14C、32P或35S)、维生素(例如，生物素)、荧光部分(例如，荧光素、罗丹明、德克萨期红或藻红蛋白)、化学发光标记物地高辛(DIG)等偶联来进行可检测地标记。标记dNTP也可例如从 Life Technologies (Carlsbad, CA)或 Sigma ChemicalCompany (Saint Louis, MO)商购获得。在本发明组合物的一些实施方案中，可添加dNTP以在工作溶液中产生约0. 001至约100毫摩尔、约0. 01至约10毫摩尔、约0.1至约I毫摩尔或优选约0. 2至约0. 6毫摩尔的每一种dNTP的终浓度。多核苷酸和寡核苷酸。如本文中所用，“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指合成或生物产生的分子，其包含可通过一个核苷酸的戊糖的3'位与相邻核苷酸的戊糖的5'位之间的磷酸二酯键连接的核苷酸的共价连接的序列。此外，多核苷酸或寡核苷酸可包含修饰的或非天然存在的糖残基(例如，阿拉伯糖)和/或修饰碱基残基。多核苷酸或寡核苷酸还可包括阻止分子与特定蛋白质、酶或底物的相互作用的封闭基团。核酸。如本文中所用，“核酸”包括具有多个天然核苷酸和/或非天然(或“衍生的”)核苷酸单元的化合物。“核酸”还可包括非核苷酸单元，例如肽。“核酸”因而包括化合物例如DNA、RNA、肽核酸、含硫代磷酸酯的核酸、含膦酸酯的核酸等。关于核酸中的单元的数目不存在特别限制，只要核酸包含2个以上的核苷酸、核苷酸衍生物或其组合，特别地5、10、15、25、50、100个或更多个。核酸可包括单链和双链形式，以及完全或部分双链体嵌合体(例如，RNA-DNA、RNA-PNA 或 DNA-PNA)。引物。术语“引物”可指超过一个引物，以及可指寡核苷酸，无论是天然存在(如在纯化的限制酶切降解物中)还是合成产生，所述寡核苷酸当置于其中催化与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下时能够作为沿着互补链的合成的起始点。此类条件包括4种不同的脱氧核糖核苷三磷酸和聚合诱导剂例如DNA聚合酶或逆转录酶在适当的缓冲液(“缓冲液”包括作为辅因子或影响pH、离子强度等的取代物)中的存在和在适当的温度下。引物优选为单链以在扩增中具有最大效率。引物通常为11个碱基或更长，更特别地，引物为17个碱基或更长，虽然取决于需要可使用更短或更长的引物。如本领域技术人员将理解的，寡核苷酸可用作各种延伸、合成或扩增反应的一个或多个引物。如本文中所用，核酸序列的互补序列是指当与核酸序列对齐以便一个序列的5’末端与另一个序列的3’末端配对时处于“反向平行缔合”中的寡核苷酸或多核苷酸。通常不在天然核酸中发现的某些碱基可被包含在本发明的核酸中，包括例如肌苷和7-脱氮鸟嘌呤。互补性不必完美；稳定的双链体可包含错配碱基对或未匹配的碱基对。核酸技术领域的技术人员通过考虑许多变量包括例如寡核苷酸的长度、碱基组成和寡核苷酸的序列、离子强度以及错配碱基对的发生率来经验地确定双链体稳定性。核酸双链体的稳定性通过解链温度(“Tm”)来测量。在指定的条件下特定核酸双链体的Tm为一半碱基对已分离时所处的温度。如本文中所用，“核酸样品”是指用于测试核酸的存在或不存在的样品。可从任意来源获得核酸样品。核酸样品的来源包括但不限于衣服、土壤、皮肤、头发、血液、血清、粪便、奶、唾液、尿和/或其它分泌液体。当提及热稳定性DNA聚合酶时，一个活性单位为在标准引发的DNA合成条件下在30分钟内将10纳摩尔的dNTP掺入酸不溶性物质(即，DNA或RNA)的酶的量。“工作浓度”在本文中用于指为或接近溶液中使用的进行特定功能(例如核酸的扩增、测序或降解)的最佳浓度的试剂的浓度。如本文中所用，术语“稳定”和"稳定性"，通常意指在将酶或包含酶的组合物在约20°C至约25°C的温度下贮存至少4周，在约4°C的温度下贮存I年或在约_20°C的温度下贮存至少2年后，使酶仍然保留至少70%，优选至少80%，最优选至少90%的原始酶促活性(以单位表示)。如本文中所用，术语“靶”、“靶序列”或“靶核酸序列”是指待被扩增、检测或扩增和检测的核酸的区域。靶序列位于用于扩增的两个引物序列之间。组合物还可包括用于检测靶核酸的探针。 各种探针在本领域是已知的，例如(TaqMan 探针(参见，例如，美国专利号5，538，848)、各种茎-环分子信标(参见，例如，美国专利号 6，103, 476 和 5，925，517 以及 Tyagi and Kramer, 1996，NatureBiotechnologyl4:303-308)、无茎或线性信标(参见，例如，W099/21881)、PNA 分子信标 (参见，例如，美国专利号6，355，421和6，593，091)、线性PNA信标(参见，例如，Kubista等人，2001，SPIE4264:53-58)、非-FRET探针(参见，例如，美国专利号 6，150,097)、Sunrise /Amp丨丨fluor 探针(美国专利号 6，548，250)、莖-环双链体Scorpion 探针(参见，例如，Solinas等人，2001，Nucleic AcidsResearch29:E96和美国专利号6，589，743)、凸环探针(参见，例如，美国专利号6，590，091)、假结探针(参见，例如，美国专利号6，589，250)、cyclicons (参见，例如，美国专利号 6，383，752)、MGB Eclipse 探针(EpochBiosciences)、发夹型探针(参见，例如，美国专利号6，596，490)、在例如美国专利号6，485，901;MhIanga等人，2001，Methods25:463-471;ffhitcombe 等人,1999, Nature Biotechnology. 17:804-807;Isacsson 等人，2000，Molecular Cell Probes. 14:321-328;Svanvik 等人，2000，AnalBiochem. 281:26-35;Wolffs 等人，2001，Biotechniques766:769-771;Tsourkas 等人，2002，Nucleic Acids Research. 30:4208-4215; Riccelli 等人，2002，Nucleic AcidsResearch30:4088-4093;Zhang 等人，2002Shangha1. 34:329-332;MaxwelI 等人，2002，J.Am. Chem. Soc. 124:9606-9612;Broude 等人,2002, Trends Biotechnol. 20:249-56;Huang等人，2002，Chem Res. Toxicol. 15: 118-126;和 Yu 等人，2001，J. Am. Chem.Socl4:11155-11161中描述的肽核酸(PNA)照亮(light-up)探针、自我装配纳米颗粒探针和二茂络铁修饰探针。探针可包含报道染料例如6-羧基荧光素(6-FAM)或四氯荧光素(TET)等。检测探针还可包含猝灭剂部分例如四甲基罗丹明(TAMRA)、Black Hole猝灭剂(Biosearch) > Iowa Black (IDT)、QSY 粹灭剂(Molecular Probe)以及 DABSYL 和 DABCEL 石黄酸盐/羧酸盐猝灭剂(Epoch)等。探针还可包含两个探针，其中例如荧光基团在一个探针上，猝灭剂在另一个探针上，其中两个探针一起对靶的杂交猝灭信号，或其对靶的杂交通过荧光的改变来改变信号特征。
在一些实施方案中，按照例如美国专利号6，727，356中描述的方法和原理来设计探针。一些探针可以是基于序列的，例如5’核酸酶探针，一些探针例如呂YBR 绿可以是非序列特异性DNA结合染料。在一些优选实施方案中，检测探针为TaqiVlan 探针(AppliedBiosystems, Foster City,CA)。应理解,许多种可用于本发明的探针在本领域是已知的,包括本文中未明确公开的那些探针。在公开的组合物的一些实施方案中，工作溶液中的终探针浓度可以为约5nM至约750nM 例如约 IOnM 至约 600nM、约 25nM 至约 500nM、约 50nM 至约 400nM、约 75nM 至约 300nM或其间任意数字。在一些示例性实施方案中，探针浓度为约IOOnM至约250nM。本发明的反应混合物可包含能够促进或增强扩增、逆转录和/或两种反应的组合的添加剂(例如，用于促进/增强PCR的试剂)。添加剂可以是有机或无机化合物。适当的添加剂包括多肽以及非多肽添加剂。此类添加剂可包括例如尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)、外源凝集素、大肠杆菌(E. co)单链结合(SSB)蛋白、tRNA、rRNA、7_脱氮-2’ -脱氧鸟苷(dC7GTP)、含硫化合物、含乙酸酯化合物、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、甲酰胺、甜菜碱、氯化四甲胺(TMAC)、聚乙二醇(PEG)、各种表面活性剂和/或去垢剂，包括阴离子、阳离子、两性离子或非离子型去垢剂(例如，TWEEN20、NP-40、Triton X-100)、四氢嘧啶(ectoine)、叠氮化钠、凯松(kathon)和多元醇等等。本领域技术人员将能够鉴定按照本发明组合物、方法和试剂盒使用的其它添加剂。示例性核酸包括DNA和RNA。在一个实施方案中，核酸为分离和/或纯化的核酸。分离或纯化的核酸大体上不含其它组分例如蛋白质、多糖或其它细胞、细菌或病毒组分。在另一个实施方案中，核酸未被分离或纯化。例如，核酸可存在于复杂混合物例如粗制裂解物或完整细胞提取物中。在另一个实施方案中，核酸可原位存在和存在于其正常细胞、细菌或病毒环境内。核酸可获自天然来源，例如多种细胞、组织、器官或生物体(包括病毒)。核酸可获自处于不同发育阶段的细胞、组织、器官或生物体。核酸可获自病毒、原核生物或真核生物。适当的病毒包括疱疹病毒、HIV、流感病毒、Epstein-Barr virus、肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒和类病毒。适当的原核生物包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷菌属(Serraa)、沙门菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、梭菌属(Clostridium)、衣原体属(Chlamydia)、奈瑟球菌属(Neisseria)、密螺旋体属(Treponema)、支原体属(Mycoplasma)、疏螺旋体属(Borrelia)、军团病杆菌属(Legionella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)和链霉菌属(Streptomyces)的种类。适当的真核生物包括真菌(特别地酵母)、植物、原生动物和其它寄生虫，以及动物，包括无脊椎动物例如昆虫(特别地果蝇)、线虫(特别地秀丽隐杆线虫)和脊椎动物例如爬行动物、两栖动物(特别地光滑爪蟾(Xenopus Iaevis))、禽类(特别地鸡)、鱼(特别地鲐(Daniorerio))和哺乳动物(特别地小鼠和人)。核酸还可获自癌细胞和癌前细胞(获自动物包括人)。核酸还可获自细胞培养系，包括转化和非转化的细胞培养系。可从多种来源提取核酸样品。此类来源包括但不限于例如衣服、土壤、纸、金属表面、空气、水、植物部分以及人和/或动物皮肤、头发、血液、血清、粪便、奶、唾液、尿和/或其它分泌液体。
在扩增或合成后，可分离扩增的或合成的核酸以进一步使用或表征。该步骤通常通过按照大小分离扩增的或合成的核酸片段或利用任何物理或生物化学方法包括凝胶电泳、毛细管电泳、层析(包括分筛、亲和力和免疫层析)、密度梯度离心及免疫吸附来实现。示例性方法是利用凝胶电泳分离核酸片段，其提供了大量核酸片段的灵敏性分离的快速高度重现性方法，并且允许直接同时比较几个核酸样品中的片段。在一个实施方案中，按照标准技术例如化学萃取、电洗脱或物理切割从用于鉴定(参见上文)的凝胶取出一个或多个扩增的或合成的核酸片段。随后可将分离的独特的核酸片段插入适用于多种原核(细菌)或真核(酵母、植物或动物包括人和其它哺乳动物)细胞的转染或转化的标准载体，包括表达载体。或者，可进一步表征由所述方法产生的核酸，例如通过测序(即，测定核酸片段的核苷酸序列)，通过下文中描述的方法和在本领域中是标准的其它方法(参见，例如，美国专利号4，962，022和5，498，523，其涉及DNA测序的方法)O还可使用经典测序法例如Sanger链终止法(Sanger, F.,等人Proc. Natl. Acad. Sc1.USA74:5463-5467 (1977))以及 Maxam 和 Gilbert 化学切断法(Maxam, A. M. and Gilbert, W.Proc. Natl. Acad. Sc1. USA74:560-564 (1977))。在一些实施方案中，组合物可包含DNA依赖性DNA聚合酶、用于逆转录的酶(RNA-依赖性DNA聚合酶)和/或两种类型的酶的组合。在一些实施方案中，DNA依赖性DNA聚合酶的组合和/或RNA依赖性DNA聚合酶的组合可存在于本文中公开的组合物中。用于扩增和/或测序的适当的DNA聚合酶包括但不限于嗜热栖热菌(Thermusthermophilus) (Tth) DNA 聚合酶、菌嗜热水生菌(Thermusaquaticus) (Taq) DNA 聚合酶、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoganeopolitana) (Tne)DNA聚合酶、海栖热袍菌(Thermotogamaritima) (Tma)DNA 聚合酶、嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)(Tli 或 VENT )DNA 聚合酶、强烈火球菌(Pyrococcus furiosus) (Pfu)DNA 聚合酶、DEEPVENT DNA 聚合酶、Pyrococcus woosii (Pwo) DNA 聚合酶、Pyrococcus sp K0D2 (KOD)DNA聚合酶、嗜熟脂肪芽抱杆菌(Bacillus sterothermophilus) (Bst)DNA聚合酶、Bacilluscaldophilus (Bca)DNA 聚合酶、嗜热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)(Sac) DNA 聚合酶、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum) (Tac) DNA 聚合酶、黄栖热菌(Thermus flavus) (Tf 1/Tub) DNA 聚合酶、红栖热菌(Thermus ruber) (Tru)DNA聚合酶、布氏栖热菌(Thermus brockianus) (DYNAZYME ) DNA聚合酶、热自参甲烧杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum) (Mth) DNA 聚合酶、分枝杆菌属(Mycobacterium)DNA 聚合酶(Mtb, Mlep)、大肠杆菌(E. co)pol I DNA 聚合酶、Klenow 片段、TOTNA聚合酶、T7DNA聚合酶和通常pol I型DNA聚合酶；其突变体、变体和衍生物以及上述聚合酶的组合。适当的核酸聚合酶可以是嗜温性或嗜热性的，优选为嗜热性的并且具有热稳定性。如本文中所用，术语“热稳定性核酸聚合酶”是指当与例如来自大肠杆菌的核苷酸聚合酶相比较时对热相对稳定并且催化核苷三磷酸的聚合的酶。通常，酶在与靶序列退火的引物的3’末端起始合成，并且将沿着模板以5’方向前进，如果具有5’至3’核酸酶活性，水解间插的退火的探针以释放标记和未标记探针片段，直至合成终止。从嗜热水生菌(Thermusaquaticus) (Taq)分离的代表性热稳定性酶描述于美国专利号4，889，818,在常规PCR中使用其的方法描述于Saiki等人，1988，Science239:487中。适当的嗜温性DNA聚合酶包括DNA聚合酶的Pol I家族(以及其各自的Klenow片段)，其任一种酶可从生物例如大肠杆菌、流感嗜血杆菌(H.1nfluenzae)、耐辐射奇球菌(D. radiodurans)、幽门螺旋菌(H. pylori)、嗜热光合绿曲菌(C. aurantiacus)、普氏立克次体(R. prowazeki1、Tpallidum)、集胞藻(Synechocystis sp·)、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、乳酸乳球菌(L.1actis)、肺炎链球菌(S. pneumoniae)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆 菌(M. leprae)、耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)、细菌卩遼菌体(Bacteriophage) L5、ph1-C31、T7、T3、T5、SPOl、SP02、来自酿酒酵母(S. cerevisiae)MIP-1的线粒体以及真核生物秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇分离而来(Astatke，M.等人，1998，J Mol.Biol. 278，147-165)、从任何来源分离的pol III型DNA聚合酶及其突变体、衍生物或变体等。可用于本发明方法和组合物的优选热稳定性DNA聚合酶包括Taq、Tne、Tma> Pfu、KOD>Tfl、Tth、Stoffel片段、VENT 和DEEPVENT DNA聚合酶及其突变体、变体和衍生物(美国专利号 5，436，149; 4，889，818; 4，965，188; 5，079，352; 5，614，365; 5，374，553; 5，270，179; 5，047，342;5, 512，462;W092/06188;W092/06200;
W096/10640;W097/09451;Barnes, ff. Μ.，Genel12:29-35 (1992) ;Lawyer, F. C.，等人，PCR Meth.Appl. 2:275-287 (1993) ;Flaman, J.-Μ·，等人，Nucl. AcidsRes. 22 (15) : 3259-3260 (1994))。示例性热稳定性聚合酶包括来自Roche MolecularDiagnostics (Pleasanton, CA)的 AmpliTaq 聚合酶。在某些实施方案中，核酸聚合酶具有5’ 一 3’外切核酸酶活性。如本文中所定义，“5’ 一3’核酸酶活性”或“5’至3’核酸酶活性”是指模板特异性核酸聚合酶的活性，包括常规地与一些DNA聚合酶(通过所述聚合酶以顺序方式从寡核苷酸的5’除去核苷酸)相关的5’ 一3’外切核酸酶活性(即，大肠杆菌DNA聚合酶I具有该活性而Klenow片段不具有该活性)，或其中切割发生在离5’末端超过I个磷酸二酯键(核苷酸)上的5’ 一3’内切核酸酶活性，或两者。Taq DNA聚合酶具有DNA合成依赖性链置换5’-3’外切核酸酶活性(参见 Gelfand, “Taq DNA Polymerase，，in PCR Technology!Principles and Applicationsfor DNA Amplification, Erlich, Ed. , Stockton Press, N. Y. (1989),第 2 章)。在溶液中，存在极少(如果有的话)的标记的寡核苷酸的降解。具有DNA聚合酶活性的酶可以例如从Roche MolecularDiagnostics (Pleasanton,CA)> Life Technologies Corp. (CarIsbad,CA)、Perkin-Elmer(Branchburg, NJ)、New England BioLabs(Beverly, MA)或 BoehringerMannheim Biochemicals (Indianapolis, IN)商购获得。或者，可按照本领域技术人员公知的分离和纯化天然蛋白质的标准方法(参见，例如，Houts, G. E.,等人，J.Virol. 29:517(1979))从其天然来源分离聚合酶。此外,此类聚合酶可利用本领域技术人员熟悉的重组 DNA 技术(参见,例如,Kotewicz, M. L.，等人，Nucl. Acids Res. 16:265(1988);美国专利号 5，244，797; W098/47912; Soltis, D. A 和 Skalka, A. M.，Proc. Natl. Acad. Sc1.USA85:3372-3376 (1988))来进行制备。允许进行RT-PCR的实施方案还包括具有逆转录酶活性的酶。具有逆转录酶活性的适当的酶可以是例如逆转录病毒的逆转录酶，例如莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶、劳斯肉瘤病毒(RSV)逆转录酶、人免疫缺陷病毒(HIV)逆转录酶、AMV逆转录酶、RAV逆转录酶、MAV逆转录酶、ASLV逆转录酶以及慢病毒逆转录酶，或其具有逆转录酶活性的相应的突变体、变体或衍生物。如本文中所用，“突变体、变体或衍生物”是指可存在或产生的化学种类的所有变换，其仍然保留该化学种类的确定的化学活性。用于本发明的一些优选酶为RNA酶H+酶的酶，例如RNA酶H+M-MLV或RNA酶H+AMV逆转录酶。或者，本发明组合物中使用的逆转录酶可具有减小的，显著减小的或消除的RNA酶H活性(参见，例如，美国专利号7，078, 208，将其公开内容通过引用整体并入本 文)。RNA酶H为特异于RNA-DNA嵌合体的RNA链的前进性5’和3’核糖核酸酶(Perbal, A Practical Guide to MolecularCloning, New York: Wiley&Sons (1984))。RNA酶H活性可通过许多测定例如在例如美国专利号 5，244，797 中，Kotewicz, M. L.，等人，Nucl. Acids Res. 16:265(1988)中和 Gerard, G.F.，等人，FO⑶S14 (5) :91(1992)中描述的那些测定来进行测定。所述逆转录酶与天然存在的逆转录酶相比较可包含许多突变。例如，可修饰逆转录酶以包含提供增强的逆转录酶稳定性和/或功能性的突变。适当的酶还可包括其中末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性已被减小，显著减小或消除的酶。显示此类增强的或减弱的功能性的逆转录酶描述于例如美国专利号7，056，716和7，078，208 (将所专利的公开内容通过引用整体并入本文)中。在一些实施方案中，反应混合物还包含至少一种PCR抑制剂阻断剂，其帮助克服多种通常在用于核酸制备和/或分离的样品中发现的抑制剂化合物对PCR反应的抑制。此类抑制剂包括例如肝素(血液)；血色素(血液)；EDTA (血液)；柠檬酸盐(血液)；免疫球蛋白G (血液，血清)；腐殖酸(土壤，粪便)；乳铁蛋白(牛奶、唾液、其它分泌液体)；尿素(尿)；植物多糖(植物)；黑色素(皮肤、头发)；肌红蛋白(组织)；和靛青染料(纺织品)°
适当的PCR抑制剂阻断剂包括蛋白质例如但不限白蛋白(例如，牛血清白蛋白(BSA)和重组BSA))、明胶(例如，牛明胶和鱼胶)和/或其肽或多肽变体、片段或衍生物。用作PCR抑制剂阻断剂的示例性蛋白质包括牛血清白蛋白(BSA)和鱼胶。PCR抑制剂阻断剂可包括PCR抑制剂阻断剂的组合。PCR抑制剂阻断剂的示例性组合是BSA和鱼胶.我们已发现BSA和鱼胶单独地和组合地在减弱由至少腐殖酸、血色素和/或肝素引起的PCR抑制中是有效的。在一些实施方案中，PCR抑制的该减弱由更低的Ct值显示。如本文中所用，术语“Ct”或“Ct值”是指循环阈值并且表示其中来自报道分子的表示扩增子产生的信号(例如，荧光)最早变得高于本底水平而可被检测的PCR扩增测定的循环。在一些实施方案中，循环阈值或“Ct”为PCR扩增变成指数扩增时的循环数。在一个实施方案中，来自报道分子的信号例如荧光被描述为ARn。如本文中所用，术语“dRn”或“ARn”是指标准化报道分子信号(Rn)与本底信号(基线)之差(然后其通过被动参考信号被标准化)。Λ Rn可利用式[Rn+-RrT来测定，其中Rn+是包括所有组分(包括模板)的反应的Rn值，RrT是未反应的样品的值。 根据不同的实施方案，可使用PCR曲线的导数来测定Ct值。例如，可对PCR曲线进行一阶、二阶或η阶导数法以测定Ct值。在不同的实施方案中，导数的特征可用于测定Ct值。此类特征可包括但不限于二阶导数的正拐点(positive inf lection)、二阶导数的负拐点(negative inf lection)、二阶导数的零交叉或一阶导数的正拐点。在不同的实施方案中，可使用阈值和基线法(thresholding and baselining method)来测定Ct值。例如,可使用导数法来确定PCR曲线的指数期的上限，可测定PCR曲线的基线来确定PCR曲线的指数期的下限。根据PCR曲线的上限和下限，可确定阈值以从其测定Ct值。用于测定Ct值的其它方法在本领域是已知的，例如但不限于拟合点法(fit point method)的各种实施方案以及反曲法(sigmoidal method)的各种实施方案(参见,例如,美国专利号6，303，305;6，503，720; 6，783，934; 7，228，237和美国申请公布No. 2004/0096819;将所述专利和申请公布的公开内容通过引用整体并入本文)。此外，我们已发现使用的BSA的浓度越高，反应对血色素和腐殖酸抑制越耐受。然而，随着BSA的量不断增加，我们还确定dRn减小并且基线值(或本底信号)增加。如本文中所用，术语“dRn”或“ARn”是指标准化的报道分子信号(Rn)与本底信号(基线)之差(然后其通过被动参考信号被标准化)。Λ Rn可利用式[Rn+-RrT来测定，其中Rn+是包括所有组分(包括模板)的反应的Rn值，Rn-是未反应的样品的值。令人惊讶地，通过使用此类组合的PCR抑制剂阻断剂，例如鱼胶和BSA，我们观察到抑制剂耐受性的水平得到大大增强。因此，PCR抑制剂阻断剂(包括但不限于鱼胶和BSA或其组合)的添加在减轻通常在用于核酸分析的样品中发现的多种PCR抑制剂的抑制中是有效的。可将PCR抑制剂阻断化合物或试剂添加至本发明组合物以在工作溶液中产生0. 05mg/mL 至约 0. 8mg/mL、约 0. lmg/mL 至约 0. 6mg/mL,更特别约 0. 2mg/mL 至约 0. 4mg/mT,的浓度。还可以以例如约0. 05% (w/V)至约0. 8%(w/v)、约0. 2%(w/v)至约0. 4%(w/v),更特别地约0. 2%(w/v)至约0. 4%(w/v)的百分比终浓度添加PCR抑制剂阻断剂。在一些方面，PCR抑制剂阻断剂可使此类PCR抑制剂导致的PCR抑制的量与在不存在此类PCR抑制剂阻断剂的情况下观察到的抑制水平相比较减少至少I至100%。例如，抑制可被减小至少约1%、约2%、约5%、约10%、约20%、约50%、约75%、约100%或其间的任意百分数。此外我们已发现本发明组合物减少PCR的总运行时间。例如，总PCR运行时间与利用商购可得的预混合物的等同PCR相比较，可被减少至少约5%、约10%、约20%、约50%、约75%、约100%或其间任意百分比。可在PCR过程中发生的不期望的扩增反应通常在反应混合物的装配过程中开始，或当热循环仪正被加热至初始变性温度时发生。这些假反应可通过进行“热启动子”扩增来减小至最低程度。一般地，热启动技术限制必需反应组分的可用性直至升高的温度(通常高于60° C)。存在用于进行热启动的几种方法，包括手工技术、屏障、可逆的聚合酶失活和专门设计的发夹型引物。手工热启动法需要研究人员扣留关键组分，通常镁或聚合酶，直至反应物已被加热。随后添加被扣留的组分以起始反应。第二方法使用物理屏障(例如，石蜡)来将关键组分与模板和引物分隔。美国专利号5，565，339描述了使用石蜡屏障以在试管中将各种PCR试剂彼此隔开。美国专利号5，413，924描述了使用石蜡珠粒来隔离DNA聚合酶。热启动扩增的第三方法是可逆的聚合酶失活。将聚合酶与结合聚合酶的核苷酸结合结构域的抗体或寡核苷酸适体反应，从而使得聚合酶失活。例如，将针对Taq聚合酶的单克隆抗体例如可从Sigma获得的抗-TaqDNA聚合酶抗体引入反应混合物。在加热后，化合物与聚合酶解离，从而恢复酶活性。在另一个实例中，美国专利号5，677，152描述了其中化学修饰DNA聚合酶以确保其仅在升高的温度下变得具有活性的方法。实现热启动扩增的另一个方法是设计将自我退火以形成特殊发夹结构的引物。发夹型引物在以发夹构象存在时不能与靶核酸退火。发夹型引物将在被加热至变性温度之前保持发夹构象。然而，如果发夹结构包括单链延伸，则发夹结构本身类似对模板退火的引物，并且可导致链延伸。如本文中所用，术语“退火”和“杂交”可互换使用并且意指导致双链体、三链体或其它高级结构的形成的一个核酸与另一个核酸的互补碱基配对相互作用。在一些实施方案中，一级相互作用是通过沃尔森/克里克和Hoogsteen型氢键合产生的碱基特异性，例如A/T和G/C。在一些实施方案中，碱基堆积和疏水性相互作用也促成了双链体的稳定性。用于将核酸探针和引物与互补及大体上互补的靶序列杂交的条件也是公知的，例如如Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, B. Hames 和 S. Higgins, eds.，IRLPress, Washington, D. C. (1985) and J. Wetmur and N. Davidson, Mol. Biol. 31:349et seq.(1968)中描述的。一般而言，此类退火是否发生受到除其它以外，探针和互补靶序列的长度、pH、温度、单价和二价阳离子的存在、杂交区域中G与C核苷酸的比例、介质的粘度以及变性剂的存在的影响。此类变量影响杂交所需的时间。因此，优选退火条件将取决于具体应用。然而，此类条件可由本领域技术人员常规地确定而无需过度实验。此外，一般而言，本发明的探针和引物被设计来与靶序列互补，以便靶与探针或引物的杂交发生。然而，应理解，该互补性不必是完全的；可存在任何数目的碱基对错配，其将干扰靶序列与本教导的单链核酸之间的杂交。然而，如果碱基对错配的数目是如此之大以致于在甚至最低的杂交严格度条件下杂交都不能发生，则序列与靶序列不互补。因此，本文中提及的“大体上互补”意指探针或引物与靶序列充分互补以在选择的反应条件下杂交。
术语“标记”，如本文中所用，是指可用于提供可检测的信号并且可被连接至核酸或蛋白质的任意原子或分子。标记可提供可通过荧光、放射性、比色法、重力分析法、X射线衍射或吸收、磁性、酶促活性等检测的信号。在一些实施方案中，可检测信号为可定量的信号。例如，标记可以是任何部分，其(i)提供可检测的信号；(ii)与第二标记相互作用以修饰由第一或第二标记提供的可检测信号；或(iii)赋予捕获功能，例如，疏水性亲和力、抗体/抗原、离子型络合(ioniccomplexation)。本领域技术人员将理解,可将许多不同种类的报道标记单独地或与一种或多种不同的标记组合地用于本教导。示例性标记包括但不限于荧光基团、放射性同位素、量子点、发色团、酶、抗原包括但不限于附加表位、重金属、染料、磷光基团、化学发光基团、电化学检测部分、亲和标记物、结合蛋白、磷光体(phosphors)、稀土螯合剂、近红外线染料包括但不限于“Cy. 7. SPh. NCS”、“Cy. 7. OphEt.NCS”、“Cy7. OphEt. C02Su” 和 IRD800(参见，例如，J. Flanagan 等人，Bioconjug.Chem. 8:751-56 (1997);和 DNA Synthesis with IRD800Phosphoramidite, L1-COR Bulletin#lll,L1-C0R, Inc.，Lincoln, NE)、电化学荧光标记，包括但不限于三(联吡啶)钌(II)，也称为Ru(bpy)32+、Os (I, 10-菲咯啉)2双(二苯基膦基)乙烷2+，也称为Os (phen) 2 (dppene) 2+、鲁米诺/过氧化氢、Al (轻基喹啉_5_磺酸)、9，10- 二苯基蒽-2-磺酸酯和三(4-乙烯基-4'-甲基-2,2'-联吡啶)钌(II)，也称为Ru(v-bpy32+)等。突光报道分子一粹灭剂分子对已被掺入寡核苷酸探针中以监测基于突光报道分子与猝灭剂分子被分离或拉近至彼此的最小猝灭距离内的生物学事件。例如，已开发了其中报道分子荧光的强度因报道分子与猝灭分子的分离而增加的探针。还已开发了其中其荧光的丧失是因为猝灭分子被拉至与报道分子靠近的探针。此类报道分子-猝灭剂分子对探针已被用于通过监测由报道分子产生的荧光的出现或消失来监测杂交测定和核酸扩增反应，特别地聚合酶链式反应(PCR)。(例如，参见美国专利号6，030, 787)。示例性报道分子-猝灭剂对可选自吨染料包括荧光素和罗丹明染料。此类化合物的许多适当形式可广泛地商购获得，所述形式在其苯基部分上具有可用作结合的位点或用作至寡核苷酸的连接的键合功能性的位点的取代基。另一组荧光化合物为在α和β位具有氨基的萘胺。包括在此类萘胺化合物中的是包括1-二甲基氨基萘基-5-磺酸盐、1-苯胺基-8-萘磺酸盐和2-对甲苯胺基-6-萘磺酸盐。其它类型包括3-苯基-7-香豆素异氰酸酯、吖啶例如9-异硫氰酸吖啶和吖啶橙；N-(P-(2-苯丙噁唑基)苯基)马来酰亚胺；苯并氧二唑、芪类、芘类等。
优选地，报道分子与猝灭剂分子选自荧光素和罗丹明染料。此类染料和用于至寡核苷酸的连接的适当连接方法描述于许多参考资料中，例如Khanna等人(citedabove);Marshall, Histochemical J.，7:299-303(1975);Menchen 等人，美国专利号5，188，934;Menchen等人，欧洲专利申请87310256. O;和Bergot等人，国际申请PCT/US90/05565。在另一个实施方案中，反应混合物可存在于用于扩增核酸分子的试剂盒中。根据该实施方案的试剂盒包括将容器例如小瓶、管、安瓿、板、瓶子等封装在其中的运载工具例如箱载体例如箱、硬纸盒、管等。当在试剂盒(例如，DNA聚合酶和逆转录酶)中包括超过一种DNA聚合酶时，可将聚合酶作为两种或更多种(例如，2、3、4、5种等)逆转录酶的混合物装在单个容器中或装在单独的容器中。本发明的试剂盒还可包括(在相同或单独的容器中)适当的缓冲液、核苷酸、PCR抑制剂阻断剂、探针和/或引物。在一些实施方案中，将DNA聚合酶、PCR抑制剂阻断剂、核苷酸和缓冲液组合在单个管或容器中。在另一个方面，试剂盒可包括用于核酸合成的组合物。可将此类组合物配制为浓缩原液(例如，2X、3X、4X、5X、6X等)。在一些实施方案中，可将组合物在单个管或容器中配制为浓缩原液，包含DNA聚合酶。在一些优选实施方案中，此类浓缩原液还可在缓冲液中包含PCR抑制剂阻断剂、核苷酸、热启动组分和/或被动参考染料。在一些其它实施方案中，此类缓冲液可包含甘油、DMS0、Mg2+和/或去垢剂(例如TWEEN20或NP-40)。下列非限定性实施例进一步举例说明本文中描述的各种实施方案。
实施例实施例1.示例性组合物.将示例性组合物配制为2倍浓缩原液，其包含热稳定性DNA聚合酶、包含BSA和鱼胶的PCR抑制剂阻断剂的组合、缓冲盐溶液、热启动组分、dNTP、甘油、非离子型去垢剂和被动参考染料。在如下文实施例中描述的许多测定中测试示例性PCR组合物。实施例2.利用示例性组合物的PCR的优良灵敏性、准确性、动力学范围和特异性将实施例1的PCR组合物在一组13个TAQMAN 基因表达PCR测定中的性能与商购可得的组合物TAQMAN 通用PCR预混合物(MM;Life Technologies, Inc.)的性能相比较。按照制造商的关于测定法和MM的说明书进行测定，但在一组测定中用示例性组合物替换MM。单个装配的20 μ L PCR包含下列组分正向PCR 引物(18 μ Μ)反向PCR 引物(18 μ Μ)TAQMAN 探针(5 μ Μ)核酸样品(10至IOOng)TAQMAN 通用pcr预混合物或实施例1的组合物( ο μ L)， 不含RNA酶的水至20 μ L的总PCR体积对于测试13个TAQMAN 基因表达pcr测定的每一个，正向pcr引物、反向pcr引物和TAQMAN 探针为TAQMAN .基因表达测定混合物(20X)的组分。按照下列方面选择用于进行测定组的PCR扩增的热循环条件UNG步骤(任选的)50°C，2分钟活化95°C，20秒(变性:95-970C /1-3 秒;延伸60-620C /20-30 秒)x40 个循环使用实施例1的组合物或商业MM在标准PCR仪上对每一个测定确定的阈值循环数(Ct)示于图1。对于大多数测定，使用示例性组合物测定到比利用商业浓缩物测定到的Ct值更小的Ct值，这表明所述组合物比商购可得的浓缩物更灵敏。使用示例性组合物进行的PCR测定的大动态范围示于图2中，其显示了来自在Applied Biosystems7500快速实时PCR系统上，于FNl TAQiVlAN 基因表达测定中使用所述试剂的2倍浓缩物的实施方案在4个重复反应中扩增的人cDNA的系列稀释物的实时PCR的代表性扩增曲线。
使用各自推荐的方案和核酸样品，将示例性组合物在一组TAQMAN 基因表达测定中的动态范围与几种商购可得的试剂混合物的动态范围相比较。该比较的结果示于下面表2中。在表2中，显示了每一个试剂混合物的检测限值(LOD)的对数。检测到的对数具有85-115%的PCR效率和大于O. 98的R2值。对于每一种试剂混合物在AppliedBiosystems7900HT快速实时PCR系统上运行6个重复反应。表2.示例性组合物与商购可得的试剂混合物之间比较的测定动态范围
权利要求
1.聚合酶链式反应(PCR)组合物，其包含热稳定性DNA聚合酶；和 PCR抑制剂阻断剂，其中所述PCR抑制剂阻断剂以有效地增强装配的PCR对PCR抑制剂的耐受性的量存
2.权利要求1的组合物，其中所述PCR抑制剂阻断剂为蛋白质。
3.权利要求1的组合物，其中所述PCR抑制剂阻断剂为白蛋白、明胶或其组合。
4.权利要求1的组合物，其中所述PCR抑制剂阻断剂为牛血清白蛋白、鱼胶或其组合。
5. 权利要求1的组合物，其中达到50 μ M血色素在装配的PCR中被耐受。
6.权利要求1的组合物，其中达到15ng的腐殖酸/20 μ L反应体积在装配的PCR中被耐受。
7.权利要求1的组合物,其中达到O.OlU/μ L肝素在装配的PCR中被耐受。
8.上述权利要求的任一项的组合物，其还包含非离子型去垢剂。
9.权利要求8的组合物，其中所述非离子型去垢剂选自TRITONΧ-100⑧、Nonidet P-40(NP-40)、Tween20 和 Brij35。
10.权利要求1的组合物，其中所述组合物在室温下稳定达48小时。
11.权利要求10的组合物，其中所述组合物在室温下稳定达约72小时。
12.权利要求1的组合物，其中所述热稳定性DNA聚合酶选自TaqDNA聚合酶、Tne DNA 聚合酶、Tma DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶、VENT DNA聚合酶、DEEPVENT DNA 聚合酶、其突变体或衍生物以及上述酶的组合。
13.权利要求1的组合物，其中所述热稳定性DNA聚合酶的浓度为约100至约500个单位/晕升。
14.权利要求1的组合物，其还包含用于热启动PCR的试剂。
15.权利要求14的组合物，其中所述试剂为抗体、适体、发夹型引物或隔离石蜡珠。
16.权利要求1的组合物，其还包含一种或多种脱氧核苷三磷酸。
17.权利要求1的组合物，其还包含尿嘧啶DNA糖基化酶。
18.权利要求1的组合物，其还包含被动参考对照。
19.权利要求1的组合物，其中所述组合物是浓缩原液。
20.权利要求1的组合物,进一步包含甘油。
21.
22.权利要求1的组合物，其中对于相同量的模板，所述组合物的检测限度比商购可得的PCR试剂混合物低至少一个对数。
23.权利要求22的组合物，其中对于相同量的模板，所述组合物的检测限度比商购可得的PCR试剂混合物低至少两个对数。
24.权利要求1的组合物，其中对于相同量的模板，所述组合物在PCR中产生的阈值Ct 低于使用商购可得的PCR试剂混合物获得的Ct。
25.包含权利要求1的组合物的试剂盒，其还包含对照核酸样品和特异于对照核酸样品中的DNA靶的PCR扩增的引物对。
26.权利要求25的试剂盒，进一步包含引物和探针。
27.用于进行核酸合成的方法，包括向反应容器中添加权利要求1的组合物； 向反应容器中添加核酸样品和引物；和 使用核酸样品作为模板合成核酸。
28.用于装配聚合酶链式反应(PCR)的方法，包括 向反应容器中添加权利要求1的组合物；和 向反应容器中添加核酸样品和引物。
29.权利要求28的方法，进一步包括对核酸样品进行PCR。
30.用于通过聚合酶链式反应(PCR)扩增核酸的方法，包括 向反应容器中添加权利要求1的组合物； 向反应容器中添加核酸样品和引物；和 对核酸样品进行PCR。
31.用于通过通过聚合酶链式反应(PCR)检测核酸的方法，包括 向反应容器中添加权利要求1的组合物； 向反应容器中添加核酸样品和引物； 对核酸样品进行PCR ;和 检测扩增的靶。
32.用于阻断PCR抑制剂对聚合酶链式反应(PCR)的抑制的方法，包括 向反应容器中添加权利要求1的组合物，其中所述组合物阻断PCR抑制剂对PCR的抑制； 向反应容器中添加核酸样品和引物；和 对核酸样品进行PCR。
33.减少PCR抑制剂对聚合酶链式反应(PCR)的运行时间的方法，包括 向反应容器中添加权利要求1的组合物，其中所述组合物减少PCR的运行时间； 向反应容器中添加核酸样品和引物；和 对核酸样品进行PCR。
34.权利要求27的方法，其中所述PCR为单重PCR。
35.权利要求27的方法，其中所述PCR为多重PCR。
36.权利要求35的方法，其中所述多重PCR包括阳性对照。
37.权利要求27的方法，其中所述核酸样品包含PCR抑制剂。
38.权利要求27的方法，其中所述核酸样品获自包含PCR抑制剂的来源。
39.权利要求37的方法，其中所述PCR抑制剂选自血色素、腐殖酸、肝素，或其组合。
40.权利要求27的方法，其中在向反应容器中添加组合物、核酸样品和引物后达72小时时进行合成。
41.权利要求27的方法，其中模板以O.OOOOlng/μ I存在。
42.权利要求27的方法，其中对于相同量的模板，检测限值比使用不含PCR抑制剂阻断剂的PCR混合物的方法低至少一个对数。
43.权利要求42的方法，其中对于相同量的模板，检测限值比使用不含PCR抑制剂阻断剂的PCR混合物的方法低至少两个对数。
44.权利要求27的方法，其中对于相同量的模板，阈值Ct比使用不含PCR抑制剂阻断剂的PCR混合物的方法低 。
全文摘要
包含热稳定性DNA聚合酶和PCR抑制剂阻断剂的组合物，其中PCR抑制剂阻断剂以有效地增强装配的PCR对PCR抑制剂的耐受性的量存在。
文档编号C12N15/10GK103038367SQ201180037906
公开日2013年4月10日 申请日期2011年6月21日 优先权日2010年6月21日
发明者C·特里恩, T·徐, 施雅婷, F·N·勒, C·马约里班克斯 申请人:生命技术公司