专利名称：一种竹节人参角鲨烯合成酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体说，是涉及在竹节人参中表达的角鲨烯合成酶基因及其应用。
背景技术：
k参iPanax ginseng C. A. Mey.)属于五加科人参属植物，是传统的名贵药材之一，人参属植物均具有较高的药用价值，如增强免疫力、抗肿瘤、抗动脉硬化及保护心肌作用等，其主要功能成分是人参皂苷，即达玛烷型四环三萜类或香树脂烷型五环三萜类化合物。至今人参皂苷尚未能人工合成。人参是多年生草本植物，其栽培和生长条件特殊， 对土壤和气候非常敏感，从而难以大规模地推广和应用。人参皂苷属于植物类异戊二烯代谢途径的次生产物一一三萜皂苷。三萜皂苷是由其前体角鲨烯通过不同方式环合形成的，而角鲨烯则是由法尼基二磷酸在角鲨烯合成酶 (squalene synthase, SQS)的催化作用下合成的,角S烯的合成是从类异戍二烯中央代谢途径进入三萜皂苷合成代谢支路的分支点，SQS是三萜皂苷生物合成途径公认的最为重要的的分支点关键酶。因此，该步骤是三萜皂苷次生代谢工程的关键调控靶点，通过提高角鲨烯合成酶的活性或含量，可以提高人参皂苷或其前体的含量。一般人参(A根的阜苷含量为2-7%,而竹节人参(/ : Japonicus C. A. Mey.)的皂苷含量高达15%以上，约为一般人参根的2_7倍的人参资源，是皂苷含量最高的人参属植物，为人参皂苷生物合成相关基因的克隆提供了极好的种质资源。现代生物技术的飞速发展，为利用生物工程技术手段进行人参药材品质的遗传改良提供了新的途径。利用现代基因工程技术克隆获得人参皂苷生物合成途径的关键酶基因，并导入到人参中，获得转基因的发根、细胞系或再生植株，进行大规模的培养，是提高人参药用活性成分皂苷的含量和拓展人参活性产物来源的最佳途径之一。在对现有文献的分析中，“The Plant Journal (植物期刊)，2002，32(6): 1033-1048” 和 “Arch Biochem Biophys (生物化学与生物物理学集刊)，1998，349 (2): 205-215”等报道从拟南芥和烟草中克隆了角鲨烯合成酶基因。但至今尚未有从药用植物竹节人参中分离克隆出全长角鲨烯合成酶基因的文献报道。由于这个基因编码的酶对于人参皂苷的生物合成有显著影响，因此这一步是利用基因工程技术来调控人参皂苷生物生成的关键切入点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种竹节人参角鲨烯合成酶基因。本发明的第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。本发明的另一个目的在于提供该基因的应用。
本发明提供的一种竹节人参角鲨烯合成酶基因，其核苷酸序列为如下(I)、(2)、
(3)或(4)所示
(1)、具有如SEQID No. I中第87-1352位所示的核苷酸序列；
(2)、在严格条件下与(I)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
(3)、如(I)所示的核苷酸序列中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代而产生的序列；
(4)、与(I)所示的核苷酸序列至少有70%同源性的核苷酸序列。所述的严格条件是在40_55°C条件下。所述的竹节人参角鲨烯合成酶基因，其编码的蛋白质的氨基酸序列为如下(I)或
(2)所示:
(1)、具有如SEQID No. 2所示的氨基酸序列；
(2)、在(I)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸衍生的蛋白质且与(I)的蛋白质具有相同的功能。一种重组载体，其所述的竹节人参角鲨烯合成酶基因的核苷酸序列。含有本发明的竹节人参角鲨烯合成酶基因全序列或部分片段的重组载体，如质粒和植物表达载体均属于本发明的保护范围。一种宿主细胞，其含有所述的竹节人参角鲨烯合成酶基因的核苷酸序列。含有本发明的竹节人参角鲨烯合成酶基因全序列或部分片段的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、烟草细胞、人参细胞或人参发根细胞。所述宿主细胞优选大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或人参发根细胞。所述的竹节人参角鲨烯合成酶基因在培育转基因人参植株中的应用。包括用所述的竹节人参角鲨烯合成酶基因序列遗传转化获得转基因人参植株。所述的竹节人参角鲨烯合成酶基因在培育转基因人参发根系中的应用。用所述的重组载体，如植物表达载体转化人参细胞；用所述含有该基因的农杆菌与人参细胞共培养， 得到转基因的人参发根系。本发明的竹节人参角鲨烯合成酶基因的应用，还包括用所述的人参发根细胞再生人参植株。本发明技术方案中涉及的概念具体内容如下
所述的竹节人参角鲨烯合成酶基因的DNA分子包括编码具有竹节人参角鲨烯合成酶活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO. I中从核苷酸第87-1352 位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55°C条件下与SEQ ID NO. I中从核苷酸第87-1352的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO. I中从核苷酸第 87-1352位的核苷酸序列。本发明分离出的竹节人参角鲨烯合成酶多肽包括具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有 SEQ ID NO. 2氨基酸序列的多肽。
4
本发明中的DNA分子包含所述的DNA分子中8_100个连续核苷酸。在本发明中， “分离的”、“纯化的"DNA是指，该DNA或片段己从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来， 还指该DNA或片段己经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且己经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。本发明中术语“竹节人参角鲨烯合成酶(或多肽)基因”指编码具有竹节人参角鲨烯合成酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. I中第87-1352位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO. I序列的编码框第87-1352位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO. I中第87-1352位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO. 2所述的序列。还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与 SEQ ID NO. I中从核苷酸第87-1352位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID NO. I中从核苷酸第87-1352位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。还包括能编码具有与天然的竹节人参角鲨烯合成酶相同功能的蛋白的SEQ ID NO. I中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30 个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。本发明中术语“竹节人参角鲨烯合成酶蛋白或多肽”指具有竹节人参角鲨烯合成酶活性的SEQ ID NO. 2序列的多肽。该术语还包括具有与天然竹节人参角鲨烯合成酶相同功能的SEQ ID NO. 2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为 1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代， 以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括竹节人参角鲨烯合成酶的活性片段和活性衍生物，还包括能够可操作地连于信号肽、启动子或者核糖体结合位点序列所组成的衍生物。本发明的竹节人参角鲨烯合成酶多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、 等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与竹节人参角鲨烯合成酶 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用竹节人参角鲨烯合成酶多肽的血清获得的多肽或蛋白。本发明中竹节人参角鲨烯合成酶保守性变异多肽指与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽可根据表I进行替换而产生。表I.保守性变异多肽中的取代残基
权利要求
1.一种竹节人参角鲨烯合成酶基因，其核苷酸序列为如下(I)、(2)、(3)或(4)所示(1)、具有如SEQID No. I中第87-1352位所示的核苷酸序列；(2)、在严格条件下与(I)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；(3)、如(I)所示的核苷酸序列中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代而产生的序列；(4)、与(I)所示的核苷酸序列至少有70%同源性的核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的竹节人参角鲨烯合成酶基因，其特征在于(2)中所述的严格条件是在40-55 °C条件下。
3.如权利要求I所述的竹节人参角鲨烯合成酶基因，其编码的蛋白质的氨基酸序列为如下(I)或(2)所示(1)、具有如SEQID No. 2所示的氨基酸序列；(2)、在(I)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或叠加一个或几个氨基酸衍生的蛋白质且与(I)的蛋白质具有相同的功能。
4.一种重组载体，其含有权利要求I所述的竹节人参角鲨烯合成酶基因的核苷酸序列。
5.—种宿主细胞，其含有权利要求I所述的竹节人参角鲨烯合成酶基因的核苷酸序列。
6.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、烟草细胞、人参细胞或人参发根细胞。
7.如权利要求I所述的竹节人参角鲨烯合成酶基因在培育转基因人参植株中的应用。
8.如权利要求I所述的竹节人参角鲨烯合成酶基因在培育转基因人参发根系中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种竹节人参角鲨烯合成酶基因及其应用，属于生物技术领域。填补了从我国传统名贵中药材竹节人参中分离克隆出角鲨烯合成酶基因的空白。本发明所提供的角鲨烯合成酶基因具有如SEQ ID No.1中第87-1352位所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。本发明提供的角鲨烯合成酶基因可以通过基因工程技术提高人参中主要活性成分皂苷的含量，可用于利用转基因技术提高人参皂苷含量的研究和产业化中，有助于人参药材的品质改良和促进人参皂苷药源匮乏问题的缓解，具有很好的应用前景。
文档编号C12N15/54GK102604975SQ20121007755
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者许明, 郑金贵, 黄志伟 申请人:福建农林大学