一种2，3-环氧角鲨烯的生物合成方法
【专利摘要】本发明提供了一种2，3-环氧角鲨烯的生物合成方法，是同时在大肠杆菌（Escherichia?coli）中表达角鲨烯合成酶和角鲨烯环氧化酶，再将该大肠杆菌发酵制备2，3-环氧角鲨烯。本发明利用基因工程技术手段，构建了包含角鲨烯合成酶基因和角鲨烯环氧化酶基因的大肠杆菌工程菌，实现角鲨烯合成酶和角鲨烯环氧化酶在大肠杆菌体内的共表达，其中角鲨烯合成酶可以在大肠杆菌体内催化生产角鲨烯，而角鲨烯环氧化酶可以将底物角鲨烯催化合成2，3-环氧角鲨烯。利用该大肠杆菌工程菌能够大大提高2，3-环氧角鲨烯的产量，也为原人参二醇及羊毛甾醇等天然化合物的大规模工业化生产奠定了基础。
【专利说明】一种2，3-环氧角鲨烯的生物合成方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种2，3-环氧角鲨烯的生物合成方法，以及本发明方法所用到的生产菌株。
【背景技术】
[0002]2，3-环氧角鲨烯是角鲨烯烃角鲨烯环氧化酶(角鲨烯单加氧酶)催化后的产物，系由角鲨烯转变成原人参二醇和羊毛留醇的中间产物。原人参二醇是传统名贵药材人参和西洋参的主要活性成分，具有广泛的抗肿瘤作用；而留醇生物体合成也对高血脂引起的心血管疾病和真菌感染皮肤病的治疗有着十分显著的疗效。因此寻求一种能够大量生成2，3-环氧角鲨烯的方法对于大量合成原人参二醇或羊毛留醇有着重要意义。
[0003]2，3_环氧角鲨烯属于植物三萜皂苷类化合物和留醇类化合物代谢流的中间产物，并不会在细胞内大量积累，因此传统的植物提取方法对于大规模生产2，3-环氧角鲨烯是不可行的。随着基因工程技术的不断进步，近些年人们开始广泛寻求利用微生物合成2，3-环氧角鲨烯的方法，但未取得实质性进展。
【发明内容】
[0004]本发明为解决现有技术问题，提供了一种2，3-环氧角鲨烯的生物合成方法，并提供了用于生产2，3-环氧角鲨烯的重组菌株。本发明通过将角鲨烯合成酶和角鲨烯环氧化酶基因进行克隆及在大肠杆菌(Escherichia coli)中共表达,构建得到能合成2，3_环氧角鲨烯的重组菌株，为实现2，3-环氧角鲨烯的大规模工业化生产奠定了基础。
[0005]本发明一方面提供了一种2，3-环氧角鲨烯的生物合成方法，是同时在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达角S烯合成酶和角S烯环氧化酶,再将该大肠杆菌发酵制备2，3-环氧角鲨烯。
[0006]其中角鲨烯合成酶，其一种氨基酸序列为SEQ ID N0:1 ；
[0007]角鲨烯环氧化酶，其一种氨基酸序列为SEQ ID NO:3 ；
[0008]本发明的2，3-环氧角鲨烯的生物合成方法，具体步骤如下:
[0009]I)构建含角鲨烯合成酶基因的表达载体；
[0010]2)构建含角鲨烯环氧化酶基因的表达载体；
[0011]3)将I)和2)构建的表达载体转化入大肠杆菌，获得重组表达角鲨烯合成酶和鲨烯环氧化酶的工程菌；
[0012]4)发酵培养上述步骤3)得到的大肠杆菌工程菌，生产2，3-环氧角鲨烯。
[0013]其中，角鲨烯合成酶编码基因具有:
[0014](a)包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
[0015](b)与SEQ ID N0:2具有95%序列同一性的核苷酸序列。
[0016]角鲨烯环氧化酶编码基因具有:
[0017](a)包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；[0018](b)与SEQ ID N0:4具有95%序列同一性的核苷酸序列。
[0019]本发明的一个优选实施方案中，所述的携带有能表达角鲨烯合成酶基因的表达载体为质粒PACY⑶uet-Ι，表达角鲨烯环氧化酶基因的表达载体为质粒pET28a(+)。
[0020]本发明另一方面提供了一种生产2，3-环氧角鲨烯的大肠杆菌工程菌，其特征在于，携带有能表达角鲨烯合成酶基因和角鲨烯环氧化酶基因的表达载体。
[0021 ] 本发明的一个优选实施方案中，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
[0022]本发明利用基因工程技术手段，构建了包含角鲨烯合成酶基因和角鲨烯环氧化酶基因的大肠杆菌工程菌，实现角鲨烯合成酶和角鲨烯环氧化酶在大肠杆菌体内的共表达，其中角鲨烯合成酶可以在大肠杆菌体内催化生产角鲨烯，而角鲨烯环氧化酶可以将底物角鲨烯催化合成2，3-环氧角鲨烯。利用该大肠杆菌工程菌能够大大提高2，3-环氧角鲨烯的的产量，也为原人参二醇及羊毛留醇等天然化合物的大规模工业化生产奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1:本发明使用的SQS-pACY⑶uet-Ι质粒的遗传图谱。
[0024]图2:BL21-SQS菌体胞内蛋白SDS-PAGE电泳检测图。
[0025]其中:泳道I为BL21-pACYCDuet-l (阴性对照)菌体胞内蛋白；泳道2为BL21-SQS菌体胞内蛋白；箭头所指条带为角鲨烯合成酶。
[0026]图3:BL21-SQS菌体胞内代谢产物HPLC分析图谱。
[0027]其中:A为角鲨烯标准品分析图谱；B为BL21-SQS菌体胞内代谢产物分析图谱；箭头所指的峰表明菌体胞内代谢产物中含有角鲨烯。
[0028]图4:BL21-SQS菌体胞内代谢产物MS质谱分析图谱。
[0029]其中:A为角鲨烯标准品分析图谱；B为BL21-SQS菌体胞内目标产物分析图谱；箭头所指的峰表明目标产物为角鲨烯。
[0030]图5:SE-pET28a(+)质粒图谱。
[0031]图6:BL21-SE菌体胞内蛋白SDS-PAGE电泳检测图。
[0032]其中:泳道I为蛋白质Marker ;泳道2为BL21/pET28a(+)(阴性对照)菌体胞内蛋白；泳道3为BL21-SE菌体胞内蛋白。
[0033]图7:BL21-SE菌体细胞裂解液体外测活反应产物LC-MS检测图谱。
[0034]其中:图7-A与7-C为环氧角鲨烯标准品分析图谱，图7-B与7_D为BL21-SE菌体细胞裂解液体外测活反应产物；箭头所指的峰表明目标产物为环氧角鲨烯。
[0035]图8 =BL-SQS-S`E菌体胞内蛋白SDS-PAGE电泳检测图。
[0036]其中:泳道M 为蛋白质 Marker ;泳道 1，2 为 BL21/pACYCDuet_l/pET28a(+)(阴性对照)菌体胞内蛋白；泳道3，4为BL21-SQS-SE菌体胞内蛋白；箭头所指处即为重组表达的角鲨烯合成酶和角鲨烯环氧化酶。
【具体实施方式】
[0037]下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。
[0038]实施例1角鲨烯合成酶表达载体的构建
[0039]将印度人参基因组中的角鲨烯合成酶基因(GenBank Accession No?⑶732820)依据大肠杆菌密码偏爱进行密码子优化，优化后的角鲨烯合成酶基因序列为SEQ ID N0:2，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，由上海英潍捷基生物科技有限公司合成。
[0040]设计基因片段两边酶切位点Nco I，EcoRI。分别利用引物F:5，-CATGCCATGGGCACCCTGCGTGCAAT-3，和 R: 5 ’ -CCGGAATTCTTAATTCGGCTCGCTGCGAATCA-3，进行 PCR 扩增，PCR 扩增条件:95°C, IOmin ；95°C,30S ；55°C,30S,30 个循环；72°C, 1.5min ；72。。，IOmin。
[0041]将PCR扩增产物与大肠杆菌表达质粒pACYCDuet-1，经Nco I和EcoRI双酶切，37°C酶切过夜后，酶切产物琼脂糖胶回收纯化。以酶切PCR产物与酶切质粒pACYCDuet-1摩尔浓度6:1的设计连接体系，加入Iul T4连接酶，22°C连接4h，将连接产物加入50ul大肠杆菌DH5a感受态细胞中，冰浴30min，42°C热击90s转化。加入Iml LB培养基，37°C复壮Ih,收集菌体涂于氯霉素抗性筛选LB平板中，37°C培养过夜。隔日菌落PCR挑选阳性转化子，序列分析正确后，新质粒命名为SQS-pACY⑶uet-1，质粒图谱如图1所示。
[0042]实施例2角鲨烯合成酶诱导表达及产物测定
[0043]将阳性转化子于LB培养基中，37 °C，200rpm培养8h，收集菌体，提质粒SQS-pACYCDuet-1，4°C 保存待用。
[0044]制备大肠杆菌E.coli BL21电转化感受态细胞，加入SQS-pACYCDuet-l质粒，混匀，冰浴放置30min，42°C热击90s转化。加入Iml LB培养基，37°C复壮lh，收集菌体涂于卡那霉素浓度为50ug/ml抗性筛选LB平板中，37°C培养过夜。菌落PCR验证目的基因SQS，将获得的重组菌株命名为大肠杆菌BL21-SQS。
`[0045]将重组菌株BL21-SQS在LB发酵培养基中37°C、220rpm发酵培养过夜；隔日转接新鲜LB培养基，37°C培养2h ;加终浓度为ImM IPTG，28°C诱导6h ;离心收集菌体，溶于400 u I超纯水中，超声破碎，SDS-PAGE分析检测重组菌胞内蛋白表达情况，实验结果如图2所示。已知角鲨烯合成酶蛋白分子量为45kDa，图3中重组菌胞内蛋白所在泳道2与阴性对照泳道I相比，在45kDa左右多出一条蛋白条带，即箭头所指位置，说明角鲨烯合成酶在重组大肠杆菌BL21-SQS胞内得到了有效表达。
[0046]取发酵液1L，离心收集重组菌体；加入200ml20%K0H乙醇溶液(乙醇与水的体积比为70:30)，501:、200印111裂解411 ;加入等体积正己烷，25°C、200rpm混匀Ih ;室温静置20min，取上清浓缩。HPLC检测条件:流动相甲醇:乙腈体积比为60:40，柱温30°C，流速
1.0ml/min。实验结果如图3所示，A为角鲨烯标准品，在13.5min出现一 HPLC吸收峰，B为重组菌体胞内代谢产物，在相同的时间也出现了一吸收峰(即箭头所指位置)，说明重组菌体胞内代谢产物中可能存在角鲨烯。进一步将上述两个HPLC吸收峰分别进行MS质谱分析，结果如图4所示，重组菌体胞内目标产物(B图)的分子量与角鲨烯标准品(A图)的分子量相同，说明该目标产物就是角鲨烯，从而也说明本发明构建的大肠杆菌工程菌株BL21-SQS可以在体内合成天然产物角鲨烯。多个重组菌的表达产物分析结果也证明了本发明方法的可靠性。
[0047]实施例3角鲨烯环氧化酶表达载体构建[0048]将荚膜甲基球菌基因组中的角鲨烯环氧化酶基因DDBJ (GenBank AccessionN0.AAU91076)依据大肠杆菌密码偏爱进行密码子优化，优化后的角鲨烯环氧化酶基因序列为SEQ ID NO: 4，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4由金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0049]设计基因片段两边酶切位点EcoRI，Sal I，分别利用引物F:5’ -CCGGAATTCTTAATACGACTCACTATAGGGG-3’ 和 R:5’ -CAAGTCGACTTACTTCGCACGCAGAGCTTGA-3’ 进行 PCR 扩增，PCR扩增条件:95°C，IOmin ；95°C，30S ；55°C, 30S, 30 个循环；72°C, 1.5min ；72°C, IOmin0
[0050]将PCR扩增产物与大肠杆菌表达质粒pET28a( + )，经EcoRI和Sal I双酶切，37°C酶切过夜后，酶切产物琼脂糖胶回收纯化。以酶切PCR产物与酶切线性化质粒pET28a ( + )摩尔浓度6:1的设计连接体系，加入Iul T4连接酶，22°C连接4h，将连接产物加入50ul大肠杆菌DH5a感受态细胞中，冰浴30min，42°C热击90s转化。加入Iml LB培养基，37°C复壮Ih,收集菌体涂于卡 那霉素抗性筛选LB平板中，37°C培养过夜。隔日菌落PCR挑选阳性转化子，经验证序列正确后，将新质粒命名为SE-pET28a ( + ),质粒图谱如图5所示。
[0051]实施例4角鲨烯环氧化酶的诱导表达与产物测定
[0052]将阳性转化子接种于LB培养基中，37 °C，200rpm培养8h，收集菌体，提质粒SE-pET28a(+)，转化大肠杆菌E.coli BL21 ;菌落PCR验证正确后，将获得的重组菌株命名为大肠杆菌BL21-SE。
[0053]将大肠杆菌BL21-SE接种至5ml含卡那霉素浓度为50ug/ml的LB液体培养基，37°C过夜培养；将菌液按1% (v/v)比例转接至上述新鲜的LB液体培养基，37°C、220rpm培养2h ;加入IPTG至终浓度为luM，28°C诱导6h ;收集Iml菌夜，蒸馏水洗2次；超声破碎，SDS-PAGE分析检测大肠杆菌BL21-SE胞内蛋白表达情况。结果如图5所示，已知角鲨烯环氧化酶蛋白分子量为48kDa，图6中BL21-SE胞内蛋白所在泳道3与阴性对照泳道2相比，在45-50kDa之间有一条变浓的带，即箭头所指位置，从而说明角鲨烯环氧化酶在大肠杆菌BL21-SE胞内得到表达。
[0054]为了进一步证明本发明构建的大肠杆菌BL21-SE重组表达的角鲨烯环氧化酶具有活性，将BL21-SE细胞破碎后直接用于酶反应检测，具体做法如下:离心收集剩余IL大肠杆菌 BL21-SE 菌体，加入 IOmL 缓冲液(20mM Tris-HCl，Trition X-1000.1%，ρΗ7.4)，超声波破碎细胞，得细胞破碎液；具体酶活反应体系为:细胞破碎液4ml，NADPH终浓度ImM，FAD终浓度ImM，TritionX-1OO终浓度0.5%，角鲨烯(squalene)终浓度15uM ;将上述反应体系在25°C条件下处理30min，然后加入等体积的正己烷萃取，25°C、200rpm混合Ih ;室温静置20min，取上清液浓缩；将浓缩后的上清液进行质谱检测。结果如7-A、7-B所示，所述上清液在6.55min出现了与2，3环氧角鲨烯标准品分子量同为449的峰(箭头所指处)，即为2，3-环氧角鲨烯加钠离子后的分子量，同时图7-C、7-D所示2，3-环氧角鲨烯标准品和上清液6.55min时的列峰图中也都有449这个峰值(箭头所指处)，说明上述反应体系中有2，3-环氧角鲨烯产物生成，从而说明本发明构建的大肠杆菌BL21-SE能重组表达角鲨烯环氧化酶，且该酶具有有效的酶活，能够催化角鲨烯生成2，3-环氧角鲨烯。
[0055]实施例5角鲨烯合成酶与角鲨烯环氧化酶共表达菌株的构建与诱导表达
[0056]制备大肠杆菌E.coli BL21电转化感受态细胞；加入实施例1所述质粒SQS-pACYCDuet-Ι和实施例3所述质粒SE_pET28a ( + )各3ul，冰浴放置lOmin，转入1_电转杯，1.8kv,电击转化；加入Iml提前预冷的LB培养基,将电转杯中的液体转入无菌的
1.5ml离心管，37°C，220rpm复壮Ih ;涂布于氯霉素与卡那霉素双抗性筛选的LB固体平板，37 °C过夜培养。隔日菌落PCR挑选阳性转化子，序列分析正确后，将获得的重组菌株命名为大肠杆菌BL21-SQS-SE。
[0057]将大肠杆菌BL21-SQS-SE接于5ml液体LB培养基中，37°C、220rpm过夜培养；将菌液按1% (v/v)比例转接至LB液体培养基，37°C、220rpm培养2h ;添加IPTG至终浓度为luM，20°C过夜诱导；收集Iml菌夜，蒸馏水洗2次；超声破碎；SDS_PAGE分析检测大肠杆菌BL21-SQS-SE胞内蛋白表达情况。pACYCDuet-1和pET28a ( + )是复制子不同的两个可共存质粒，其可分别诱导表达各自的蛋白，角鲨烯合成酶SQS和角鲨烯环氧化酶SE分子量大小相近，分别为45kD和48kD。电泳检测结果如图8所示，其中泳道I和2为阴性对照，泳道3和4泳道为大肠杆菌BL21-SQS-SE胞内蛋白，在箭头所指处即为重组表达的角鲨烯合成酶SQS和角鲨烯环氧化酶SE。
[0058]为了进一步证明本发明构建的大肠杆菌BL21-SQS-SE重组表达的角鲨烯合成酶和角鲨烯环氧化酶具有活性，能够在胞内催化合成2，3-环氧角鲨烯。取大肠杆菌发酵液1L，离心收集菌体，加入 IOmL 缓冲液(20mM Tris-HCl，Trition X-1000.1%，ρΗ7.4)，超声波破碎细胞，得细胞破碎液；然后向细胞破碎液中加入等体积的正己烷萃取，25 °C、200rpm混合Ih ;室温静置20min，取上清液浓缩；将浓缩后的上清液进行质谱检测。结果显示，所述上清液在6.55min出现了与2，3环氧角鲨烯标准品分子量同为449的峰，说明本发明构建的大肠杆菌BL21-SQS-SE胞内 有2，3-环氧角鲨烯产物生成，从而说明本发明构建的大肠杆菌BL21-SQS-SE重组表达的角鲨烯合成酶和角鲨烯环氧化酶具有有效的酶活，能够在胞内催化生成2，3-环氧角鲨烯。多个重组菌的表达产物分析结果也证明了本发明方法的可靠性。
【权利要求】
1.一种2，3-环氧角鲨烯的生物合成方法，其特征在于，所述的合成方法是同时在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达角S烯合成酶和角S烯环氧化酶,再将该大肠杆菌发酵来制备2，3-环氧角鲨烯。
2.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于所述的角鲨烯合成酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
3.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于所述的角鲨烯环氧化酶，其氨基酸序列为 SEQ ID NO:3 ；。
4.权利要求1所述的合成方法，其具体步骤如下: 1)构建含角鲨烯合成酶基因的表达载体； 2)构建含角鲨烯环氧化酶基因的表达载体； 3)将I)和2)构建的表达载体转化入大肠杆菌，获得重组表达角鲨烯合成酶和鲨烯环氧化酶的工程菌； 4)发酵培养上述步骤3)得到的大肠杆菌工程菌，生产2，3-环氧角鲨烯。
5.如权利要求4所述的合成方法，其特征在于所述的角鲨烯合成酶编码基因包含有: Ca)包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； (b)与SEQ ID N0:2 具有95%序列同一性的核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的合成方法，其特征在于所述的角鲨烯环氧化酶编码基因包含有: (a)包含SEQID N0:4所示的核苷酸序列； (b)与SEQID NO:4具有95%序列同一性的核苷酸序列。
7.如权利要求4所述的合成方法，其特征在于所述的步骤I)中的表达载体为质粒pACYCDuet-1。
8.如权利要求4所述的合成方法，其特征在于所述的步骤2)中的表达载体为质粒pET28a(+)ο
9.一种生产2，3-环氧角鲨烯的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述的大肠杆菌工程菌携带有表达角鲨烯合成酶基因和角鲨烯环氧化酶基因的表达载体。
10.如权利要求9所述的大肠杆菌工程菌，为大肠杆菌BL21。
【文档编号】C12N15/70GK103695493SQ201310724660
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】郭小飞, 黄亦钧, 王华明 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司