专利名称：原伊鲁烯合酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新鉴别的多核苷酸以及由这种多核苷酸编码的多肽，并且涉及它们的生产和应用，以及它们的变异体和变异体的应用。此外，本发明涉及一种通过使用所述新鉴别的多核苷酸/多肽用于生产蜜环菌戊素(melleolide)和相关真菌倍半萜芳香酯的方法。
背景技术：
蜜环菌戍素是由蜜环菌属(genus Armillaria)的同担子菌(homobasidiomyceste)产生的特有的次级代谢产物,所述蜜环菌属的同担子菌的种类不仅被认为是可食用的蘑菇，并且许多种类也是众所周知的森林寄生物，反映了它们形成使得它们能够在营养贫乏地区生长的根状菌束的能力。蜜环菌戊素是原伊鲁烯(protoilludene)型倍半萜并且具有有效的抗微生物和细胞毒素活性。至今为止，大约有50种已知的蜜环菌戊素并且它们几乎全部由这种真菌菌属产生。每个分子包含通过酯键连接至类苔色酸聚酮侧链上的三环的倍半萜骨架。原伊鲁烯的生物合成被认为包括使常见的倍半萜前体二磷酸法呢基酯环化成原伊鲁烯，随后由细胞色素P450单氧酶进一步修饰，随后连接聚酮侧链。虽然在过去已经广泛研究了一些萜烯，特别是来自植物的萜烯，例如薄荷醇、青蒿素(artemisinin)或紫杉醇(taxol) 的生物合成,关于绝大多数職烯,特别是由真菌产生的萜烯的合成还知之甚少。所有萜烯的生物合成都以三种常见前体之一的环化和重排起始(二磷酸香叶基酯(geranyl diphophate, 二磷酸物牛儿基酯),二磷酸法呢基酯(farnesyl diphosphate)或二磷酸香叶基香叶基酯(geranylgeranyl diphosphate, 二磷酸物牛儿基物牛儿基酯),从而分别产生单萜，倍半萜或双萜。这些由萜烯合酶催化的环化反应，是自然界中已知的最复杂的化学反应。通常，植物和真菌的萜烯合酶仅显示较低水平的序列一致性，并且尽管已经从植物中分离了数种萜烯合酶，仅报道了来自微生物的少数的萜烯合酶。并且，仅非常有限数量的真菌倍半萜合酶已被克隆以及功能性表征，包括，例如，单端孢霉烯(木霉二烯，trichodiene)合酶、马5 铃烯(aristolochene)合酶、以及 presilphiperfolan_8b-醇合酶。此外，近来已经表征了来源于灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea， Coprinus cinereus)的六种倍半胳合酶，产生了大根香叶烯A (germacrene Α)、α -衣兰油烯(a-muurolene)、δ-杜松烯(δ-cadinene)、以及α-叩卜任烯(α-cuprenene)作为主要产物。认为原伊鲁烯型倍半萜(也称为蜜环菌戊素，参见上文)的生物合成包括使常见的倍半萜前体二磷酸法呢基酯环化成原伊鲁烯，随后由细胞色素P450单氧酶进一步修饰，随后连接聚酮侧链。因为在药学中，特定的蜜环菌戊素由于它们的抗微生物和细胞毒性活性引起了人们的高度关注，因此，将期望以可控制的方式来特异性地生产和富集它们。
因此，本发明的目的是提供一种新工具，通过该工具可以实现同源或异源的靶向生产。根据本发明，这个目的和其他目的通过提供一种分离的或合成的或重组的编码具有原伊鲁烯合酶活性的多肽并且包括选自由以下各项所组成的组中的序列的多核苷酸来实现a)随附的序列表中的 SEQ ID No:l 或 SEQ ID No:14 ；b)与 SEQ ID No:1 或 SEQ ID No: 14 互补的核酸序列；c)在严格条件下与a)和b)中定义的核酸序列或它们的互补链杂交的核酸序列。这些目的进一步通过使用所述多核苷酸或由所述多核苷酸编码的用于生产蜜环菌戊素的多肽，以及通过用于生产蜜环菌戊素的各自方法来实现。以这种方式完全实现了这些目的。上述多核苷酸编码具有原伊鲁烯合酶活性的多肽，根据发明人的知识，这是首次鉴别、纯化以及酶学表征的。这种 新鉴别的多核苷酸催化二磷酸法呢基酯环化成原伊鲁烯，该步骤是蜜环菌戊素生产合成中的关键步骤。因此，通过鉴别编码原伊鲁烯合酶的基因，已经发现并产生了有价值且有效的工具以影响蜜环菌戊素的生产，例如，通过过表达这种新鉴别的基因以产生多拷贝的原伊鲁烯合酶，通过这种方法提高了蜜环菌戊素合成的环化速率，并且因此，增加蜜环菌戊素的产量。以此方式，可以获得高度富集的蜜环菌戊素，它们是有效的抗微生物剂和细胞毒性物质，并且可以用作治疗和药学的所有不同领域中的治疗工具。根据本发明，术语“一种或多种多核苷酸”通常指任何一种多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，它们可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。“一种或多种多核苷酸”包括，但不局限于，单链和双链DNA ;单链区和双链区或单链区、双链区和三链区的混合物的DNA ;单链和双链RNA ;单链区和双链区的混合物的RNA ;包括DNA和RNA的杂交分子，所述DNA和RNA可以是单链区或，更典型地，双链区或三链区，或单链区和双链区的混合物。此夕卜，在本文中使用的“多核苷酸”是指包含DNA或RNA或DNA和RNA两者的三链区。在这些区中的链可以来自同一分子或来自不同分子。这些区可以包括所有的一种或多种的分子，但是更典型地涉及一些分子中的仅一个区域。三螺旋区的分子中的一种通常是寡核苷酸。在本文中使用的，术语“一种或多种多核苷酸”还包括上述的包含一种或多种修饰的碱基的DNA或RNA。因此具有针对稳定性或其他原因而修饰的主链的DNA或RNA是该术语在本文中所希望的“一种或多种多核苷酸”。此外，包含不常见碱(如次黄嘌呤核苷)，或修饰的碱基(如三苯甲基化的碱基)(此处仅是给出两个实例)的DNA或RNA，是如在本文中使用的术语的“多核苷酸”。应当理解的是为了本领域技术人员已知的多种有用的目的，已对DNA及RNA做出很多种修饰。如在本文中使用的，术语“一种或多种多核苷酸”包含这些多核苷酸的化学修饰、酶修饰或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞(包括例如，简单细胞和复杂细胞)特有的DNA和RNA的化学形式。同样，“一种或多种多核苷酸”还包括通常称为一种或多种寡核苷酸的短多核苷酸。“一种或多种多肽”是指包含通过肽键或修饰的肽键连接彼此的两个以上氨基酸的任何肽或蛋白质。“一种或多种多肽”是指通常称为肽、低聚肽和低聚物的短链以及通常称为蛋白质的长链两者。多肽可以含有除了 20种基因编码的氨基酸之外的氨基酸。“一种或多种多肽”包括通过天然过程，例如处理(processing)和其他翻译后修饰,或通过化学修饰技术来修饰的那些。这些修饰在基础课本中，并且在更详细说明的专著中，以及在大量的研究文献中进行了充分地说明，并且它们是本领域技术人员熟知的。应当理解的是在给定多肽中的数个位点上可以相同或不同程度地存在同一种类型的修饰。同样，给定的多肽可以包含多种类型的修饰。修饰可以发生在多肽中的任何位置，包括肽主链、氨基酸侧链、以及氨基或羧基端。修饰包括，例如，乙酰化、酰基化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷或核苷衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸酯的形成、甲酰化、Y-羧基化、糖基化、GPI锚定(anchor)的形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蘧酰化、氧化、蛋白水解处理、磷酸化、异戊二烯化、外消旋、糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的Y -羧基化、羟基化和ADP-核糖基化、硒基化、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸添加到蛋白上如精氨酸化和泛素化。多肽可以是支链的或含有或不含有支链的环状的。环状的、支链的和具有支链的环状多肽可以由翻译后的天然过程产生，也可以完全由合成方法制造。“分离的”是指“通过人工”从其天然状态改变，S卩，如果它在自然界中发生，则将其改变或从其原始环境中移开，或两者。例如，天然存在于生命有机体中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，然而从其天然状态的共存物中分离的相同的多核苷酸或多肽是“分离的”(如在本文中使用的术语)。类似地，如在本文中使用的术语“合成的”序列，是指合成产生的以及未与天然来源直接分离的任何序列。“重组体”是指通过将来自一个物种的基因移植或剪接到不同物种的宿主有机体的细胞中而制备的基因工程化的DNA。这种DNA成为宿主基因结构的一部分并被复制。如在本文中使用的术语“编码多肽的多核苷酸”包括含有编码本发明的多肽的序列的多核苷酸，具体地是具有如在SEQ ID No:2中给出的氨基酸序列的高卢蜜环菌的原伊鲁烯合酶。该术语还包括含有编码多肽的单个连续区或不连续区(例如，被结合的噬菌体或插入序列中断或编辑)连同也可以包含编码和/或非编码序列的另外的区的多核苷酸。如在本文中使 用的术语“一种或多种变异体”是分别地与参照多核苷酸或多肽不同的，但保留了基本性质的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型变异体在核酸序列上与另一种参照多核苷酸不同。变异体的核苷酸序列的改变可以或不可以改变由参照多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸的改变可以导致由参照序列编码的多肽中的氨基酸取代、添力口、缺失、融合、和截短(如下讨论的)。多肽的典型变异体在氨基酸序列上与另一种参照多肽不同。通常地，差异是有限的使得参照多肽和变异体的序列整体上非常相似，并且在许多区域上完全相同。变异体与参照多肽在氨基酸序列上能够以任意组合形式相差一个或多个取代、添加、缺失。取代的或插入的氨基酸残基可以或不可以是由遗传密码编码的。多核苷酸或多肽的变异体是可以天然发生的，如等位基因变异体，或它可以是未知天然发生的变异体。多核苷酸和多肽的非天然发生的变异体可以通过诱变技术、通过直接合成以及通过本领域技术人员已知的其他重组方法来制备。此外，目前将术语“宿主细胞”定义为已被转化或转染的细胞，或能够被外源性多核苷酸序列转化或转染的细胞。根据本发明的实施方式，分离的多核苷酸由SEQ ID No:1或SEQ ID No: 14组成并且编码具有原伊鲁烯合酶活性的多肽。SEQ ID No:1表示基因组序列，而SEQ ID No:14表示 cDNA。如随附的序列表中公开的SEQ ID No:1和SEQ ID No: 14分别是由高卢蜜环菌鉴别和表征的原伊鲁烯合酶的基因组序列和cDNA。应当理解的是具有至少90%的序列一致性，以及甚至在其他蜜环菌种类中可以发现的它们的变异体，也是适宜的并且是本发明的一部分，因为使用这种新鉴别的原伊鲁烯合酶，通过类似的原伊鲁烯合酶提供了有价值的工具，即通过序列比较和随后的酶学测试可以鉴别与SEQ ID No:1或SEQ ID No: 14稍有区别的原伊鲁烯合酶。本发明还涉及包含本发明的一种或多种多核苷酸的载体、用本发明的载体基因工程化的宿主细胞以及通过重组技术生产本发明的多肽。还可以使用来源于本发明的DNA构建体(construct)的RNA序列,使用无细胞翻译系统来生产这类多肽。因此并且另外地，本发明还涉及包含编码具有原伊鲁烯合酶活性的多肽的如上文定义的核酸序列的载体，该核酸序列可操作地连接至由载体转化的宿主细胞识别的调控序列上。根据本发明的一个方面，载体是表达载体，并且根据另一个方面,载体能够以质粒、粘粒(cosmid)、噬菌体、脂质体、或病毒的形式存在。对于重组体生产而言，宿主细胞可以被基因工程化以结合本发明的表达系统或它们的部分或多核苷酸。将多核苷酸引入宿主细胞中可以通过在许多标准实验手册中描述的方法实现，例如 Davis et al. , Basic Methods in Molecular Biology, (1986),和 Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)。因此，根据本发明的多核苷酸，可以例如包含在将稳定地转化/转染到宿主细胞中的载体中。在该载体中，本发明的多核苷酸在诱导性启动子的调控下，使得该基因/多核苷酸的表达可以是特异性靶向的，并且，如果希望的话，该基因能够以这种方式过表达。很多种表达系统可 以用于生产本发明的多肽。这些载体，除了别的之外，还包括染色体载体、游离型载体、以及源于病毒的载体，例如，来源于细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母游离基因(yeast episome)、插入元件(616!116111:)、酵母染色体元件、病毒的载体，以及来源于它们的组合的载体，如来源于质粒和噬菌体基因元件的载体，如粘粒和噬菌粒。表达系统构造物可以包含调控以及引起表达的调控区。通常地，适宜在宿主中保持、增殖、或表达多核苷酸和/或表达多肽的任何系统或载体可以用于这个方面的表达。适当的DNA序列可以通过多种已知的和常规的技术中任何一种插入表达系统中,像例如,在Sambrook等人中提出的那些(参见上文)。由以上可见，本发明还涉及由选自由以下各项组成的组中的氨基酸序列组成的分离的肽a)在SEQ ID NO:2中示出的氨基酸序列；b)在SEQ ID N0:2中示出的氨基酸序列的等位基因变异体的氨基酸序列，其中，所述等位基因变异体由在严格条件下与SEQ ID No:l或SEQ ID No: 14中示出的核酸分子的相反链杂交的核酸分子编码；c)在SEQ ID N0:2中示出的氨基酸序列的直系同源体(ortholog)的氨基酸序列，其中所述直系同源体由在严格条件下与在SEQ ID No:1或SEQ ID No: 14中示出的核酸分子的相反链杂交的核酸分子编码；以及d)在SEQ ID NO: 2中示出的氨基酸序列的片段，其中所述片段包括至少10个连续
的氨基酸。同样，本发明涉及包含如上文定义的载体的宿主细胞，具体地为选自由以下组成的组中的宿主细胞包括酵母的真菌、细菌、昆虫、动物、和植物细胞。根据本发明的另一个方面，使用了宿主细胞，其中编码具有原伊鲁烯合酶活性的多肽的核酸适合各宿主细胞的密码子使用。根据本发明的另一个实施方式，宿主细胞是同担子菌(homobasidiomyceste),具体地是蜜环菌属的同担子菌，具体地是高卢蜜环菌(Armillaria gallica)、蜜环菌(Armillaria mellea)、奥氏蜜环菌(Armillaira ostoyae)、和蜜环菌属中的其他成员。本发明的又一个方面涉及用于生产蜜环菌戊素的方法，包括以下步骤a、在允许生产蜜环菌戊素的适宜营养条件下使如上文定义的宿主细胞生长；以及b、从宿主细胞或其生长的培养基中分离所述蜜环菌戊素。根据本发明的一个方面，蜜环菌戊素选自蜜环菌戊素1、蜜环菌乙素(亮菌甲素，armillaridine)、蜜环菌戊素A、蜜环菌戊素F、蜜环菌戊素B、蜜环菌戊素K、扁枝衣酸蜜环基酯(armillyl evernitate)、蜜环菌甲素(31'111；[1131'；[11)、蜜环菌醇(31'的111；
从实施方式和附图的说明中得到另外的优点。不言而喻地，在不偏离本发明的范围的情况下，上述特征和以下还将解释的特征不仅能够以各自特定的组合使用，而且也能够以其他组合或它们自身地使用。
在附图中示出了并在以下描述中更详细地解释了本发明的一些实施方式。在附图中图1示出了蜜环菌戊素I生物合成的方案，包括二磷酸法呢基酯环化成6-原伊鲁烯、氧化反应、以及侧链连接；图2是浸在培养物有机提取物中的高卢蜜环菌菌株FU02472的HPLC分析。使用可用的标准，将观测到的化合物峰中的两个鉴别为蜜环菌戊素I和蜜环菌乙素；图3是用于证实在大肠杆菌中表达的Prol克隆具有原伊鲁烯合酶活性的非放射性和放射性测试。Α/B)气相色谱示出了在保留时间8. 77分钟下具有特征质谱的峰。A)表达Prol的大肠杆菌克隆的提 取物。B)高卢蜜环菌菌丝体的提取物。C-F)放射性TLC (薄层色谱)测定虚线/点线是起始，虚线是溶剂前沿。C)大肠杆菌pUC19阴性对照。D)用[1-3HJ-GGPP (二萜烯合酶的底物)温育的大肠杆菌Prol克隆。E)用[1」H]-FPP温育的大肠杆菌Prol克隆。F)高卢蜜环菌，阳性对照；图4是真菌倍半萜合酶的推测的氨基酸序列比对。对比了高卢蜜环菌原伊鲁烯合酶(克隆 Prol;SEQ ID No:2)、灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)衣兰油烯合酶(Cop3 ;SEQID如12〃(0 3〃)和(0 5 (具有尚未知晓产物的倍半萜合酶；SEQ ID No: 13〃Cop5〃)的序列。黑框表示三种序列中相同的残基；灰框表示三种序列中两种序列相同的残基。B)示意性地示出了具有显示为黑框的外显子和保守的DEXXD和NDxxSxxxE基序的高卢蜜环菌原伊鲁烯合酶的基因组序列。图5是通过DNA印迹杂交确定高卢蜜环菌原伊鲁烯合酶的基因拷贝数。在BamHI和EcoRI泳道中可观察到一条明显的条带(这两种酶在基因组克隆中都没有靶向部位)，然而在HindIII泳道中可观察到二条条带(在克隆中存在二个靶向部位，相距85bp)。在图1中，示出了蜜环菌戊素I生物合成的似乎合理的方案，包括将二磷酸法呢基酯环化成6-原伊鲁烯、氧化反应、和侧链连接。
具体实施例方式实施例1 :蛋白提取物的产牛高卢蜜环菌菌株FU02472是由在奥地利的Traunsee附近收集的担子果建立的，并在23° C下以及在140rpm的搅拌下，在浸在多个批次的包含200mL的YMG培养基500mL的Erlenmeyer摇瓶中的培养物中增殖。通过过滤从培养肉汤中获得菌丝体，用液氮快速冷冻并存储在-80° C下。连同Gateway 相容载体pDEST14 (Invitrogen) 一起，大肠杆菌菌株 TOPlO (Invitrogen, Karlsruhe,德国)用于克隆，大肠杆菌菌株 BL21 (DE3) CodonPlus(Agilent, Karlsruhe,德国)用于异源蛋白表达。为了生产来自蜜环菌的蛋白提取物，将高卢蜜环菌细胞培养物在用液氮冷冻的研钵中磨碎。将五倍体积的提取缓冲液(50mM的MES、20mM的MgCl2、5mM的2-巯基乙醇、10%(v/v)丙三醇和O. lg/g的菌丝体PVPP,pH6. 5)加入粉末中。在用Ultraturrax (12，OOOrmp持续I分钟)另外地处理后，通过离心净化蛋白提取物(在4° C下5，OOOrmp持续10分钟)。通过Quick Start Bradford Protein Assay (Biorad)来测定蛋白质的浓度。所有蛋白质
定量测定进行三次。通过将培养的细胞颗粒再溶解于所述的提取缓冲液中来制备大肠杆菌蛋白提取物，并且在持续冷却下通过两轮微流化器处理将细胞溶解。使用处于测定缓冲液(50mM的M0PS、20mM的MgCl2、5mM的2-巯基乙醇，pH7. 2)中的[1- ]-二磷酸法尼基脂(FPP) (20Ci/mmol) (Biotend)来测定原伊鲁烯合酶的活性。用500nM的[1-3H] -FPP持续2分钟随后用乙酸乙酯冷激来进行标准原伊鲁烯合酶活性的测定。然后在放射性TLC读取器(Raytest, Straubenhardt)中分析之前,将部分有机提取物点样到硅胶TLC板上，并使用9:1的环己烷乙酸乙酯作为溶剂进行分离。为了确定Km值，通过用IOOmM的EDTA (最终浓度)冷激来中止反应，随后用正戊烷萃取，通过硅胶柱色谱(层析,chromatography)纯化以及通过液体闪烁计数定量。所有动力学活性测定均进行三次。溶剂提取物的质谱分析在安装有Rxi -5ms (O. 25mm ID,长30m)柱(Restek)的QP2010S四级杆质谱仪(Shimadzu)上进行，使用以下温度程序80° C持续20分钟，随后以15° C/min的速率将柱加热至300° C，将300° C的最终恒定温度保持4分钟。在IkeV下通过电离完成碎片化。实施例2 cDNA库的构律和测序根据生产商的方案，使用氯化铯密度梯度以及通过Oligotex (Qiagen, Hilden)纯化的高卢蜜环菌菌株FU02472的mRNA，来构建高卢蜜环菌CloneMiner cDNA库(Invitrogen)0在含有50 μ g/mL卡那霉素的2YT-琼脂平板上选择重组大肠杆菌，将2800个随机挑取的克隆转移至包含200 μ L的2ΥΤ培养基/孔的96-孔微量滴定板中，使用50 μ g/mL卡那霉素进行选择。在37° C下在160rpm持续摇动下温育这些板约12小时。使用正向引物 5’-CTC GCG TTA ACG CTA GCA TGG ATG-3’ (SEQ ID No:3)和反向引物 5’-GTGAGT CGT ATT ACA TGG TCA TAG CTG-3’ (SEQ ID No:4)直接从培养物中扩增高卢蜜环菌cDNAo 清洗 PCR 产物并在 Applied Biosystems3730DNA 分析仪上使用引物 5’-CGA CGG CCAGTC TTAAGC TCG GGC-3，(SEQ ID No:5)测序(Fraunhofer IME Aachen, Functional andApplied Genomics Group)。使用 CLC Combined Workbench3 软件(CLC bio)、LasergenePackage (DNASTAR) NCBI BLASTx、和 Local BLAST 来分析序列数据。.实施例3 :大肠杆菌中异源表达高卢蜜环菌原伊鲁烯合酶当cDNA测序鉴别潜在的萜烯合酶克隆时，在包含pDESTl目标载体的LR重组反应中使用相应的PENTRY载体。然后将得到的表达构建体引入大肠杆菌BL21(DE3)Codon plus细胞(Stratagene)中用于异源表达。在 Ferenbach 挡板烧瓶(Ferenbach-baffled flask)中培养重组细菌并且当OD6tltl达到0. 5时用ImM的IPTG诱变。在28° C下在160rpm下持续振荡下保持诱变的细菌持续8小时。然后通过离心收集细胞，重悬在原伊鲁烯测定缓冲液中，并使用微流化器(microfIuidizer)溶解。实施例4 :基因组DNA的分离和DNA印迹杂交使用溴化十六烷基三甲基铵(CT AB)法来分离高卢蜜环菌基因组DNA，并且适当时用50单位的BamH1、EcoRI或HindIII (NEB Biolabs)来消化120 μ g持续8小时。在恒定的50V下通过O. 7%琼脂糖凝胶电泳来将消化的DNA分级过夜，将其转移至带有正电荷的尼龙膜(Roche)上并与含有单链的鲑鱼精子DNA的Roti -Hybr1-Quiek(Roth)预杂交。使用针对探针 I 的正向引物 5’-CCT TCC TGA TAC TCT TGC CAA CTG-3’(SEQID No:6)和反向引物 5’-CCT CCT CCG TCG AGA CGT CCG AGT AC-3’ (SEQ ID No:7)，以及针对探针 2 的正向引物 5’-GTC ATC AAT CAT CCGGTT ATC AAA G_3’ (SEQ ID No:8)和反向引物 5’-CTT GGGCAT CAGCGT TAT CCA CCT C_3，(SEQ ID No:9)，通过PCR合成两个核酸探针(约 400bp)。根据生产商的建议，使用DecaLabel DNA标记试剂盒(Fermentas),用a -32P-dATP(HartmannAnalytic)来标记这些产物。 实施例5 :高卢蜜环菌原伊鲁烯合酶基因组克隆的分离在50-1 的反应中，使用正向引物 5’-GGG GAC AAG TTT GTA CAAAAA AGC AGG CTTCGA AGG AGA TAG AAC CAT GTC TCA ACG CATCTT CCT TCC TG-3’ (SEQ ID No: 10)，反向引物 5’-GGG GAC CAC TTTGTA CAA GAA AGC TGG GTT TAG AGA TGA MT CCG TCA ACA ATTTGAGG-3’ (SEQ ID No: 11)以及Hei’culase II Fusion DNA 聚合酶(Stratagene),通过扩增IOOng的高卢蜜环菌基因组DNA来分离包含高卢蜜环菌原伊鲁烯合酶基因的基因组克隆。如上所述，纯化PCR产物并测序。实施例6 :结果和讨论:通过由奥地利的·Traunsee附近收集的蘑菇种类建立细胞培养物(FU02472)，来分离并且表征推测的蜜蘑菇(honey mushroom)(高卢蜜环菌)原伊鲁烯合酶。在允许生产蜜环菌戊素的液体YM6. 3培养基中培养该培养物。在约500小时的发酵后，收获培养物并使用适当的参照物通过LC-UV-MS来测定蜜环菌戊素产物的曲线。由FU02472生产的主要蜜环菌戊素被鉴定为蜜环菌戊素I和蜜环菌乙素(参见图2)。通过在不同的时间点对培养物取样，随时间对蜜环菌戊素的积累曲线和原伊鲁烯合酶活性进行研究。通过将来自培养物中可溶性酶提取物与放射性标记的二磷酸法呢基酯共同温育来测试酶活性。然后通过放射性TLC来分析来自这些反应的有机提取物(参见图3)。在我们测试的全部粗蛋白提取物中观察到可变水平的原伊鲁烯合酶活性，产生了 Rf值为O. 7 (暂时鉴定为6-原伊鲁烯)的强非极性产物，以及Rf值为O.1的产物(暂时鉴定为法呢醇)。随后通过GC-MS来证实这两种产物的身份(参见下文)。热不能活化的对照部分不能将二磷酸法呢基酯转化为非极性产物。在185小时后在培养物中观察到最高的原伊鲁烯合酶活性，因此选择该时间点用于酶纯化。接下来，确定在可溶性蛋白部分中推测的原伊鲁烯合酶活性是否确实是由于在真菌提取物中存在的原伊鲁烯合酶活性。因此，用氚标记物标记(spike )冰冷的二磷酸法呢基酯并且使其与来自FU02472的可溶性蛋白提取物一起温育12小时。然后，通过放射性TLC和GC-MS分析放射性物质部分以证实Rf值以及产物的身份(identity)。提取产物的质谱产生 m/zl75 (100%)、119 (91%)、105 (59%)、133 (35%)、91 (40%)、189 (17%)、161 (15%)、和 147(14%)的离子，分子母体离子为m/z204 (24%)。观察到的碎片图谱与之前针对倍半萜6-原伊鲁烯的报道相匹配(参见图2)。出乎意料地，GC-MS分析没有显示7-原伊鲁烯的存在，表明如在最终的蜜环菌戊素最终产物中观察到的，发生了从6(7)至7(8)位置的烯丙基重排。类似的烯丙基重排已在用于将紫杉-4 (5),11 (12) - 二烯转化为紫杉-4 (20)，11 (12) - 二烯转化为紫杉-4 (5)，11 (12) - 二烯-5-醇的紫杉醇合成中进行了描述，该反应是由细胞色素P450依赖的单氧酶催化的(Jennewein et al.,2004)。因此，申请人提出，在蜜环菌戍素的生物合成期间，包括催化烯丙基重排和羟基化反应两者的类似的细胞色素P450依赖的单氧酶步骤。使用部分纯化的高卢蜜环菌原伊鲁烯合成酶、氚标记的二磷酸法呢基酯以及放射性TLC分析进行酶的进一步表征。这些实验显示二磷酸法呢基酯的Km为O. 53M。如预期的，发现酶活性完全取决于二价金属离子。当用MnCl2替换时5mM的MgCl2下降了 75%，则达到了最高的原伊鲁烯合酶的活性。最适宜的温度是22° C，且在>35° C时几乎完全失去活性。在50mM下测试了数个缓冲系统，在pH7. 2 (MOPS缓冲液)下具有最佳活性。在pH5. 8(MES缓冲液)和pH8. 5 (Tris缓冲液)下活性下降了 50%。该酶也对乙醇的存在非常敏感，当乙醇浓度低至5%时引起活性显著地降低。证实了将从真菌菌丝体中纯化高卢蜜环菌的原伊鲁烯合酶蛋白至均质性并通过Edman测序法测定N-端氨基酸序列的尝试不成功，但显示该酶可能是45kDa的单体。由FU02472菌丝体培养物构建cDNA库，并且对2592个随机选择的克隆的序列分析导致鉴别了与真菌萜烯合酶具有同源性的六种部分序列，例如，来源于灰盖鬼伞(Coprinopsiscinerea)。这些序列中的五种(两种全长cDNA、一种部分cDNA、以及两种包含内含子的克隆)示出了单个推测的原伊鲁烯合酶基因，称为Prol。剩余的序列，即约600bp长度的部分cDNA，表示独特的基因，称为Pro2。在可用于比较的约200个残基上，这两种推测的酶在氨基酸水平上显示了大约55%的一致性。对Prol的进一步分析显示了 1042bp长度的开放读码框，其编码具有347个氨基酸残基并且预测分子量为40kDa的蛋白。Prol多肽包含在适当方向上的DEXXD和NDxxSxxxE基序(如对于其他職烯合酶是特征性的)。使用Prol的氨基酸序列来搜索GenBank,显示与来自灰盖鬼伞属担子菌(basidiomycete Coprinopsiscinerea)的Cop3和Cop5倍半萜合酶具有紧密联系(分别为32. 6%和33%的一致性)。Cop3是衣兰油烯合酶，而Cop5的准确功能仍待确定。在来自子囊菌(ascomyceta)或植物的Prol与萜烯合酶之间没有观察到显著的同源性。在大肠杆菌中Prol 的异源表达导致具有足够的倍半萜合酶活性的粗制可溶性蛋白提取物在5分钟内将80%的O. 5M的氚标记的二磷酸法呢基酯底物转化成与6-原伊鲁烯(Rf = O. 7)的性质相匹配的产物。将相同的溶菌液与二磷酸香叶基香叶基酯一起温育没有产生大量的更低极性的产物(<1%)，并且当使用来源于空载体对照的大肠杆菌溶菌液时，二磷酸法呢基酯和二磷酸香叶基香叶基酯都没有转化为较低极性的产物(参见图3)。使用冰冷的二磷酸法呢基酯对异源萜烯合酶进行表征，用戊烷萃取并且通过GC-MS分析有机萃取物，显示形成了具有与天然原伊鲁烯合酶相同的保留时间和质谱的产物。使用1270全长的Prol cDNA克隆来设计可以扩增相应的基因组DNA序列的引物(图4)。对1645bp产物的分析显示存在八个内含子和九个外显子，一些短至50bp。之前对植物萜烯合酶基因的分析已显示很少的内含子。使用分别表示Prol克隆的5’和3’端的两种寡核苷酸探针的DNA印迹，显示在高卢蜜环菌基因组中仅存在一个拷贝的Prol基因(图5)。
权利要求
1.一种分离的多核苷酸，编码具有原伊鲁烯合酶活性的多肽并且包括选自由以下各项所组成的组中的序列 a)随附的序列表中SEQID No:1或SEQ ID No: 14 ; b)与SEQID No:1或SEQ ID No: 14互补的核酸序列； c)在严格条件下与a)和b)中定义的核酸序列或它们的互补链杂交的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，由编码具有原伊鲁烯合酶活性的多肽的所述 SEQ ID No:1 或 SEQ ID No: 14 组成。
3.一种载体，包含根据权利要求1或2所述的编码具有原伊鲁烯合酶活性的多肽的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接至可被用所述载体转化的宿主细胞识别的调控序列。
4.根据权利要求2所述的载体，其特征在于所述载体是表达载体。
5.根据权利要求2或3所述的载体，其特征在于所述载体以质粒、粘粒、噬菌体、脂质体、或病毒的形式存在。
6.一种分离的肽，由选自由以下各项所组成的组中的氨基酸序列组成 Ca)在SEQ ID NO:2中示出的氨基酸序列； (b)在SEQID NO:2中示出的氨基酸序列的等位基因变异体的氨基酸序列，其中所述等位基因变异体由在严格条件下与SEQ IDNckI或SEQ ID No: 14中示出的核酸分子的相反链杂交的核酸分子编码； (c)在SEQID N0:2中示出的氨基酸序列的直系同源体的氨基酸序列，其中所述直系同源体由在严格条件下与SEQ ID No:1或SEQ ID No: 14中示出的核酸分子的相反链杂交的核酸分子编码；以及 (d)在SEQID No:2中示出的氨基酸序列的片段，其中所述片段包括至少10个连续的氨基酸。
7.—种宿主细胞，包含根据权利要求2至4中任一项所述的载体。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞选自由包括酵母的真菌、细菌、昆虫、动物、和植物细胞组成的组。
9.根据权利要求7或8所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。
10.根据权利要求7至9之一所述的宿主细胞，其特征在于编码具有原伊鲁烯合酶活性的多肽的所述核酸适合各细胞的密码子使用。
11.根据权利要求7、8和9所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞是同担子菌。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞是蜜环菌(Armillaria)属的同担子菌，具体地是高卢蜜环菌(Armillaria galIica),和蜜环菌(Armillaria mellea)。
13.一种用于生产蜜环菌戊素的方法，包括以下步骤 a、在允许生产蜜环菌戊素的适宜营养条件下，使根据权利要求5至10中任一项所述的宿主细胞生长；以及 b、从所述宿主细胞或其生长培养基中分离所述蜜环菌戊素。
14.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述蜜环菌戊素选自蜜环菌戊素1、蜜环菌乙素、蜜环菌戊素A、蜜环菌戊素F、蜜环菌戊素B、蜜环菌戊素K、扁枝衣酸蜜环基酯、蜜环菌甲素、蜜环菌醇、蜜环菌戊素J、蜜环菌寅素、10- α -羟基-蜜环菌戊素、苔色酸蜜环基酯、蜜环菌戊素Ε、1-0-三氟乙酰基-蜜环菌戊素E、蜜环菌戊素H、5’ -O-甲基-melledonal、melledonal、arnamial、蜜环菌戍素 C、蜜环菌戍素 D、melledonal A、melledonal C、melIedonol ο
15.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于步骤a)和b)由以下步骤组成1、在适合的营养条件下使转化或转染的宿主细胞生长，以包含选自以下各项中的核酸序列a)来自随附序列表中的SEQ ID No:1或SEQ ID No: 14，b)与SEQ-1D No:1或SEQ IDNo: 14互补的核酸序列，以及c)在严格条件下与a)和b)中定义的核酸序列或它们的互补链杂交的核酸序列； i1、过表达所述核酸序列； ii1、从而在所述宿主细胞中增强蜜环菌戊素的生产，以及 iv、从所述宿主细胞或其生长培养基中分离所述蜜环菌戊素。
16.通过权利要求12至16中的一项所述的方法获得的蜜环菌戊素。
17.根据权利要求1或2中的任一项所述的多核苷酸、或根据权利要求3至5中的任一项所述的载体、或根据权利要求6所述的多肽用于生产蜜环菌戊素的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于通过编码原伊鲁烯合酶的多核苷酸的异源或同源过表达来生产蜜环菌戊素。
全文摘要
本发明涉及一种分离的多核苷酸，其编码具有原伊鲁烯合酶(protoilludene synthase)活性并且包含选自由以下各项组成的组中的序列的多肽a)随附序列表中的SEQ ID No:1或SEQ ID No:14；b)与SEQ ID No:1或SEQ ID No:14互补的核酸序列；c)在严格条件下与a)和b)中定义的核酸序列或它们的互补链杂交的核酸序列，并且涉及由所述分离的多核苷酸编码的多肽，以及它们用于生产蜜环菌戊素(melleolide)的应用。
文档编号C12N9/88GK103052709SQ201180037837
公开日2013年4月17日 申请日期2011年7月28日 优先权日2010年8月2日
发明者斯特凡·延内魏因, 贝内迪克特·恩格斯, 托尔斯滕·格罗特, 马克·施塔德勒 申请人:弗兰霍菲尔运输应用研究公司