专利名称：一种野生竹节参的组织培养快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术，主要是一种野生竹节参的组织培养快速繁殖方法。
背景技术：
竹节参(Panax japonicus C.A.Mey.)为五加科人参属植物，别名竹节人参、北三七、白三七，是中华人民共和国药典(2000年版)收载品种。以根状茎及肉质根入药，性温、味甘、微苦。具有滋补强壮，散瘀止痛，止血祛痰等功效。根状茎用于活血止痛，跌打损伤，其药效优于三七；肉质根滋补强壮作用，可代替人参。常用于治疗病后虚弱，肺结核咯血、衄血、经闭、产后血瘀腹痛，寒湿脾痛，跌打损伤等症。属中药中的上品。现代药理研究表明，竹节参主要活性成分为皂苷类，尚含少量挥发油、多糖和氨基酸等。对中枢神经系统、免疫系统、心血管系统具有广泛且稳固的药理作用。因其内含多种人参皂苷和三七皂苷，被誉为“中草药之王”。
竹节参野生资源分布于河南、安徽、浙江、江西、湖北、广西、陕西、甘肃、四川、贵州、云南、西藏等省区。主要生长在海拔1000m以上的深山阔叶树林中。虽然分布面较广，但自然种群极为稀少。并且竹节参种子繁殖速度慢。由于竹节参具有独特的医疗效果，在民间广为应用，野生资源被严重破坏，现已濒临绝灭。
浙江省农科院科技人员在勘察浙江省内中药资源时，无意间在景宁县最高峰“上山头”发现了几株珍稀植物——竹节参。为有效保护和持续开发利用这一珍贵濒危药用植物，利用植物组织培养技术，在离体培养条件下，大量繁殖竹节参种苗，它具有材料用量少，繁殖时间短，繁殖系数高等优点。同时也将为景宁县开展药材种植提供资源，为山区农民脱贫致富提供一条有效的途径。
发明内容
本发明要解决上述现有技术的缺陷，提供一种野生竹节参的组织培养快速繁殖方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案。这种野生竹节参的组织培养快速繁殖方法，按如下步骤进行1.1)外植体的选取与灭菌取野生竹节参茎、叶，经表面灭菌处理，作为组培用的外植体；1.2)愈伤组织诱导培养在无菌条件下将茎切段(1cm长)、叶切片(1cm×1cmm)接种在诱导愈伤组织培养基上，通过诱导形成胚性愈伤组织；1.3)愈伤组织增殖培养胚性愈伤组织在增殖培养基上培养，形成胚性愈伤组织；1.4)胚状体分化培养胚性愈伤组织在分化培养基上培养，在胚性愈伤组织表面分化出胚状体；1.5)胚状体增殖培养带胚性愈伤组织的胚状体在增殖培养基中培养，进一步分化出胚状体；1.6)植株再生培养胚状体在再生培养基中培养，形成具根、茎、叶的的完整再生植株；1.7)植株壮苗培养幼小再生植株在壮苗培养基中进行培养，进一步长成3～5cm高的植株；1.8)植株的移栽3～5cm高的再生植株移栽于蛭石基质中。
本发明采用的组织培养的培养基，由基本培养基及不同组织培养阶段的培养基组成，基本培养基与各阶段培养基添加物含量为1)基本培养基选用MS或1/2MS培养基，蔗糖为20g/L或30g/L，琼脂为7～9g/L，pH5.6～5.8；2)愈伤组织诱导培养基MS+2，4-D 1.0mg/L+KT 0.0～KT 0.5mg/L+蔗糖30g/L；3)愈伤组织增殖培养基1/2MS+2，4-D 1.0mg/L+KT 0.2～1.0mg/L+蔗糖20g/L；4)胚状体分化培养基1/2MS+2，4-D 0.2～1.0mg/L+KT 0.2～1.0mg/L+蔗糖20g/L；5)胚状体增殖培养基1/2MS+2，4-D 0.0～0.2mg/L+蔗糖20g/L；6)植株再生培养基1/2MS+GA30.1～0.5mg/L+BA 0.1～0.5mg/L+蔗糖20g/L；7)植株壮苗培养基1/2MS+GA30.5～1.0mg/L+BA 0.5～1.0mg/L+蔗糖20g/L，1/2MS+GA30.1～0.5mg/L+IAA 0.1～0.5mg/L+蔗糖20g/L。
本发明中各组织培养阶段的培养条件是，培养温度为20±2℃，愈伤组织诱导培养、愈伤组织增殖培养阶段为自然散射光，胚状体分化培养、胚状体增殖培养、植株再生培养、植株壮苗培养阶段的光照光强为1500～2500Lx，光照时间为10～12h/d。
本发明有益的效果是1、提出的组织培养快速繁殖方法可从叶和茎愈伤组织中诱导出体细胞胚，并高频率再生植株(90％以上)，且试管苗生长速度快(接种后30d，株高达到5cm以上)，结果可为竹节人参的种苗工厂化生产提供技术支撑。
2、利用植物组织培养技术优势，在短期内快速大量繁殖竹节参组培苗，增殖速度快，生产周期短，繁殖系数高，可实行规模化生产，年组培苗生产能力培养室面积100平方米达100万苗以上，解决了竹节人参的资源不足的问题，为竹节参的产品深度系列开发提供种苗基础。
3、提出的组织培养快速繁殖方法得到的竹节参组培苗，遗传性状一致，克服了常规种子繁殖后代易变异的缺点。
4、提出的组织培养快速繁殖方法采用外植体材料少，可有效地挽救珍稀濒危植物，有利于保护野生资源，减少对自然资源的破坏。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步介绍但本发明的内容并不局限于此。
实施例1这种野生竹节参的组织培养快速繁殖方法，具体步骤如下1)外植体的选取与灭菌取野生竹节人参的茎，经表面灭菌处理，作为组培用的外植体；2)愈伤组织诱导培养在无菌条件下将茎切段(1cm长)接种在MS+2，4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L的诱导愈伤组织培养基上，通过诱导形成胚性愈伤组织；3)愈伤组织增殖培养胚性愈伤组织在1/2MS+2，4-D 1.0mg/L+KT 0.2mg/L+蔗糖20g/L的增殖培养基上培养，形成胚性愈伤组织；
4)胚状体分化培养胚性愈伤组织在1/2MS+2，4-D 1.0mg/L+KT 1.0mg/L+蔗糖20g/L的分化培养基上培养，在胚性愈伤组织表面分化出胚状体；5)胚状体增殖培养带胚性愈伤组织的胚状体在1/2MS+2，4-D 0.2mg/L+蔗糖20g/L的增殖培养基中培养，进一步分化出胚状体；6)植株再生培养胚状体在1/2MS+GA30.5mg/L+BA 0.5mg/L+蔗糖20g/L的再生培养基中培养，形成具根、茎、叶的的完整幼小植株；7)植株壮苗培养幼小植株在1/2MS+GA30.5mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L的壮苗培养基中进行培养，进一步长成3～5cm高的再生植株；8)植株的移栽3～5cm高的再生植株移栽于蛭石基质中。
该实施例中各组织培养阶段的培养条件是，培养温度为20±2℃，愈伤组织诱导培养、愈伤组织增殖培养阶段为自然散射光，胚状体分化培养、胚状体增殖培养、植株再生培养、植株壮苗培养阶段的光照光强为1500～2500Lx，光照时间为10～12h/d。
实施例2这种野生竹节参的组织培养快速繁殖方法，具体步骤如下1)外植体的选取与灭菌取野生竹节人参的叶，经表面灭菌处理，作为组培用的外植体；2)愈伤组织诱导与增殖培养在无菌条件下将叶切片(1cm×1cm)接种在MS+2，4-D1.0mg/L+KT 0.1mg/L+蔗糖30g/L的诱导愈伤组织培养基上，通过诱导形成胚性愈伤组织；3)愈伤组织增殖培养胚性愈伤组织在1/2MS+2，4-D 1.0mg/L+KT 1.0mg/L+蔗糖20g/L的增殖培养基上培养，形成胚性愈伤组织；4)胚状体分化培养胚性愈伤组织在1/2MS+2，4-D 0.2mg/L+KT 0.2mg/L+蔗糖20g/L的分化培养基上培养，在胚性愈伤组织表面分化出胚状体；5)胚状体增殖培养带愈伤组织的胚状体在1/2MS+蔗糖20g/L的增殖培养基中培养，进一步分化出胚状体；6)植株再生培养胚状体在1/2MS+GA 0.1+BA 0.1+蔗糖20g/L的再生培养基中培养，形成具根、茎、叶的的完整幼小植株；
7)植株壮苗培养幼小植株在1/2MS+GA 0.5+BA 1.0+蔗糖20g/L的壮苗培养基中进行培养，进一步长成3～5cm高的再生植株；8)植株的移栽3～5cm高的再生植株移栽于蛭石基质中。
该实施例中各组织培养阶段的培养条件是，培养温度为20±2℃，愈伤组织诱导培养、愈伤组织增殖培养阶段为自然散射光，胚状体分化培养、胚状体增殖培养、植株再生培养、植株壮苗培养阶段的光照光强为1500～2500Lx，光照时间为10～12h/d。
权利要求
1.一种野生竹节参的组织培养快速繁殖方法，其特征在于1.1)、外植体的选取与灭菌取野生竹节参的茎、叶，经表面灭菌处理，作为组培用的外植体；1.2)、愈伤组织诱导培养在无菌条件下将茎切段或叶切片接种在诱导愈伤组织培养基上，通过诱导形成胚性愈伤组织；1.3)、愈伤组织增殖培养胚性愈伤组织转接到增殖培养基上进行培养，再增殖出胚性愈伤组织；1.4)、胚状体分化培养将胚性愈伤组织在分化培养基上培养，在胚性愈伤组织表面分化出胚状体；1.5)、胚状体增殖培养带胚性愈伤组织的胚状体在增殖培养基中培养，进一步分化出胚状体；1.6)、植株再生培养胚状体在再生培养基中培养，形成具根、茎、叶的完整幼小植株；1.7)、植株壮苗培养幼小植株在壮苗培养基中进行培养，进一步长成3～5cm高的再生植株；1.8)、植株的移栽3～5cm高的再生植株移栽于蛭石基质中。
2.根据权利要求1所述的野生竹节参的组织培养快速繁殖方法，其特征在于所述的组织培养的培养基，包括基本培养基及不同组织培养阶段的培养基，基本培养基与各阶段培养基添加物含量为2.1)、基本培养基选用MS或1/2MS培养基，蔗糖或白糖为20g/L或30g/L，琼脂为7～9g/L，pH5.6～5.8；2.2)、愈伤组织诱导培养基MS+2，4-D 1.0mg/L+KT 0.0～KT 0.5mg/L+蔗糖30g/L；2.3)、愈伤组织增殖培养基1/2MS+2，4-D 1.0mg/L+KT 0.2～1.0mg/L+蔗糖20g/L；2.4)、胚状体分化培养基1/2MS+2，4-D 0.2～1.0mg/L+KT 0.2～1.0mg/L+蔗糖20g/L；2.5)、胚状体增殖培养基1/2MS+2.4-D 0.0～0.2mg/L+蔗糖20g/L；2.6)、植株再生培养基1/2MS+GA30.1～0.5mg/L+BA0.1～0.5mg/L+蔗糖20g/L；2.7)、植株壮苗培养基1/2MS+GA30.5～1.0mg/L+BA0.5～1.0mg/L+蔗糖20g/L，1/2MS+GA30.1～0.5mg/L+IAA0.1～0.5mg/L+蔗糖20g/L。
3.根据权利要求1所述的一种野生竹节参的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述的各组织培养阶段的培养条件是，培养温度为20±2℃，愈伤组织诱导培养、愈伤组织增殖培养阶段为自然散射光，胚状体分化培养、胚状体增殖培养、植株再生培养、植株壮苗培养阶段的光照光强为1500～2500Lx，光照时间为10～12h/d。
全文摘要
本发明涉及一种野生竹节参的组织培养快速繁殖方法，步骤如下1)外植体的选取与灭菌取野生竹节参茎、叶，经表面灭菌处理，作为组培用的外植体；2)愈伤组织诱导培养3)愈伤组织增殖培养，形成胚性愈伤组织；4)胚状体分化培养在胚性愈伤组织表面分化出胚状体；5)胚状体增殖培养，进一步分化出胚状体；6)植株再生培养，形成具根、茎、叶的的完整再生植株；7)植株壮苗培养；8)植株的移栽。本发明优点是1.可从叶和茎愈伤组织中诱导出体细胞胚，并高频率再生植株，且试管苗生长速度快。2.在短期内快速大量繁殖竹节参组培苗，增殖速度快，3.竹节参组培苗的遗传性状一致，克服了常规种子繁殖后代易变异的缺点。
文档编号C12N5/04GK1883259SQ20061005248
公开日2006年12月27日 申请日期2006年7月10日 优先权日2006年7月10日
发明者徐刚, 汪一婷, 牟豪杰, 吕永平, 陈剑平, 计东风, 洪林 申请人:浙江省农业科学院