专利名称：新型酶蛋白、该酶蛋白的制造方法和编码该酶蛋白的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及实质上不具有神经氨酸酶活性而具有P -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质、编码该酶蛋白的核酸、和使用利用编码该蛋白质的基因转化的微生物制造该酶的方法。
背景技术：
糖链是指由各种糖、例如半乳糖或N-乙酰基葡糖胺等单糖构成的化合物。糖蛋白或糖脂质等糖链(以下，也称为复合糖糖链)在生物体内具有非常重要的功能。根据目前为止的研究，可以认为在糖链中尤其是含有称为唾液酸的单糖的糖链表现出重要的功能。例如，主要在哺乳类细胞中，含有唾液酸的糖链是发挥分化和发育中的细胞间和细胞-细胞外基质间的信号传导或作为复合糖的标签的功能的重要分子，含有唾液酸的复合糖与脑和神经细胞中的突触形成、神经发育进而学习能力的提高表现出密切关系。唾液酸是神经氨酸的酰基衍生物的总称，是其结构中具有羧基的酸性单糖的一种。目前为止确认了 50种以上的分子种类，它们主要在哺乳动物、棘皮动物和细菌等中被发现。作为目前为止已知的代表性的唾液酸，可以列举N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)、脱氨基神经氨酸(KDN)。在这些唾液酸之中，通常在人的机体内可以识别的唾液酸仅为N-乙酰神经氨酸。作为特殊的例子，已知在一部分癌化的细胞中存在N-羟乙酰神经氨酸。生物体内存在的糖蛋白或糖脂质等复合糖糖链中所发现的唾液酸，通过称为唾液酸转移酶的一类糖转移酶，被转移至作为糖受体底物的各糖链中。更具体而言，唾液酸转移酶将唾液酸从作为其共通的糖供体底物的CMP-唾液酸转移至各种糖受体底物。另一方面，在生物体内，存在催化使存在于复合糖糖链的非还原末端的唾液酸残基游离并反应的酶即神经氨酸酶(唾液酸酶)。目前为止从动物、微生物、病毒等中发现了多种神经氨酸酶蛋白，此外，还克隆 了编码神经氨酸酶蛋白的基因。作为主要的唾液酸的结合方式，已知有a 2，3结合、a 2，6结合、a 2，8结合三种，但目前为止所报告的神经氨酸酶，除了少数半选择性地切断结合方式为a 2，3结合或a 2，6结合的唾液酸的神经氨酸酶以外，几乎都为与唾液酸的结合方式无关的、通过含有唾液酸的复合糖糖链来切断唾液酸的情况。如上所述，生物体内存在的含有唾液酸的复合糖糖链在生物体内具有非常重要的功能。这里，为了研究含有唾液酸的糖蛋白或糖脂质等的详细的功能、或制备应用了这些功能的生理活性物质等，上述的唾液酸转移酶是需求高的酶之一。目前为止所报告的唾液酸转移酶分成几类，但多报告为源自动物、特别是源自哺乳类的酶(Hamamoto, T.等人，Bioorg. Med. Chem. , I, 141-145 (1993) ;ffeinstein, J.等人，J. Biol. Chem.，262，17735-17743 (1987))。但是，这些源自动物的酶的糖受体底物特异性极高，在生物体内能够转移唾液酸的糖链结构是有限的。即，唾液酸转移酶的反应结果、生成的糖蛋白、糖脂质极为受限。另一方面，作为源自细菌的唾液酸转移酶及其基因，报告有从属于美人鱼发光杆菌(Photobacteriumdamselae)的微生物中所分离的基因(国际公开第W098/38315号；美国专利6255094 号公报、Yamamoto, T.等人，J. Biochem.，120，104-110(1996)、Tsukamoto, H.等人，J. Biol. Chem.，28229794-29802 (2007) ;Takakura, Y.等人，J. Biochem.(Tokyo) 142403-412 (2007))。这些源自微生物的唾液酸转移酶，与上述源自动物的酶相比较，糖受体底物特异性极广，即使对在源自动物的唾液酸转移酶中不能转移唾液酸的糖链，也显示能够转移唾液酸。因此，在需求高的唾液酸转移酶中，源自微生物的唾液酸转移酶、它们之中源自海洋性细菌的唾液酸转移酶成为需求特别高的酶。但是，表明目前为止已知的众多源自海洋性细菌的唾液酸转移酶为兼具有唾液酸转移酶活性和神经氨酸酶活性的酶蛋白(Tsukamoto, H.等人，J. Biol. Chem.，28229794-29802 (2007) ;Takakura, Y.等人，J. Biochem.(Tokyo) 142403-412(2007))。本发明的发明人从属于弧菌科发光杆菌属(Photobacterium)、或弧菌科弧菌属(Vibrio)的微生物的菌株中，发现了生产P _半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶活性的菌株(发光杆菌属菌株(Photobacterium sp. ) JT_ISH_224株、明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum) JT-1SH-467株等)(国际公开第W02006/112253号)。而且，表明这些酶都为兼具有唾液酸转移酶活性和神经氨酸酶活性的酶(Tsukamoto, H.等人，J. Biol. Chem.，28229794-29802 (2007))。在利用这样具有唾液酸转移酶活性和神经氨酸酶活性两者的酶时，若进行长时间的酶反应，反应体系内的反应产物即含唾液酸化合物浓度上升，则担心它们会成为神经氨酸酶的底物而从反应产物中水解掉唾液酸。因此，需要保持源自海洋性细菌的酶的优点并且使神经氨酸酶活性减少的唾液酸转移酶及其基因。现有技术文献 专利文献专利文献1:国际公开第W098/38315号小册子专利文献2 :美国专利6255094号公报专利文献3 :国际公开第W02006/112253号小册子非专利文献非专利文献I Hamamo to, T.等人，Bioorg. Med. Chem. , I, 141-145 (1993)非专利文献2 ffeinstein, J.等人，J. Biol. Chem.，262，17735-17743 (1987)非专利文献3 Yamamoto, T.等人，J. Biochem. , 120, 104-110 (1996)非专利文献4 Tsukamoto, H.等人，J. Biol. Chem.，28229794-29802 (2007)非专利文献5 :Takakura, Y.等人，J. Biochem. (Tokyo) 142403-412 (2007)
发明内容
发明要解决的问题本发明的目的在于使源自属于弧菌科发光杆菌属微生物的、具有￠-半乳糖苷- a 2，3-唾液酸转移酶活性的酶蛋白所具有的神经氨酸酶活性失活、或者大幅减少。另夕卜，本发明的目的在于提供实质上不具有神经氨酸酶活性的、源自属于弧菌科发光杆菌属微生物的具有P -半乳糖苷_a 2，3-唾液酸转移酶活性的酶蛋白、以及编码该酶蛋白的核酸。
解决问题的方法发明人等从属于弧菌科发光杆菌属(Photobacterium)的微生物明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)中发现了生产P -半乳糖苷-a 2, 3_唾液酸转移酶活性的菌株(JT-1SH-467株)，并解析了该酶的各项性质(W02006/112253)。并且，表明该酶为兼具有唾液酸转移酶活性和神经氨酸酶活性的酶(非专利文献4)。随后，发明人等进行深入研究，发现了使源自明亮发光杆菌JT-1SH-467株的 半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶(SEQ ID N0:4)的第342位的谷氨酸(该氨基酸相
当于SEQ ID N0:2中的第319位的谷氨酸)变异得到的修饰型酶蛋白显示￠-半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶活性，且不显示神经氨酸酶活性，从而完成了本发明。本发明提供实质上不具有神经氨酸酶活性的新型的3 -半乳糖苷- a 2，3-唾液酸转移酶蛋白、编码该蛋白质的核酸以及制造该蛋白质的方法。S卩，本发明如下所述。
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方式1:一种P -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶蛋白，该蛋白质实质上不具有神经氨酸酶活性，并且包含选自以下的氨基酸序列(a)在SEQ ID NO: 2的氨基酸2-386位中，SEQ ID NO: 2的第319位的谷氨酸残基取代为谷氨酸以外的氨基酸的氨基酸序列；(b)在SEQ ID NO: 2的氨基酸2-386位中，含有一个或多个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，在该氨基酸序列中，至少与SEQ ID N0:2的第319位的谷氨酸残基对应的氨基酸残基取代为谷氨酸以外的氨基酸；(c)与SEQ ID NO: 2的氨基酸2_386位具有80%以上的同一性的氨基酸序列，在该氨基酸序列中，至少与SEQ ID NO:2的第319位的谷氨酸残基对应的氨基酸残基取代为谷氨酸以外的氨基酸；和(d)通过与SEQ ID NO:1的核苷酸4-1158位的互补链在严谨的条件下杂交的碱基序列所编码的氨基酸序列，在该碱基序列中，至少与SEQ ID NO:1的第955-957位的碱基序列对应的密码子变化为编码谷氨酸以外的氨基酸的密码子。方式2 :方式I所述的蛋白质，其中，氨基酸序列为在权利要求1的(a)-(d)中所规定的氨基酸序列的N末端侧还具有甲硫氨酸、SEQ ID N0:4的氨基酸1_24位或信号肽的氨基酸序列。方式3 :方式I或2所述的蛋白质，其中，SEQ ID NO:2的第319位的谷氨酸残基或与SEQ ID NO: 2的第319位的谷氨酸残基对应的氨基酸残基取代为中性氨基酸残基或碱性
氣基酸残基。方式4:方式I或2所述的蛋白质，其中，SEQ ID NO:2的第319位的谷氨酸残基或与SEQ ID NO:2的第319位的谷氨酸残基对应的氨基酸残基取代为中性氨基酸残基。方式5 :方式广4中任一项所述的蛋白质，其满足选自以下an)中的一个至全部的条件a) SEQ ID NO: 2的第123位的或与SEQ ID NO: 2的第123位对应的酪氨酸残基未被改变、或者被取代为色氨酸或苯丙氨酸；b)SEQ ID NO: 2的第124位的或与SEQ ID NO: 2的第124位对应的天冬氨酸残基未被改变、或者被取代为谷氨酸；
c)SEQ ID NO:2的第125位的或与SEQ ID NO:2的第125位对应的天冬氨酸残基未被改变、或者被取代为谷氨酸；d) SEQ ID NO: 2的第126位的或与SEQ ID NO: 2的第126位对应的甘氨酸残基未被改变、或者被取代为丙氨酸或缬氨酸；e)SEQ ID NO:2的第127位的或与SEQ ID NO:2的第127位对应的丝氨酸残基未被改变、或者被取代为苏氨酸；f) SEQ ID NO: 2的第291位的或与SEQ ID NO: 2的第291位对应的苯丙氨酸残基未被改变、或者被取代为色氨酸或酪氨酸；g) SEQ ID NO: 2的第292位的或与SEQ ID NO: 2的第292位对应的赖氨酸残基未被改变、或者被取代为精氨酸；h) SEQ ID NO: 2的第293位的或与SEQ ID NO: 2的第293位对应的甘氨酸残基未被改变、或者被取代为丙氨酸或缬氨酸；i)SEQ ID NO: 2的第294位的或与SEQ ID NO: 2的第294位对应的组氨酸残基未被改变、或者被取代为赖氨酸或精氨酸；j) SEQ ID NO: 2的第295位的或与SEQ ID NO: 2的第295位对应的脯氨酸残基未被改变、或者被取代为缬氨酸或异亮氨酸；k) SEQ ID NO: 2的第336位的或与SEQ ID NO: 2的第336位对应的丝氨酸残基未被改变、或者被取代为苏氨酸；和1)SEQ ID NO:2的第337位的或与SEQ ID NO:2的第337位对应的丝氨酸残基未被改变、或者被取代为苏氨酸。
方式6 :编码方式f 5中任一项所述的蛋白质的核酸。方式7:—种编码￠-半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶蛋白的分离的核酸，其中，该蛋白质为实质上不具有神经氨酸酶活性的P -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶蛋白，并且该核酸包含选自以下的碱基序列(a)在 SEQ ID NO:1 的核苷酸 4-1158 位中，SEQ ID NO:1 的第 955-957 位的密码子变化为编码谷氨酸以外的氨基酸的密码子的碱基序列；(b)在SEQ ID NO:1的核苷酸4-1158位中，包含一个或多个核苷酸缺失、取代、插入和/或添加的碱基序列，在该碱基序列中，至少与SEQ ID NO:1的第955-957位的碱基序列对应的密码子变化为编码谷氨酸以外的氨基酸的密码子；(c)与SEQ ID NO:1的核苷酸4-1158位具有80%以上的同一性的碱基序列，在该碱基序列中，至少与SEQ ID NO:1的第955-957位的碱基序列对应的密码子变化为编码谷氨酸以外的氨基酸的密码子；和(d)与SEQ ID NO:1的核苷酸4-1158位的互补链在严谨的条件下杂交的碱基序列，在该碱基序列中，至少与SEQ ID NO:1的第955-957位的碱基序列对应的密码子变化为编码谷氨酸以外的氨基酸的密码子。方式8 :包含方式6或7所述的核酸的表达载体。方式9 :具有0 -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶活性的重组蛋白质的制造方法，其中，该蛋白质为实质上不具有神经氨酸酶活性的3 -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶蛋白，并且，该制造方法包含以下工序
I)利用含有方式6或7所述的核酸的表达载体转化宿主细胞；2)培养所得到的转化细胞；并且3)从培养的转化细胞或其培养上清中分离实质上不具有神经氨酸酶活性而具有^ -半乳糖苷- a 2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质。发明效果本发明通过提供保持源自海洋性微生物的P -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶的优点并且实质上不具有神经氨酸酶活性的新型的P -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶蛋白以及编码该蛋白质的核酸，从而可以实现与到目前为止的情况相比更容易地操作，且能够有效地向糖链转移唾液酸。在生物体内的复合糖糖链中唾液酸大多存在于非还原末端，从糖链功能的观点来看是极为重要的糖。因此，唾液酸转移酶在糖转移酶中也是需求最高的酶之一，本发明的新型唾液酸转移酶的提供也对应于这样的高需求。
图1-1为3’ -唾液酸乳糖(3’ -SL)和唾液酸(Neu5Ac)的HPLC分析结果。图1-2为表不培养利用包含编码信号肽区域的前导序列缺失的源自JT-1SH-467株的￠-半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶的基因(SEQ ID NO:1)的表达载体转化的大肠杆菌，使从得到的菌体中制备的粗酶液与3’-唾液酸乳糖反应得到的反应溶液的HPLC分析结果的图。在反应开始后0小时和72小时进行分析。保留时间为22分钟的峰为3’-唾液酸乳糖，12分钟的峰为唾液酸。图1-3为表示培养利用包含编码SEQ ID NO: 2所述的第319位的谷氨酸被变异为丙氨酸的修饰型N2C0蛋白(E319A突变体)的P -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶基因的表达载体转化的大肠杆菌， 使从得到的菌体中制备的粗酶液与3’ -唾液酸乳糖反应得到的反应溶液的HPLC分析结果的图。在反应开始后0小时和72小时进行分析。保留时间为22分钟的峰为3’ -唾液酸乳糖，12分钟的峰为唾液酸。图1-4为表示培养利用包含编码SEQ ID NO: 2所述的第318位的苯丙氨酸被变异为丙氨酸、第319位的谷氨酸被变异为丙氨酸的修饰型N2C0蛋白(F318AE319A突变体)的^ -半乳糖苷- a 2，3-唾液酸转移酶基因的表达载体转化的大肠杆菌，使从得到的菌体中制备的粗酶液与3’ -唾液酸乳糖反应得到的反应溶液的HPLC分析结果的图。在反应开始后0小时和72小时进行分析。保留时间为22分钟的峰为3’-唾液酸乳糖，12分钟的峰为唾液酸。图2-1为表示针对信号肽区域缺失的源自JT-1SH-467株的@ -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶(野生型)；SEQ ID NO:2的第319位的谷氨酸被变异为丙氨酸的修饰型P -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶(E319A突变体)；以及SEQ IDN0:2的第318位的苯丙氨酸被变异为丙氨酸、第319位的谷氨酸被变异为丙氨酸的修饰型P -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶(F318AE319A突变体)各酶，分析唾液酸转移酶活性在30°C的最适pH的结果的图。图2-2为表示针对信号肽区域缺失的源自JT-1SH-467株的@ -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶(野生型)；SEQ ID NO:2的第319位的谷氨酸被变异为丙氨酸的修饰型P -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶(E319A突变体)；以及SEQ IDN0:2的第318位的苯丙氨酸被变异为丙氨酸、第319位的谷氨酸被变异为丙氨酸的突变体P -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶(F318AE319A突变体)各酶，分析唾液酸转移酶活性在pH6. O的最适温度的结果的图。
具体实施例方式以下，进一步详细地说明本发明。定义只要在本说明书没有特别定义，与本发明相关的所使用的科学用语和技术用语具有本领域技术人员通常所理解的含义。在本说明书中，关于蛋白质、核酸或抗体等分子“分离的”的意思是指实质上不含在该分子的天然状态下并存的成分的状态。作为这样的状态，例如可以列举实质上不含来源于天然产生该分子的物种的其他分子的状态、通过与天然产生该分子的物种不同的物种的细胞或所构建的培养细胞系来表达的状态、或化学合成的状态等。另外，分子处于“分离的”状态时，该分子也可以通过在该技术领域中所公知的技术，以实质上不含在天然状态下并存的成分的方式纯化。在本说明书中，“实质上不含”某成分是指与天然状态相比较，该成分的含量减少的状态。“实质上不含”某成分的状态中包括例如完全不含该成分的情况、以检测极限以下的量含有的情况或含量降低至天然状态的50%以下、25%以下、10%以下、7%以下、5%以下、3%以下、1%以下、0. 5%以下或0. 1%以下的情况。在本说明书中“蛋白质”是指包含通过肽键相互连结的2个以上的氨基酸残基的分子。另外，在本说明书中“蛋白质”的用语也可以记载为“多肽”。在本说明书中“ 核酸”是指由2以上的核苷酸所构成的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。另外，本说明书中“核酸”的用语也可以记载为“多核苷酸”。对于以DNA的碱基序列所记载的核酸要指RNA的情况时，对于本领域技术人员而言，将会理解为应当将DNA的碱基序列的胸腺嘧啶替换为尿嘧啶来理解。在本说明书中“唾液酸”是表示属于唾液酸族(family)的神经氨酸衍生物。具体而言，表示N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N_羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)、5_脱氨基-5-羟基神经氨酸(KDN)、二唾液酸(二 N-乙酰神经氨酸Neu5Ac a 2，8 (9)Neu5Ac)等。在本说明书中“ 0 -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶”是指具有使唾液酸从胞苷单磷酸(CMP)-唾液酸中转移至复合糖糖链或游离的糖链中的半乳糖残基的3位；乳糖或N-乙酰基乳糖胺等寡糖中存在的半乳糖的3位；或者半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、葡萄糖、N-乙酰基葡糖胺或甘露糖等能够构成复合糖的单糖且在3位的碳具有羟基的单糖的3位的活性的蛋白质。在本说明书中“ ￠-半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶活性”是指针对￠-半乳糖苷- a 2，3-唾液酸转移酶如上所述的活性。另外，“ ^ -半乳糖苷_a 2，3_唾液酸转移酶活性”在本说明书中有时也简单表示为“唾液酸转移酶活性”。在本说明书中“神经氨酸酶”是指具有将存在于复合糖糖链或游离的糖链中的非还原末端的唾液酸从该糖链切断的活性的蛋白质。另外，神经氨酸酶在该技术领域中也被称为唾液酸酶。另外，在本说明书中“神经氨酸酶活性”是指关于蛋白质的活性，意思是指催化将存在于复合糖糖链或游离的糖链中的非还原末端的唾液酸从该糖链切断的反应的活性。本说明书中“实质上不具有神经氨酸酶活性”是指与野生型蛋白质相比较，神经氨酸酶活性降低的状态。例如，包括完全不具有神经氨酸酶活性的情况、为检测极限以下的活性的情况、或神经氨酸酶活性降低至野生型蛋白质的10%以下、7%以下、5%以下、3%以下、1%以下、0. 5%以下、0. 1%以下、0. 05%以下、0. 01%以下的情况。在本说明书中“载体”是指能够用于将与其相连的核酸导入宿主细胞内的核酸。另外，“表达载体”为能够使通过载体所导入的核酸所编码的蛋白质表达的载体。载体包括质粒载体、病毒载体等。在本说明书中，“宿主细胞”是指接受通过载体的接受基因导入或转化的细胞。本领域技术人员能够根据使用的载体适当选择宿主细胞。宿主细胞，例如可以为来自大肠杆菌(E. coli)等原核生物的细胞，或者可以为来自酵母等单细胞真核生物、植物细胞、动物细胞(例如、人细胞、猴子细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)等真核生物的细胞。源自TT-1SH-467 株的 N2C0 蛋白本发明提供实质上不具有神经氨酸酶活性的新型P -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶活性蛋白质。发明人等从海洋性细菌明亮发光杆菌(Photobacteriumphosphoreum) JT-1SH-467株中发现具有半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质NOCO (SEQ ID N0:4)，进一步在从NOCO中除去信号肽区域的基础上，在N末端添加甲硫氨酸而得到具有￠-半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质N2C0 (SEQ ID NO: 2) (W02006/112253) 0该源自JT-1SH-467株的N2C0，与其他众多的源自海洋性细菌的唾液酸转移酶同样，为具有唾液酸转移酶活性和神经氨酸酶活性两者的酶蛋白。在本说明书中记载为“N2C0”的情况只要不特别进行说明就是指对于源自JT-1SH-467株的P -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶，将信号肽区域缺失的N2C0 (SEQ IDN0:2 :以下在本说明书 中也记作野生型N2C0)及其突变体。另外，也包括将SEQ ID N0:2的N末端的甲硫氨酸除去、添加了适当的信号肽的蛋白质。N2C0蛋白的突变体或突变型是指在SEQ ID N0:2的氨基酸序列中，在氨基酸残基中导入了突变的蛋白质。在N2C0蛋白的突变体之中，特别是将以实质上不具有神经氨酸酶活性的方式使氨基酸残基改变的蛋白质称为N2C0蛋白的修饰体或修饰型。因此，根据文意记作“N2C0 “的情况中包括本发明的修饰型N2C0，也包括作为N2C0的野生型、突变型、本发明的修饰型的总称使用的情况。另外，由于N2C0显示唾液酸转移酶活性，所以在本说明书中有时也将N2C0简称为“唾液酸转移酶”。本发明通过使N2C0蛋白的特定的氨基酸残基改变，而提供实质上不具有神经氨酸酶活性的修饰型P -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶活性蛋白质。N2C0(野生型)典型而言可以是包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的蛋白质或通过包含SEQ ID NO:1的碱基序列的核酸所编码的蛋白质。或者N2C0也可以为包含SEQ IDN0:2的氨基酸序列的蛋白质或通过包含SEQ ID NO:1的碱基序列的核酸所编码的蛋白质的突变体，且具有与N2C0同样的唾液酸转移酶活性的蛋白质。N2C0的突变体可以为含有在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白质。取代也可以是保守的取代，这是指利用具有类似的物理化学特征的残基取代特定的氨基酸残基。在保守的取代的非限定的例中，包括如Ile、Val、Leu或Ala相互的取代这样的含脂肪族基团的氨基酸残基之间的取代；如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn相互的取代这样的极性残基之间的取代等。例如,将SEQID N0:2的第318位的苯丙氨酸(F)取代为丙氨酸(A)的蛋白质是其中的I例。通过氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加得到的突变体能够通过对编码野生型蛋白质的DNA，例如通过实施作为公知技术的定点突变(例如，参照Nucleic Acid Research, Vol. 10，No. 20，p. 6487-6500，1982，通过引用将其整体在本说明书中援引)来制作。在本说明书中，“一个或多个氨基酸”是指通过定点突变法能够缺失、取代、插入和/或添加程度的氨基酸。另外，在本说明书中“ 一个或多个氨基酸”是指根据情况为一个或数个氨基酸的意思，并没有限定，但优选为I到10个，优选为9个以下、7个以下、5个以下、3个以下或2个以下，更优选为I个以下。定点突变法，例如，除了作为所期望的变异即特定的不一致以外，能够使用与应受到变异的单链噬菌体DNA互补合成寡核苷酸引物如下进行。即，作为引物使用上述合成寡核苷酸，合成与噬菌体互补的链，以所得到的双链DNA转化宿主细胞。将所转化的细菌的培养物涂布于琼脂上，从含有噬菌体的单细胞形成菌斑。这样，理论上50%的新菌落含有作为单链具有变异的噬菌体，剩余的50%具有原始的序列。在与上述具有所期望变异的DNA完全一致的菌落进行杂交、但与具有原始链的菌落不杂交的温度，使所得到的菌斑与通过激酶处理所标记的合成探针杂交。接着采集与该探针杂交的菌斑，进行培养，回收DNA。此外，作为在生物活性肽的氨基酸序列中保持其活性并且实施一个或多个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加的方法，除了上述的定点突变之外，还有利用突变源处理基因的方法，以及将基因选择性地打开，接着将所选择的核苷酸除去、取代、插入或添加，然后进行连结的方法。虽然没有限定，但在本发明中的N2C0是由在SEQ ID N0:2中缺失、取代或添加I到10个、优选9个以 下、7个以下、5个以下、3个以下、2个以下、更优选I个以下的氨基酸得到的氨基酸序列构成的具有P -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质。N2C0的突变体还可以是包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少具有80%以上、优选85%以上、90%以上、93%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上、更优选99. 3%以上的氨基酸同一性的氨基酸序列的蛋白质。其中，N2C0的突变体也可以是具有与野生型N2C0相同的唾液酸转移酶活性的蛋白质。2个氨基酸序列的同一性％可以通过视觉的检测和数学的计算来确定。或2个蛋白质序列的同一性百分数，也可以基于Needleman, S. B.和ffunsch, C. D. (J. Mol.Biol.，48:443-453, 1970)的算法，并且通过使用能够从威斯康星大学遗传学计算机小组(UffGCG)获得的GAP计算机程序比较序列信息来确定。在GAP程序的优选默认参数中包括(l)Henikoff, S.和 Henikoff, J. G. (Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 89:10915-10919, 1992)中记载的评分矩阵，blosum62 ； (2) 12的空位(gap)加权；(3)4的空位长加权；和(4)相对于末端空位无罚分。也可以使用本领域技术人员所使用的、序列比较的其他程序。同一性的百分比，也可以使用例如 Altschul 等(Nuc1. Acids. Res.，25, p. 3389-3402，1997)所记载的 BLAST程序与序列信息比较来决定。该程序可以从网络上NationalCenter for BiotechnologyInformation (NCBI)或 DNA Data Bank of Japan (DDBJ)的网页利用。根据 BLAST 程序的同一性检索的各种条件(参数)在该网页中有详细记载，虽然能够适当改变一部分的设定，但检索通常使用默认值进行。或2个氨基酸序列的同一性％也可以使用遗传信息处理软件GENETYXVer. 7 (GENETYX制)等程序或FASTA算法等确定。此时，检索使用默认值即可。2个核酸序列的同一性％可以通过视觉的检测和数学的计算确定，或者更优选该比较通过使用计算机程序来对序列信息进行比较而实施。代表性的优选的计算机 程序为遗传学计算机小组(GCG ;威斯康星州的麦迪逊)的Wisconsin package, versionlO. 0程序“GAP” (Devereux 等人，1984，Nuc1. AcidsRes.，12:387)。通过该 “GAP” 程序的使用，除了2个核酸序列的比较以外，还能够进行2个氨基酸序列的比较、核酸序列与氨基酸序列的比较。其中，“GAP”程序的优选默认参数中包括(I)关于核苷酸的(包含对于同一物为I和对于非同一物为0的值)一元(unary)比较矩阵的GCG实行,与根据Schwartz和DayhofT监修“多妝的序列和结构的图集(Atlas of Polypeptide Sequence andStructure) ”国立生物医学研究财团、353-358页、1979所记载的，Gribskov和Burgess, Nucl. AcidsRes.，14:6745, 1986的加权氨基酸比较矩阵；或其他能够进行比较的比较矩阵；(2)关于氨基酸的各空位30的罚分和关于各空位中的各记号追加的I的罚分；或关于核苷酸序列的各空位50的罚分和关于各空位中的各记号追加的3的罚分；(3)对末端空位的无罚分和
(4)对长空位无最大罚分。由本领域技术人员所使用的其他序列比较程序中，例如能够使用由美国国立医学图书馆的网页http://www. ncb1. nlm. nih. gov/blast/bl2seq/bls. html能够使用的BLASTN程序、版本2. 2. 7，或可以使用UW-BLAST2. 0算法。关于UW-BLAST2. 0的标准的默认参数的设定记载于以下的网页http://blast. wustl. edu。另外，BLAST算法使用BL0SUM62氨基酸评分矩阵，能够使用的选择参数如下(A)具有低组成复杂性的查询序列的片段(通过 Wootton 和 Federhen 的 SEG 程序(Computers and Chemistry, 1993)确定；也可以参考Wootton和Federhen, 1996 “序列数据库中的组成偏重区域的解析(Analysis of compositionalIy biasedregions in sequence databases)，，MethodsEnzymol., 266:544-71);或包含用于遮盖由短周期性的内部重复序列构成的片段(通过Claverie 和 States (Comput ersand Chemistry, 1993)的 XNU 程序确定)的过滤器，以及(B)根据用于报告相对于数据库序列的适合的统计学上有显著性差异的阈值，或E-得分(Karlin和Altschul，1990)的统计学的模型，仅仅由于偶然而发现的适合的期待概率；来源于某种适合的统计学的显著性差异大于E-得分阈值的情况，该适合没有报告)；优选的E-得分阈值的数值为0. 5，或以优选度增加的顺序为0. 25,0. 1,0. 05,0. 01,0. 001,0. 0001、le-5、le-10、le-15、le-20、le-25、le-30、le-40、le-50、le_75 或 le-100。N2C0的突变体还可以为由包含与SEQ ID NO:1的碱基序列的互补链在严谨的条件杂交的碱基序列的核酸所编码的蛋白质。其中，N2C0的突变体也可以为具有与野生型N2C0同样的P -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质。其中，“严谨的条件下”是指在中等程度或高等程度的严谨的条件下进行杂交的意思。具体而言，中等程度的严谨的条件，例如，能够基于DNA的长度，通过具有一般技术的本领域技术人员容易地确定。基本的条件在Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第 3 版,第 6 章,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 中表不，包含例如在5XSSC、0. 5%SDS、1. OmM EDTA(pH8. 0)的前清洗溶液、约 42°C 的、约 50% 甲酰胺、2XSSC 至Ij6X SSC、优选5X SSC到6X SSC,0. 5%SDS (或约42°C的、约50%甲酰胺中的Stark溶液等的其他同样的杂交溶液)的杂交条件，和例如在约50°C到68°C、0. lXSS(^lj6XSSC、0. 1%SDS的清洗条件的使用。优选的中等程度的严谨的条件包含约50°C、6XSSC、0. 5%SDS的杂交条件(和清洗条件)。高严谨的条件也能够例如根据DNA的长度通过本领域技术人员容易地确定。一般这样的条件包含在比中等程度的严谨的条件高的温度和/或低的盐浓度的杂交(例如，包含0. 5%左右的SDS，约65 °C、6 X SSC到0. 2 X SSC,优选6 X SSC、更优选
2X SSC、更加优选0.2 X SSC或者0.1 X SSC的杂交)和/或清洗，例如被定义为伴随如上所述的杂交条件、和约65。。、到68°C、0. 2X SSC到0. 1XSSC、0. 1%SDS的清洗。在杂交和清洗的缓冲液中，可以以SSC (I X SSC为0. 15M NaCl和15mM柠檬酸钠)代用SSPE (I X SSPE为0. 15M NaClUOmMNaH2POdP1. 25mM EDTA、pH7. 4)，清洗在杂交结束后进行15分钟到I小时左右。另外，探针也能够使用不使用放射性物质的市售的杂交试剂盒。具体而言，可以列举使用 ECL direct labeling & detection system(Amersham公司制)的杂交等。作为严谨的杂交，例如可以列举如下条件在试剂盒中的hybridization buffer中加入Blocking试剂使得为5%(w/v)、NaCl为0. 5M，在42°C进行4小时，清洗在0. 4%SDS、0. 5XSSC中，以55 0C >20分钟进行2次，在2 X SSC中，室温下5分钟进行一次。N2C0的突变体的唾液酸转移酶活性也可以利用公知的方法，例如J. Biochem.，120, 104-110· (1996)(通过引用将其全部引入本说明书)中记载的方法测定。例如，能够将CMP-NeuAc (N-乙酰神经氨酸)作为糖供体底物，并且使用乳糖作为糖受体底物来进行酶反应，并评价作为反应产物的唾液酸乳糖的量由此来评价酶活性。此外，唾液酸转移酶的酶I单位(IU)为I分钟转移I微摩尔的唾液酸的酶量。作为转移至糖受体底物的唾液酸的结合方式的确定方法，并没有限定，但能够使用利用吡啶基胺化糖链的方法、反应产物通过核磁共振分光法(NMR)的分析等本领域技术人员所公知的方法中的任意方法来进行。利用吡啶基胺化糖链的方法，包括将吡啶基胺化糖链作为糖受体底物进行酶反应的步骤。具体而言，能够通过使用吡啶基胺化乳糖(Gal ^1-4Glc-PA, Takara Bio制)作为糖受体底物，使用CMP-NeuAc作为糖供体底物进行酶反应，利用高效液相色谱(HPLC)来分析反应产物，从反应产物的保留时间确定唾液酸所转移的位置。可通过任意一种来测定。在本发明的修饰型N2C0蛋白中，下面将对希望不进行改变的氨基酸残基进行说明。修饰型唾液酸转移酶蛋白本发明的修饰型N2⑶蛋白为基于野生型N2C0蛋白或突变型N2C0蛋白的氨基酸序列，通过特定的氨基酸残基的取代，而改变为实质上不具有神经氨酸酶活性的蛋白质。即，本发明的修饰型N2C0蛋白，可以为包含选自以下的氨基酸序列的蛋白质(a)在SEQ ID NO: 2的氨基酸2-386位中，SEQ ID NO: 2的第319位的谷氨酸残基取代为谷氨酸以外的氨基酸的氨基酸序列；(b)在SEQ ID NO: 2的氨基酸2-386位中，包含一个或多个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，在该氨基酸序列中，至少与SEQ ID N0:2的第319位的谷氨酸残基对应的氨基酸残基取代为谷氨酸以外的氨基酸；(c)与SEQ ID NO: 2的氨基酸2-386位具有80%以上的同一性的氨基酸序列，在该氨基酸序列中，至少与SEQ ID NO:2的第319位的谷氨酸残基对应的氨基酸残基取代为谷氨酸以外的氨基酸；和(d)通过与SEQ ID NO:1的核苷酸4-1158位的互补链在严谨的条件下杂交的碱基序列所编码的氨基酸序列，在该碱基序列中，至少与SEQ ID NO:1的第955-957位的碱基序列对应的密码子变化为编码谷氨酸以外的氨基酸的密码子。其中，本发明的修饰型N2C0蛋白可以为实质上不具有神经氨酸酶活性的P -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶蛋白。另外，在上述(ar(d)所规定的氨基酸序列的N末端侧还可以添加甲硫氨酸残基、或SEQ ID NO:4的氨基酸1-24位或酵母a因子信号前导区等信号肽。“谷氨酸以外的氨基酸”是指天然型或非天然型的谷氨酸以外的氨基酸。优选谷氨酸以外的氨基酸是谷氨酸以外的天然型的L-氨基酸。在优选的方式中，本发明的修饰型N2C0蛋白中与SEQ ID NO:2的第319位的谷氨酸残基对应的氨基酸残基被取代为中性氨基酸残基或碱性氨基酸残基。在更优选的方式中，本发明的修饰型N2C0蛋白中，与SEQ ID NO:2的第319位的谷氨酸残基对应的氨基酸残基被取代为中性氨基酸残基。中性氨基酸残基为天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。并且，碱性氨基酸残基为赖氨酸、精氨酸、组氨酸。关于修饰型N2C0蛋白，为了取代SEQ ID N0:2的第319位的氨基酸残基，更优选的中性氨基酸残基为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸。更优选甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸。进一步优选丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸。这样的修饰型N2C0虽然具有P -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶活性，但实质上不具有神经氨酸酶活性。 神经氨酸酶活性能够由公知的方法测定。例如，能够通过使神经氨酸酶作用于含唾液酸糖链进行唾液酸水解反应，评价作为反应产物的唾液酸脱离的糖链的量或游离的唾液酸的量，从而来评价酶活性。其中，神经氨酸酶的酶I单位(IU)为I分钟使I微摩尔的唾液酸游离的酶量。氨基酸的改变方法用于改变N2C0的氨基酸、得到本发明的修饰型N2C0蛋白的方法，能够使用对公知的氨基酸序列实施突变的方法，没有特别限定。优选对编码本发明的改变蛋白质的核酸的碱基序列实施修饰进行改变。例如，为了改变氨基酸序列的特定位置的氨基酸，例如可以列举利用PCR的方法(Higuchi 等人(1988)Nucleic Acid Resl6:7351-7367，Ho 等人(1989)Gene77:51-59)。即能够通过利用包含目标突变的错配密码子的引物进行PCR，制作编码目标改变体的DNA，使其表达，从而得到目标改变体。另外，通过氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加得到的改变体，能够通过对编码野生型蛋白质的DNA，实施作为上述的公知技术的定点突变等方法来制作。在修饰型N2C0中希望不被改变的氨基酸残基本发明的修饰型N2C0蛋白中的氨基酸残基的改变是修饰型N2C0保持了 P -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶活性这样的改变。
然而，关于野生型N2C0而言，从与源自其他的海洋性微生物的唾液酸转移酶的序列的比较研究中，由发明人等鉴定出了被认为非常好地保守的、对唾液酸转移酶活性重要的基序(YDDGS基序(motif)、FKGHP基序、SS基序)(Yamamoto等人(2008)BBRC365:340-343)。因此，在 SEQ ID NO: 2 中，就 Y123、D124、D125、G126、S127 (YDDGS 基序)4291、1(292、6293、11294、？295$1 册基序)、5336、S337 (SS 基序)而言，希望不被改变。或者在改变它们时，希望以能够保持唾液酸转移酶活性的方式改变为性质或者结构类似的氨基酸，希望分别例如在酪氨酸(Y)时改变为色氨酸(W)或苯丙氨酸(F)，更优选改变为苯丙氨酸(F)，在天冬氨酸(D)时改变为谷氨酸(E)，在甘氨酸(G)时改变为丙氨酸(A)或缬氨酸(V)，更优选改变为丙氨酸(A)，在丝氨酸(S)时改变为苏氨酸(T)，在苯丙氨酸(F)时改变为色氨酸(W)或酪氨酸(Y)，更优选改变为酪氨酸(Y)，在赖氨酸(K)时改变为精氨酸(R)，在组氨酸01)时改变为赖氨酸(K)或精氨酸(R)，更优选改变为精氨酸(R)，在脯氨酸(P)时改变为缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)，更优选改变为缬氨酸(V)。编码修饰型N2C0蛋白的核酸本发明提供编码本发明的修饰型N2C0蛋白的核酸。这样的核酸的碱基序列为将N2C0的碱基序列(SEQ ID NO:1)改变为编码修饰型N2C0蛋白的改变氨基酸的碱基序列。S卩，编码本发明的修饰型N2C0蛋白的核酸，可以为选自包含以下碱基序列的核酸(a)在 SEQ ID NO:1 的核苷酸 4-1158 位中，将 SEQ ID NO:1 的第 955-957 位的密码子变化为编码谷氨酸以外的氨基酸的密码子的碱基序列；(b)在SEQ ID NO:1的核苷酸4-1158位中，包含一个或多个核苷酸缺失、取代、插入和/或添加的碱基序列，在该碱基序列中，至少与SEQ ID NO:1的第955-957位的碱基序列对应的密码子变化为编码谷氨酸以外的氨基酸的密码子；(c)与SEQ ID NO :1的核苷酸4-1158位具有80%以上的同一性的碱基序列，在该碱基序列中，至少与SEQ ID NO:1的第955-957位的碱基序列对应的密码子变化为编码谷氨酸以外的氨基酸的密码子；和(d)与SEQ ID NO:1的核苷酸4-1158位的互补链在严谨的条件下杂交的碱基序列，在该碱基序列中，至少与SEQ ID NO:1的第955-957位的碱基序列对应的密码子变化为编码谷氨酸以外的氨基酸的密码子。其中，编码本发明的修饰型N2C0蛋白的核酸可以为编码实质上不具有神经氨酸酶活性的P -半乳糖苷- a 2，3-唾液酸转移酶蛋白的被分离的核酸。本发明的核酸也可以在N末端侧包含编码甲硫氨酸的密码子、相当于SEQ ID NO:3的核苷酸1-72的前导序列、或酵母a因子前导区等源自其他生物来源的前导序列。在上述的(ar(d)中，“谷氨酸以外的氨基酸”如“修饰型唾液酸转移酶蛋白”的部分所记载的，是指谷氨酸以外的天然型的L-氨基酸，优选为中性氨基酸或碱性氨基酸，更优选为中性氨基酸。制造本发明的蛋白质的方法本发明还涉及制造本发明的修饰型N2C0蛋白的方法。在优选的方式中本发明的方法为生产本发明的蛋白质的方法。(I)制造重组蛋白质的方法
技术领域：
本发明提供含有本发明的核酸的表达载体，以及含有该表达载体的宿主细胞。而且，本发明提供通过将含有该表达载体的宿主细胞在适于重组蛋白质的表达的条件下培养，回收所表达的重组蛋白质,从而制造重组修饰型N2C0蛋白的方法。为了制造本发明的重组蛋白质，在对应使用的宿主所选择的表达载体中，插入以具有功能的方式连接于从哺乳动物、微生物、病毒、或昆虫基因等中诱导的适当的转录或翻译调控核苷酸序列的编码修饰型N2C0蛋白的核酸序列。作为调控序列的例子，可以列举转录启动子、操纵子、或增强子、mRNA核糖体结合部位、以及控制转录和翻译的开始和结束的适当序列。本发明的载体中所插入的编码修饰型N2C0蛋白的核酸序列为上述的本发明的核酸的碱基序列。该序列既可以含有前导序列，也可以不含有前导序列。在包含前导序列时，也可以为相当于SEQ ID N0:3的核苷酸1-72的前导序列，另外也可以取代为源自其他生物来源的前导序列。也可以通过取代前导序列，设计为使表达的蛋白质分泌在宿主细胞之外的表达体系。另外，本发明的重组修饰型N2C0重组蛋白质也可以通过接着编码该蛋白质的核酸、在载体中插入连接有编码His标签、FLAG 标签(包含氨基酸序列DYKDDDDK(SEQ IDNO:5)的标签)、谷胱甘肽-S-转移酶的核酸等的核酸，从而作为融合蛋白来表达。通过使本发明的酶作为这样的融合蛋白表达，能够容易地进行该酶的纯化和检测。在适于本发明的蛋白质的表达的宿主细胞中包括原核细胞、酵母或高等真核细胞。细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主中使用的适当的克隆和表达载体，例如记载于Pouwels Cloning Vectors:A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)(通过弓I用将其全部引入本说明书)。原核生物包含革兰氏阴性或革兰氏阳性菌，例如包括大肠杆菌或枯草杆菌。在使用大肠杆菌这样的原核细胞作为宿主时，为了使重组多肽在原核细胞内的表达容易，本发明的蛋白质也可以含有N末端甲硫氣Ife残基。该N末端甲硫氣酸也能够在表达后从重组蛋白质中分离。 原核宿主细胞内使用的表达载体，一般包含I个或2个以上的可选择标记基因。表型可选择标记基因，例如为赋予抗生素耐性，或赋予自养要求性的基因。适于原核宿主细胞的表达载体的例子中包含pBR322(ATCC37017)这样的市售的质粒或由其诱导的质粒。由于PBR322含有针对氨苄青霉素和四环素耐性的基因，所以鉴定转化细胞容易。适当的启动子以及编码修饰型N2C0蛋白的核酸的DNA序列被插入该pBR322载体内。其他市售的载体包括例如 pKK223_3 (Pharmacia Fine Chemicals,瑞典，乌普萨拉)和 pGEMl (PromegaBiotech.,美国,威斯康星州,麦迪逊)等。在原核宿主细胞用的表达载体中通常所使用的启动子序列中包含tac启动子、
3-内酰胺酶(青霉素酶)启动子、乳糖启动子(Chang等，Nature275:615,1978 JPGoeddel等，Nature281:544,1979,通过引用将其全部引入本说明书)等。另外，也可以在酵母宿主内表达本发明的重组蛋白质。优选使用酵母菌属(Saccharomyces,例如S. cerevisiae),但也可以使用毕赤酵母属(Pichia)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)这样的其他酵母属。酵母载体多含有从2 ii酵母质粒的复制起点的序列、自我复制序列(ARS)、启动子区域、用于多聚腺苷酸化的序列、用于结束转录的序列、以及可选择的标记基因。也能够使用酵母a因子前导序列，进行修饰型N2C0蛋白的分泌。还已知有适于促进重组多肽从酵母宿主分泌的其他前导序列。转化酵母的方法，例如，在Hinnen 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 75:1929-1933，1978 (通过引用将其全部引入本说明书)中记载。使用哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系，也能够表达本发明的重组蛋白质。也能够使用哺乳动物起源的株化细胞系。用于哺乳动物宿主细胞表达载体的转录和翻译控制序列能够从病毒基因组中得到。通常所使用的启动子序列和增强子序列从多瘤病毒、腺病毒2等中衍生。SV40病毒基因组，例如也可以使用从SV40起点、初期和后期启动子、增强子、剪接部位、和多聚腺苷酸化部位所衍生的DNA序列，赋予哺乳动物宿主细胞内的用于结构基因序列表达的其他基因要素。在哺乳动物宿主细胞内使用的载体，例如，能够利用Okayama和Berg(Mol. Cell. Biol. ,3:280, 1983，通过引用将其全部引入本说明书)的方法构建。产生本发明的重组修饰型N2C0蛋白的I个方法，包括将利用包含编码该蛋白质的核酸序列的表达载体转化的宿主细胞，在表达该蛋白质的条件下进行培养的步骤。接着，对应所使用的表达系将该蛋白质从培养培养基或细胞提取液中回收。纯化重组修饰型N2C0蛋白的操作，根据使用的宿主的类型和是否使本发明的蛋白质在分泌培养培养基中这样的因素来适当选择。例如，纯化重组蛋白质的操作包括阴离子交换柱、阳离子交换柱、凝胶过滤柱、羟基磷灰石柱、CDP-己醇胺琼脂糖柱、CMP-己醇胺琼脂糖柱、疏水性柱等柱色谱和非变性-PAGE等，或它们的组合。另外，在将重组蛋白质与使纯化容易的标签等融合并使其表达的情况下，也可以利用通过亲和色谱的纯化方法。例如在融合了组氨酸标签、FLAG 标签、或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等时，能够分别使用N1-NTA(次氮基三乙酸)柱、结合抗FLAG抗体的柱、或结合谷胱甘肽的柱等通过亲和色谱进行纯化。虽然可以纯化重组修饰型N2C0蛋白直至形成电泳中的单一条带，但由于即使为部分纯化品也具有充分的活性，所以本 发明的修饰型N2C0蛋白可以为纯化品，或也可以为部分纯化品。以下，根据实施例进一步具体地说明本发明，但这些并不限定本发明的技术的范围。本领域技术人员能够根据本说明书的记载容易地对本发明加以修饰、限定，这些包含在本发明的技术的范围中。实施例实施例1 :突变型g -半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶的制作(I) ISH467-N2C0 突变体的制作对于源自明亮发光杆菌(Photobacteriumphosphoreum) JT-1SH-467 株的 ￠-半乳糖苷-a 2，3-唾液酸转移酶N2C0 (专利文献3 W02006/112253)，制作氨基酸被取代的突变体。以发明人等制作的ISH467-N2C0/pTrc99A(专利文献3 W02006/112253)作为模板，进行PCR(lst PCR)。反应中使用的引物序列及其组合表示于表I和2。50 Ul反应液中，分别含有质粒、IOXPyroBest buffer5 u 1,2. 5mM dNTP4 y 1，引物各 5 皮摩尔，PyroBest DNAPolymerase (TaKaRa 公司制)0. 5 ii 1，进行 I 次 96。。3 分钟，进行 15 次 96°C I 分钟、55°C I分钟、72°C 2分钟，进行I次72°C I分钟(1st PCR)。PCR中使用的引物组合表示于表2。使用低熔点琼脂糖(SeaPlaqueGTG)在TAE缓冲液中对将这些PCR产物进行琼脂糖电泳。切出各DNA片段的凝胶，加入与凝胶等量的200mMNaCl，在70°C处理10分钟，将凝胶熔解。对该样品进行苯酚提取、苯酚-氯仿提取、氯仿提取各一次，通过乙醇沉淀回收DNA片段。将所得到的5’侧片段和3’侧片段作为模板，与1st PCR同样地制备反应液，使用用于5’侧片段扩增的Fw引物和用于3’侧片段扩增的Rv引物，进行Fusion-PCR(2ndPCR)。对于该2nd PCR产物，在进行如上所述电泳后得到纯化。此外，本次制作的突变体中也包含表I中记载的使用 ISH467-23ST-C0-HiS-BamHI 添加了 HisX6_Tag 的 PCR 产物。
[表1-1]表I突变型￠-半乳糖苷-ci2，3-唾液酸转移酶制作中使用的引物
权利要求
1.一种β_半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶蛋白，其中，该蛋白质包含选自以下氨基酸序列中的氨基酸序列，并且所述蛋白质实质上不具有神经氨酸酶活性，(a)在SEQID NO: 2的氨基酸2-386位中，SEQ ID NO: 2的第319位的谷氨酸残基取代为谷氨酸以外的氨基酸的氨基酸序列；(b)在SEQID NO: 2的氨基酸2-386位中，含有一个或多个氨基酸缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，在所述氨基酸序列中，至少与SEQ IDNO:2的第319位的谷氨酸残基对应的氨基酸残基取代为谷氨酸以外的氨基酸；(c)与SEQID NO: 2的氨基酸2-386位具有80%以上的同一性的氨基酸序列，在所述氨基酸序列中，至少与SEQ ID NO:2的第319位的谷氨酸残基对应的氨基酸残基取代为谷氨酸以外的氨基酸；和(d)通过与SEQID NO:1的核苷酸4-1158位的互补链在严谨的条件下杂交的碱基序列所编码的氨基酸序列，在所述碱基序列中，至少与SEQ IDNO:1的第955-957位的碱基序列对应的密码子变化为编码谷氨酸以外的氨基酸的密码子。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中，氨基酸序列为在权利要求1的(a)-(d)中所规定的氨基酸序列的N末端侧还具有甲硫氨酸、SEQ ID N0:4的氨基酸1_24位或信号肽的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其中，SEQID NO:2的第319位的谷氨酸残基或与SEQ ID NO: 2的第319位的谷氨酸残基对应的氨基酸残基取代为中性氨基酸残基或碱性氣基酸残基。
4.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其中，SEQID NO:2的第319位的谷氨酸残基或与SEQ ID NO:2的第319位的谷氨酸残基对应的氨基酸残基取代为中性氨基酸残基。
5.根据权利要求广4中任一项所述的蛋白质，其满足选自以下a)至I)中的一个至全部的条件a)SEQ ID NO: 2的第123位的或与变、或者被取代为色氨酸或苯丙氨酸；b)SEQID NO: 2的第124位的或与改变、或者被取代为谷氨酸；c)SEQID NO:2的第125位的或与改变、或者被取代为谷氨酸；d)SEQ ID NO: 2的第126位的或与变、或者被取代为丙氨酸或缬氨酸；e)SEQID NO:2的第127位的或与变、或者被取代为苏氨酸；f)SEQ ID NO: 2的第291位的或与改变、或者被取代为色氨酸或酪氨酸；g)SEQ ID NO: 2的第292位的或与变、或者被取代为精氨酸；h)SEQ ID NO: 2的第293位的或与变、或者被取代为丙氨酸或缬氨酸；SEQIDNO: 2的第SEQIDNO: 2的第SEQIDNO: 2的第SEQIDNO: 2的第SEQIDNO: 2的第SEQIDNO: 2的第SEQIDNO: 2的第SEQIDNO: 2的第NO:2的第124位对应的天冬氨酸残基未被NO:2的第125位对应的天冬氨酸残基未被NO:2的第126位对应的甘氨酸残基未被改NO:2的第127位对应的丝氨酸残基未被改NO:2的第291位对应的苯丙氨酸残基未被NO:2的第292位对应的赖氨酸残基未被改NO:2的第293位对应的甘氨酸残基未被改i)SEQ ID NO: 2的第294位的或与SEQ ID NO: 2的第294位对应的组氨酸残基未被改变、或者被取代为赖氨酸或精氨酸；j) SEQ ID NO: 2的第295位的或与SEQ ID NO: 2的第295位对应的脯氨酸残基未被改变、或者被取代为缬氨酸或异亮氨酸；k) SEQ ID NO: 2的第336位的或与SEQ ID NO: 2的第336位对应的丝氨酸残基未被改变、或者被取代为苏氨酸；和1)SEQ ID NO:2的第337位的或与SEQ ID NO:2的第337位对应的丝氨酸残基未被改变、或者被取代为苏氨酸。
6.编码权利要求Γ5中任一项所述的蛋白质的核酸。
7.一种编码β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶蛋白的分离的核酸，其中，所述蛋白质为实质上不具有神经氨酸酶活性的β -半乳糖苷- α 2，3-唾液酸转移酶蛋白，并且所述核酸包含选自以下的碱基序列(a)在SEQID NO:1的核苷酸4-1158位中，SEQ ID NO:1的第955-957位的密码子变化为编码谷氨酸以外的氨基酸的密码子的碱基序列；(b)在SEQID NO:1的核苷酸4-1158位中，包含一个或多个核苷酸缺失、取代、插入和/或添加的碱基序列，在所述碱基序列中，至少与SEQ ID NO:1的第955-957位的碱基序列对应的密码子变化为编码谷氨酸以外的氨基酸的密码子；(c)与SEQID NO:1的核苷酸4-1158位具有80%以上的同一性的碱基序列，在所述碱基序列中，至少与SEQ ID NO:1的第955-957位的碱基序列对应的密码子变化为编码谷氨酸以外的氨基酸的密码子；和(d)与SEQID NO:1的核苷酸4-1158位的互补链在严谨的条件下杂交的碱基序列，在所述碱基序列中，至少与SEQ ID NO:1的第955-957位的碱基序列对应的密码子变化为编码谷氨酸以外的氨基酸的密码子。
8.含有权利要求6或7所述的核酸的表达载体。
9.具有β_半乳糖苷-α2，3-唾液酸转移酶活性的重组蛋白质的制造方法，其中，该蛋白质为实质上不具有神经氨酸酶活性的β -半乳糖苷- α 2，3-唾液酸转移酶蛋白，所述制造方法包括以下工序1)利用含有权利要求6或7所述的核酸的表达载体转化宿主细胞；2)培养所得到的转化细胞；并且，3)从培养的转化细胞或其培养上清中，分离实质上不具有神经氨酸酶活性而具有β -半乳糖苷-α 2，3-唾液酸转移酶活性的蛋白质。
全文摘要
本发明涉及实质上不具有神经氨酸酶活性而具有β-半乳糖苷-α2,3-唾液酸转移酶活性的蛋白质、编码该酶蛋白的核酸、以及使用由编码该蛋白质的基因所转化的微生物制造该酶的方法。本发明的蛋白质为如下得到的修饰型酶蛋白对于源自属于弧菌科发光杆菌属的微生物的β-半乳糖苷-α2,3-唾液酸转移酶蛋白，通过使特定的氨基酸残基变异，使该蛋白质具有的神经氨酸酶活性实质上失活。
文档编号C12N9/10GK103052710SQ201180037618
公开日2013年4月17日 申请日期2011年7月28日 优先权日2010年7月30日
发明者锋利喜, 山本岳, 片山桵子 申请人:日本烟草产业株式会社