20(R)－人参皂苷Rg3药用组合物水溶液及制备方法

专利名称：20(R)－人参皂苷Rg3药用组合物水溶液及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种人参皂苷药用组合物及其制备方法。
背景技术：
人参皂苷Rg3是存在于人参中的一种四环三萜类皂苷化合物，分子量为784.13，它又以20(R)-人参皂苷Rg3和20(s)-人参皂苷Rg3两种光学异构体形式存在，其中20(R)-人参皂苷Rg3化学性质稳定，不溶于水，而20(s)-人参皂苷Rg3化学性质不稳定，易溶于水，它们的结构式分别是 人们发现，20(R)-人参皂苷Rg3具有较强的抑制肿瘤和抗转移作用，但它又是一种不溶于水的物质，因此其口服制剂的生物利用度很低，极大地限制了其临床药效的发挥，同时也限制了非肠道给药途径。
为使20(R)-人参皂苷Rg3溶于水，人们对此进行了研究，如在2003年1月29日发明专利公报上公开的一种<人参皂甙Rg3羟丙基-β-环糊精包合物及制剂和制备方法>(申请号01119929.6)其主要内容是人参皂甙Rg3的羟丙基-β-环糊精包合物，它是由下述原料按下述重量比组成的，即人参皂甙∶羟丙基-β-环糊精＝1∶1～20；要制备方法是(1)将人参皂甙Rg3溶于有机溶剂中，(2)将羟丙基-β-环糊精溶于水中，(3)在强烈搅拌下将人参皂甙Rg3溶液缓慢滴加到含羟丙基-β-环糊精的水溶液中，全部加完后继续搅拌2～24小时，使用0.45μm微孔滤膜过滤，将滤液浓缩，除尽有机溶剂，加入注射水重新溶解，过0.22μm膜，滤液冷冻干燥，得疏松白色粉末，即为人参皂甙包合物。
它的不足之处是(1)包合物在制备过程中，将其反应液回收至原体积的1/3时，经测定仍有较多有机溶剂残留，而冷冻干燥对除去残留溶剂无效，因而该包合物粉末用于制备注射剂难于符合注射剂残留溶剂的限定标准。(2)包合物在制备过程中，由于残留有机溶剂的存在，有助于人参皂甙Rg3与羟丙基-β-环糊精以1∶1～200的比例形成溶于水的包合物，如果将残留有机溶剂真正除尽，则在上述比例范围内不能形成稳定的易溶于水的包合物，人参皂甙Rg3很快会从其包合物水溶液中析出沉淀，使得该包合物不能用于制备注射剂。(3)人参皂甙Rg3不能全部形成包合物，利用率仅为86％，使其作为注射剂的生产成本明显增高。

发明内容
本发明的目的在于提供一种产品成本低、易被人体吸收的20(R)-人参皂苷Rg3药用组合物和制剂以及它们的制备方法与医药用途。
本发明的主原料(简称原料)为20(R)-人参皂苷Rg3。本发明的辅原料(简称辅料)为A、B两类，A类为脱氧胆酸(钠)、十二烷基硫(磺)酸钠及精氨酸；B类为环糊精，其包括①环糊精及其衍生物，如聚合环糊精纳米微粒、聚合环糊精、支链环糊精，②β-环糊精及其衍生物，如β-环糊精、2，6-二甲基-β-环糊精、葡萄糖基-β-环糊精、纳米基-β-环糊精、磺丁醚β-环糊精、甲基-β-环糊精、不定位甲基化-β-环糊精，③羟丙基-β-环糊精及其衍生物，如2-羟丙基-β-环糊精、3-羟丙基-β-环糊精衍生物、2，3-二羟丙基-β-环糊精、2，3，6，-三羟丙基-β-环糊精，④羟乙基-β-环糊精；⑤环糊精及其衍生物混合辅料，由上述环糊精、β-环糊精、羟丙基和羟乙基-β-环糊精及其衍生物间的以不同组合混合形成的混合物。
本发明原料与辅料的重量比如下20(R)-人参皂苷Rg3辅料A或B①②⑤＝1∶1～300，20(R)-人参皂苷Rg3辅料B③④＝1∶100～400。
20(R)-人参皂苷Rg3药用组合物的制备方法(1)制原料液将原料20(R)-人参皂苷Rg3溶于混合有机溶剂中，制成0.1～5％的人参皂苷溶液，所用的混合有机溶剂及它们的比例如下1)氯仿∶乙酸乙酯∶乙醇(甲醇)∶水＝10～25∶30～45∶18～30∶5～15，下层；2)氯仿∶乙醇(甲醇)∶水＝70～60∶40～30∶10，下层；3)乙醇∶水＝90～95∶10～5；4)甲醇∶水＝85～90∶15～10；5)乙腈∶水＝40～60∶60～40；6)二氯甲烷∶乙醇(甲醇)∶水＝60～65∶40～35∶10；7)乙腈∶乙醇(甲醇)＝70～80∶30～20；8)二甲基亚砜∶水＝90～80∶10～20；9)丙二醇∶乙醇(甲醇)∶吐温80∶水＝40～50∶10～20∶1∶49∶29。
(2)制辅料液1)分别将上述A、B两类辅料溶于水中，制成0.1～30％的水溶液(a)，2)分别将上述B类③④组的辅料溶于水中，制成20～65％的水溶液(b)，(3)原料液加入到辅料液中1)将上述人参皂苷溶液一次性加入到温度为40～100℃的上述辅料水溶液(a)中并搅拌0.1～3小时，即可得到澄明液；或2)将上述人参皂苷溶液匀速滴加到温度为60～100℃的上述辅料水溶液(b)中，并搅拌至滴加人参皂苷溶液完毕后停止，即可得到澄明液。
(4)回收溶剂并制得药用组合物将由上述步骤(3)获得的澄明液在真空度0.01～0.08MPa、温度80～100℃条件下减压回收溶剂至原体积的2/3～近干，加水至原体积，溶解并减压回收溶剂至近干，再重复上述操作两次，最终加入注射用水或纯化水摇匀溶解，该水溶液即为20(R)-人参皂苷Rg3药用组合物溶液，其中，20(R)-人参皂苷Rg3与A、B①②⑤两类辅料分别制成的组合物溶液含原料0.5～10毫克/毫升；20(R)-人参皂苷Rg3与B类③④组辅料分别制成的组合物溶液含原料0.1～2毫克/毫升；经干燥如真空、喷雾或冷冻干燥可得到20(R)-人参皂苷Rg3水溶性药用组合物粉末，其干燥方法及干燥条件如下

用上面得到的20(R)-人参皂苷Rg3水溶性药用组合物作原料，可制备下述各种制剂1.口服及外用药制剂用A、B辅料与原料反应获得的20(R)-人参皂苷Rg3组合物溶液，经干燥后形成可溶于水的人参皂苷Rg3固体粉末，再与药学上可接受的载体配合，经制剂工艺可制成各种制剂如颗粒剂、片剂(普通片、分散片、缓释片、控释片等)、软(硬)胶囊、口服液、外用剂(贴剂、软膏、滴剂、气雾剂)。
2.注射剂用辅料A或辅料B③④与原料反应获得的20(R)-人参皂苷Rg3水溶性药物组合物溶液1)经超滤器或加入是其重量0.1％注射级活性炭混合均匀，于80℃保温30分钟后，用0.45μm滤膜过滤除热源，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌可制成注射液，或再经冷冻干燥后可制成冻干粉针剂或注射用无菌粉末。2)经减压回收溶剂及干燥(真空、喷雾或冷冻干燥)制成稳定的易溶于水的人参皂苷Rg3固体粉末，复溶后再制成冻干粉针剂或注射用无菌粉末。
上述20(R)-人参皂苷Rg3药用固体和液体组合物及其药物制剂具有抑制肿瘤生长和转移、与放化疗合并用药增效减毒、提高机体免疫功能、抗疲劳、改善记忆、外用消肿止痛及愈合伤口的作用。
本发明相比现有技术具有如下优点1.本发明制备的20(R)-人参皂苷Rg3组合物溶液经干燥后可得到完全溶解于水、不含残留有机溶剂的粉末，由此可制成符合《中华人民共和国药典》注射剂质量要求的冻干粉针注射剂，也可制成多种口服及外用药物制剂。
2.本发明制备的20(R)-人参皂苷Rg3组合物注射剂或口服制剂，均比现有口服制剂(商品名参一胶囊)的生物利用度显著提高前者经注射可100％进入动物及人体的血液中，其绝对生物利用度为100％，比现有口服制剂提高20-50倍；后者也比现有口服制剂的生物利用度提高10倍以上。
3.本发明制备的20(R)-人参皂苷Rg3可与辅料100％的形成组合物溶液，经干燥可制成冻干粉针剂，使20(R)-人参皂苷Rg3原料利用率达100％，其成本明显低于该成分的包合物冻干粉针剂的成本。
4.本发明制备的20(R)-人参皂苷Rg3组合物口服药物制剂，因其生物利用度提高可减半量服用即达到与现有胶囊剂相同或更好的疗效，使肿瘤患者医药费大幅度降低。
5.本发明制备的20(R)-人参皂苷Rg3组合物注射剂在大鼠及犬的肝脏、胃肠壁分布浓度较高，使其对消化道肿瘤及转移具有良好的治疗作用。


图1是20(R)-人参皂苷Rg3标准品高效液相色谱检测谱图。
图2是20(R)-人参皂苷Rg3与脱氧胆酸钠组合物高效液相色谱图。
图3是20(R)-人参皂苷Rg3标准品高效液相色谱图。
图4是20(R)-人参皂苷Rg3与十二烷基硫酸钠组合物高效液相色谱图。
图5是20(R)-人参皂苷Rg3标准品高效液相色谱图。
图6是20(R)-人参皂苷Rg3与2，3，6-三羟丙基-β-环糊精组合物高效液相色谱图。
图7是20(R)-人参皂苷Rg3标准品高效液相色谱图。
图8是20(R)-人参皂苷Rg3与β-环糊精组合物高效液相色谱图。
具体实施例方式
实施例1将1克20(R)-人参皂苷Rg3用氯仿-乙酸乙酯-乙醇-水(10∶30∶18∶5，下层液)溶解配成0.1％溶液；另取100g脱氧胆酸钠，用注射用水溶解并加热至40℃，配成30％的溶液。将配好的人参皂苷溶液加入到上述脱氧胆酸钠溶液中，搅拌3小时，得澄明的溶液组合物制备液；过滤，于真空度0.01MPa、温度100℃旋转蒸发器上减压回收溶剂至近干，加蒸馏水至原体积，溶解并回收溶剂至近干，再重复一次上述操作，至除尽有机溶剂。加注射用水至100毫升，即得20(R)-人参皂苷Rg3与脱氧胆酸钠形成的组合物溶液100毫升。经高效液相法测定该组合物溶液中人参皂苷Rg3含量为10毫克/毫升，见图1和2。
实施例2将0.5克20(R)-人参皂苷Rg3用氯仿-乙酸乙酯-乙醇-水(25∶45∶30∶15，下层液)溶解配成5％溶液；另取100g十二烷基硫酸纳，用注射用水溶解并加热至100℃，配成0.1％的溶液。将配好的人参皂苷溶液加入上述十二烷基硫酸纳水溶液中，搅拌0.1小时，得澄明的溶液组合物制备液；过滤，于真空度0.08MPa、温度80℃旋转蒸发器上减压回收溶剂至原体积1/4；加蒸馏水至原体积，溶解并回收溶剂至近干，再重复一次上述操作，至除尽有机溶剂，加纯化水至1000毫升，即得20(R)-人参皂苷Rg3与十二烷基硫酸纳形成的溶液组合物1000毫升。经高效液相法测定该组合物溶液中人参皂苷Rg3含量为0.5毫克/毫升，见图3和4。
实施例3将5克20(R)-人参皂苷Rg3用氯仿-乙醇-水(70∶30∶10，下层液)溶解配成0.1％溶液；另取500克2，3，6-三羟丙基-β-环糊精，加蒸馏水加热至60℃溶解，配成20％溶液。在搅拌条件下，将配好的人参皂苷溶液以10毫升/分匀速滴加到上述2，3，6-三羟丙基-β-环糊精溶液中，滴加完该溶液即停止搅拌。于真空度0.05MPa、温度100℃旋转蒸发器上减压回收近干，加蒸馏水至原体积，溶解并回收溶剂至近干，再重复一次上述操作。用2.5升注射用水溶解浓缩物，得到的水溶液即为20(R)-人参皂苷Rg3水溶性中间体。经高效液相法测定，该水溶性中间体含人参皂苷Rg3为2毫克/毫升，见图5和6。
实施例4将2克20(R)-人参皂苷Rg3用氯仿∶乙醇∶水(70∶30∶10，下层液)溶解配成5％溶液；另取600克β-环糊精，加蒸馏水加热至40℃溶解，配成30％溶液。在搅拌条件下，将配好的人参皂苷溶液以5毫升/分匀速滴加到β-环糊精溶液中，滴加完该溶液即停止搅拌。于真空度为0.04MPa、旋转蒸发器上减压回收近干，加蒸馏水至原体积，溶解并回收溶剂至近干，再重复一次上述操作，用20升注射用水溶解浓缩物，得到的水溶液即为20(R)-人参皂苷Rg3水溶性中间体。经高效液相法测定，该水溶性中间体含人参皂苷Rg3为0.1毫克/毫升，见图7和8。
实施例5～43


实施例44取实施例1制得的20(R)-人参皂苷Rg3组合物溶液100毫升，加入注射用水至1000毫升，再加0.1克针剂用活性炭混合均匀，于80℃保温30分钟后用0.45μm滤膜滤过除热原，无菌条件下用0.22μm微孔滤膜滤过除菌，于无菌条件下灌装至10ml管制无菌西林瓶中，装量每瓶约4.5～4.9ml∶5mg，并将装好后的西林瓶加半塞，置冻干机(LYO-5，上海产)盘上，关好门，开动冻干机，先冷冻至-40℃以下，保持4小时后，开动真空干燥，并按45℃～-30℃/4小时、-30℃～-20℃/4小时、-20℃～-15℃/2小时升华，再于15℃～30℃升温干燥4小时，即完成冷冻干燥后，压塞，轧铝盖，取样检测，合格后包装，即得1000支注射用冻干粉针剂(每支含Rg3 1毫克)。由实施例2-40均可按上述操作步骤进行，制得水溶性粉末。
实施例45取实施例20制得的20(R)-人参皂苷Rg3组合物溶液50升，置于双锥回转真空干燥箱(型号SZG-4500，常州产)的不锈钢干燥盘上，于80℃、1.3Pa真空度条件下进行真空干燥12小时，得水溶性粉末；或者将上述组合物溶液置于组合式喷雾干燥机(ZPG-105，常州产)的流化床干燥器中，在20℃下，用双咀组份喷咀以0.8公斤/小时速率将含有20％固形物的组合物溶液连续喷入到流化床中，流化气体输入温度150℃，喷入的量使液化床的温度达到75℃，可得100～250微米的得水溶性粉末55公斤；或者将上述干燥后的水溶性粉末复溶，再按实施例35冷冻干燥方法操作，即得冻干粉针剂10000支(每支5毫克)。
实施例46 20(R)-人参皂苷Rg3组合物颗粒剂体内提高生物利用度的试验我们比较测定了Beagle犬口服20(R)人参皂苷Rg3组合物颗粒剂与原料胶囊剂后的血药浓度(委托沈阳药科大学药物代谢与药物动力学实验室完成该项试验)，证明Beagle犬口服20(R)人参皂苷Rg3组合物制成的颗粒剂的血药浓度高于其20(R)人参皂苷Rg3原料制成的胶囊剂12～20倍，从而说明Rg3组合物颗粒剂在动物体内的生物利用度明显高于Rg3原料制成的胶囊剂。
给予Beagle犬口服实施例37制得的20(R)-人参皂甙Rg3组合物颗粒剂，测定了其生物利用度。生物样品的测定利用API 4000型质谱仪，采用液相色谱-串联质谱联用分析方法。7只犬口服给予5.6g人参皂甙Rg3与β-环糊精(1∶200)药用组合物(含Rg3 30mg)后血浆药物浓度时间曲线见附图9，7只犬口服给予3粒参一胶囊(含Rg3 30mg，Rg3 10mg/粒)后血浆药物浓度时间曲线见附图10，两个试验组平均血浆药物浓度时间曲线见附图11。口服给予所述药用组合物后，血浆药物浓度于2.3±0.9h达到峰浓度为6.8±1.8ng/mL，半衰期为6.0±0.9h，药时曲线下面积(AUC0-t)为40.0±15.7ng·h/mL。
实施例47 20(R)-人参皂苷Rg3组合物冻干粉针剂抗肿瘤药效学试验1试验药物及配制方法受试药物人参皂苷Rg3冻干粉针剂；批号20030519，规格5mg/支。
配制方法精密量取一定量的人参皂苷Rg3冻干粉针剂或相应辅料加入生理盐水至所需浓度即可，给药体积0.5ml/鼠。
2实验材料2.1溶剂 生理盐水。
2.2阳性对照品 注射用环磷酰胺(CTX)，上海华联制药集团生产；每天一次，连续七天；5Fu注射液，上海旭东海普药业有限公司生产；注射用丝裂霉素(MMC)，日本协和发酵工业株式会社生产。
2.3瘤源 人体的胃癌MGC模型、肠癌模型LOVO及肝癌QGY均第二代以上的肿瘤用作瘤源；小鼠B16黑色素瘤细胞模型等均由上海医药工业研究院药理室传代维持。
3实验动物3.1来源 裸小鼠由上海市中科院实验动物中心提供，合格证号SCXK2003-0003。C57BL/6及昆明种小鼠由本院实验动物组提供，实验动物使用许可证号SYXK(沪)2004-0015。
3.2体重 裸小鼠为6周龄，昆明种小鼠及C57BL/6小鼠为18～22克。
3.3性别 雌雄皆可，每批实验使用同一种性别。
3.4动物数试验组及阳性对照组裸小鼠每组6只小鼠，其他小鼠每组8-10只，阴性对照各为两组。
4试验设计4.1剂量设置 人参皂苷Rg3冻干粉针剂给药剂量设为1.5mg/kg/d、0.75mg/kg/d，0.375mg/kg/d。
4.2给药方案 静脉给药，每天2次，人体肿瘤模型及细胞接种的小鼠模型iv×14bid，小鼠肿瘤接种的模型iv×10bid的方案治疗。
4.3试验对照 阴性对照给以与试验组相应辅料，给药方案同试验组；阳性对照环磷酰胺CTX 30mg/kg、MMC2mg/kg及5Fu30mg/kg腹腔或静脉给药每天一次，连续七天。
5试验方法5.1抗肿瘤试验5.1.1胃原位接种模型无菌条件下取生长旺盛的体内传2代的MGC胃癌，以匀浆法制备成约2×107/ml细胞悬液，经手术于裸小鼠的胃大弯肌层内注射细胞悬液0.05ml，次日按实验设计方案给药，按下列公式计算荷瘤宿主生命延长率生命延长率％＝给药组平均生存天/对照组平均生存天×100％5.1.2肝原位接种模型无菌条件下取生长旺盛的体内传第二代QGY瘤源，以匀浆法1∶6制备成约1-2×107/ml细胞悬液，匀浆经100目不锈钢筛网过滤，备用。裸小鼠常规消毒，麻醉于腹腔正中剑突下切开皮肤和腹腔，暴露肝脏，经肝实质部以进口的28ga 1/2ml注射器注射0.05ml细胞悬液，关闭腹腔，逐层缝合腹腔及皮肤。裸小鼠置于层流架中饲养，所用的饲料、垫料、笼具及接触的器械等均应高压消毒后使用。次日按实验设计方案给药，观察各组动物45天内的生存时间，与阴性对照组进行比较，统计生命延长率。
5.2增效试验5.2.1腋皮下接种模型无菌条件下取生长旺盛的瘤源，以匀浆法制备成约1～2×107/ml细胞悬液；于相应宿主腋皮下接种0.2ml/每鼠，次日按实验设计方案给药，三周左右处死各组动物，剖取肿瘤称重，按下列公式计算肿瘤抑制率肿瘤抑制率％＝[(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％5.2.2尾静脉接种模型无菌条件下取对数生长期的B16小鼠黑色素瘤培养细胞，制备成约2.5×105/ml细胞悬液，于C57BL/6小鼠尾静脉接种0.2ml/鼠，次日按实验设计方案给药，三周后处死各组动物，剖取各组小鼠的肺脏，计测每鼠肺脏所转移的集落数，以各组肿瘤平均集落数，按下列公式计算肿瘤抑制率
肿瘤抑制率％＝[(对照组平均集落数-给药组平均集落数)/对照组平均集落数]×100％5.3减毒试验观察对人参皂苷Rg3冻干粉针剂化疗药所致小鼠白细胞变化的影响。
取C57BL/6小鼠80只，从每鼠眼静脉丛取血，按常规白细胞玻片计数法，计测各鼠白细胞数，选择7500±300个白细胞/mm3的小鼠，随机分组，每组10个小鼠。第0、2天除空白对照组以外，其余各组均给以化疗药CTX100mg/kg ip×2。按上述方案给药，第0天开始测各组白细胞数，而后实验期间每隔三天，检测各组小鼠白细胞数，计算各时相各组小鼠的白细胞数均值及标准差，直至阳性对照组白细胞恢复正常数为止。
5.4免疫试验5.4.1对荷Lewis肺癌C57BL/6小鼠的NK细胞活性试验取C57BL/6小鼠，趾皮下接种无菌制备的Lewis肺癌混悬液0.05ml/鼠(约1×106个肿瘤细胞)。次日随机分组，按实验设计给药，末次给药后次日在无菌条件下取小鼠脾脏，用100目筛网制成单个脾细胞悬液，低渗除去红细胞，将细胞悬液转入培养瓶中，37℃5％CO2条件培养1小时后去除贴壁细胞，计数活细胞并调整细胞浓度为3×106个细胞/ml作为效应细胞。靶细胞取L929体外培养细胞，常规培养24小时，以培养液调整细胞浓度为1.5×105个细胞/ml，使效靶细胞之比为20∶1。取96孔培养板分别加入效应细胞和靶细胞，另设效应细胞和靶细胞对照，于37℃5％CO2条件培养4小时后，加入MTT染色液，再培养2小时后加入消化液于次日测各孔OD值，按公式计算NK细胞毒活性。
NK细胞毒活性％＝{[靶细胞对照组OD均值-(实验组OD均值-效应细胞OD均值)]/靶细胞对照组OD均值}×100％5.4.2对正常昆明种小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬功能试验取雄性昆明种小鼠随机分组，按实验设计方案给药，末次给药后各组小鼠腹腔注射0.5％水解蛋白1.5ml/只，24小时后腹腔注射每毫升1×106的鸡红细胞悬液0.2ml/只；隔40分钟后用生理盐水洗脱、收集小鼠腹腔液；离心，取细胞沉淀液制成涂片，用甲醇固定，吉姆萨染色封片，用油镜计数100个巨噬细胞中吞噬鸡红血球的巨噬细胞数及吞噬鸡红血球的总数，按下列公式计算吞噬百分比和吞噬指数。
5.4.3对Lewis肺癌C57BL/6小鼠的IL-2活性试验采用双抗体夹心ELISA法，抗小鼠IL-2单抗包被于酶标板上，标本与标准品中的IL-2会与单抗结合，游离的成分被洗去，同时加入生物素化的抗小鼠IL-2抗体和辣根过氧化物酶标记的亲合素，生物素与亲合素特异性结合；抗小鼠IL-2抗体与结合在单抗上的IL-2结合而形成免疫复合物，洗去游离的成分。加入显色剂，显示蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-2浓度与OD450值之间呈正比，可通过所绘制的标准曲线求得样本中的IL-2浓度。
吞噬百分比％＝(100个巨噬细胞中吞噬鸡红血球的巨噬细胞数/100个巨噬细胞)×100％吞噬指数＝100个巨噬细胞中吞噬鸡红血球的总数/100个巨噬细胞6试验结果6.1 Rg3冻干粉针剂与胶囊剂治疗肝癌疗效的比较试验结果表1-2；6.2 Rg3冻干粉针剂治疗肠癌、胃癌的疗效试验结果见表3-4；6.3 Rg3冻干粉针剂增加化疗药物疗效试验结果见表5；6.4 Rg3冻干粉针剂减轻化疗药物疗效毒副作用疗效试验结见表6；6.5 Rg3冻干粉针剂提高机体免疫功能疗效试验结果见表7-9。
表1人参皂苷Rg3冻干粉针剂与胶囊剂对人体肝癌QGY疗效的比较试验结果(n＝3)

***与阴性对照组相比，p值＜0.01，以生命延长率＞125％以上以抗肿瘤有效计。#胶囊剂商品名参-胶囊。
表2人参皂苷Rg3冻干粉针剂与胶囊剂对小鼠黑色素B16实验肺转移疗效的比较试验结果(n＝3)

***与阴性对照组相比p值＜0.01，下表同。
表3人参皂苷Rg3冻干粉针剂对人体肠癌LOVO疗效试验(n＝3)

表4人参皂苷Rg3冻干粉针剂对人体胃癌MGC(原位接种)疗效试验(n＝3)

表5人参皂苷Rg3冻干粉针剂合并CTX对小鼠黑色素B16转移的疗效试验(n＝3)

表6人参皂甙Rg3冻干粉针剂对化疗药物的增效减毒作用的试验结果(n＝20)

动物移植性肿瘤为小鼠肝癌(Heps)。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，其他均P＞0.05。
表7人参皂甙Rg3冻干粉针剂对荷瘤小鼠NK活性影响的试验结果

**P＜0.01，*靶细胞对照OD均值。
表8人参皂甙Rg3冻干粉针剂对荷瘤小鼠IL-2活性影响的试验结果

**P＜0.01表9人参皂甙Rg3对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能影响的试验结果

**P＜0.01实施例48 20(R)-人参皂苷Rg3组合物胶囊剂抗疲劳试验1.20(R)-人参皂苷Rg3组合物胶囊剂对小鼠的抗疲劳作用试验1.1材料和方法1.1.1样品20(R)人参皂苷Rg3组合物胶囊剂内容物呈白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司提供，用蒸馏水配置所需浓度。
1.1.2试验动物一级昆明雄性小鼠240只，由四川大学实验动物中心提供。(动物合格证号川实动管质第67号)1.1.3剂量选择按人体推荐剂量(10mg/60kg/d)的10倍、20倍、30倍(相当于动物的1.67、3.34、5.01mg/kg/d)设低、中、高三个剂量组。
1.1.4实验方法按体重大小随机分为一个阴性对照组和三个试验组，以灌胃方式给样(2％)，每天一次，阴性对照组给予蒸馏水，连续30天。30天后分别测定各项指标。
1.1.4.1负重游泳实验于末次灌胃后30分钟，将小鼠负荷5％体重的铅皮，放入游泳箱(水深30cm，水温25±0.5℃)中游泳，记录小鼠自游泳起到死亡的时间即小鼠游泳时间。
1.4.1.2爬杆实验于末次灌胃后30分钟，将小鼠放于爬杆架的有机玻璃棒上，使其肌肉处于静力紧张状态，记录小鼠因肌肉疲劳从棒上跌下的时间，重复三次，累计连续三次的时间为爬杆时间(秒)。
1.4.1.3尿素氮、肝糖原测定分别于末次灌胃后30分钟，将小鼠放入游泳箱(水深30cm，水温30±0.5℃)中游泳90分钟，取眼球血测定血清尿氮素含量(二乙酰-肟法)，取肝脏测定肝糖原含量(蒽酮法)。
1.4.1.4乳酸测定末次灌胃后30分钟，眼球取血测定乳酸含量(SBA-生物传感仪器)，将小鼠放入游泳箱(水深30cm，水温30±0.5℃)中游泳10分钟，鼠尾根部负荷4％体重的铅皮，分别于游泳后即刻、游泳后30分钟眼球取血再测定乳酸含量。
1.4.1.5统计分析实验数据用SPSS 9.0统计软件进行方差分析、q检验或秩和检验。
1.2结果2.1 20(R)-人参皂苷Rg3组合物胶囊剂对小鼠体重的影响从表1可见，试验中期和试验结束时各剂量组小鼠体重与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。
表1小鼠体重情况

2.2 20(R)-人参皂苷Rg3组合物胶囊剂对小鼠负重游泳时间的影响见表2，低、高剂量组小鼠负重游泳时间较阴性对照组显著延长(P＜0.05)。中剂量组与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。
表2各组小鼠负重游泳试验结果(X±SD)

*与阴性对照组比较2.3 20(R)-人参皂苷Rg3组合物胶囊剂对小鼠爬杆时间的影响见表3，低、中剂量组爬杆时间明显长于阴性对照组(P＜0.05)，高剂量组与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。
表3各组小鼠爬杆试验结果(X±SD)

*与阴性对照组比较2.4 20(R)-人参皂苷Rg3组合物胶囊剂对小鼠运动后血清尿氮素的影响见表4，中、高剂量组小鼠运动后血清尿氮素含量明显低于阴性对照组(P＜0.05)，低剂量组与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。
表4各组小鼠运动后血清尿素氮含量(X±SD)

*与阴性对照组比较2.5 20(R)-人参皂苷Rg3组合物胶囊剂对小鼠运动后肝糖原含量的影响见表5，高剂量组小鼠运动后肝糖原含量明显高于阴性对照组(P＜0.05)，其他剂量组与阴性对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。
表5各组小鼠运动后肝糖原含量(X±SD)

*与阴性对照组比较2.6 20(R)-人参皂苷Rg3组合物胶囊剂对小鼠运动后血乳酸水平的影响表6、7显示，低、中、高三个剂量组小鼠运动后血乳酸升幅和降幅与阴性对照组比较差异均无显著性(P＞0.05)。
表6各组小鼠运动后乳酸升高幅度(X±SD)

*差值(B-A)与阴性对照组比较表7各组小鼠运动后乳酸消除幅度(X±SD)

*差值(B-C)与阴性对照组比较1.3小结20(R)人参皂苷Rg3组合物胶囊剂抗疲劳试验结果显示，低、高剂量组小鼠负重游泳时间和低、中剂量组小鼠爬杆时间均显著长于阴性对照组(P＜0.05)，高剂量组小鼠运动后肝糖原含量明显高于阴性对照组(P＜0.05)，中、高剂量组小鼠运动后血清尿素氮含量明显低于阴性对照组(P＜0.05)，运动后乳酸升幅和降幅与阴性对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。按评价标准认为本检品(20(R)人参皂苷Rg3组合物胶囊)具有抗疲劳作用。
实施例49 20(R)-人参皂苷Rg3组合物胶囊剂改善记忆试验1.材料与方法1.1材料药品样品20(R)人参皂苷Rg3组合物颗粒(10毫克/袋)，由富力博士提供。东莨菪碱购自中国药品生物制品检定所。忆恒颗粒(10克/袋)，陕西开元制药有限公司生产。上述药品使用时均用生理盐水配成所需浓度。
动物昆明种小鼠，雄性18～22克，由吉林大学药学院提供。
仪器小鼠跳台仪、水迷宫装置由吉林大学药学院自制，接触调压器，中川集团公司上海振华稳压器厂制造。
1.2方法1.2.1跳台法实验开始前将动物置于实验室适应环境1小时。实验开始时，将动物放在跳台装置放在跳台装置的安全台上，适应环境3分钟，然后同以36伏特电流，动物跳至铜栅时即遭受电击，为错误反应，其正确反应是跳回安全区，如此训练5分钟。24小时后进行测验。测验时将跳台装置同以36伏特电流，然后将动物放在安全台上，记录3分钟内的错误次数。
实验步骤选健康合格小鼠72只，称重，随机分为6组，每组12只。20(R)人参皂苷Rg3组合物颗粒剂量组分为2.16、6.48、12.96毫克/公斤，阳性对照忆恒颗粒121.65毫克/公斤，空白对照组和模型组给予生理盐水0.1毫升/10克，每天1次，连续给药7天，于末次给药后1小时，空白对照组腹腔注射等容量生理盐水，模型组、Rg3组合物颗粒实验组、忆恒颗粒阳性对照组分别腹腔注射东莨菪碱4毫克/公斤，10分钟后进行跳台训练，24小时后测验。
1.2.2小鼠迷路法小鼠迷路装置内设起步区、多盲端曲折回路和安全区(一个台阶)。每天给药1小时后将小鼠放回起步区，诱导其游向安全区，每鼠每天训练10次，每次间隔25秒，以30秒内到达安全区为正确反应，连续训练4天。记录各组动物正确反应次数，计算正确反应百分率及到达安全区的平均时间。
实验步骤实验步骤选健康合格小鼠72只，称重，随机分为6组，每组12只。20(R)人参皂苷Rg3组合物颗粒剂量组分为2.16、6.48、12.96毫克/公斤，阳性对照忆恒颗粒121.65毫克/公斤，空白对照组和模型组给予生理盐水0.1毫升/10克，每天1次，连续给药10天。在第7天给药后1小时，于末次给药后1小时，空白对照组腹腔注射等容量生理盐水，模型组、Rg3组合物颗粒实验组、忆恒颗粒阳性对照组分别腹腔注射东莨菪碱4毫克/公斤，10分钟后进行水迷路训练，每天每鼠训练10次，每次间隔25秒，以30秒内到达安全区为正确反应，记录各组动物正确反应次数，计算正确反应百分率。
2.结果2.1对东莨菪碱所致记忆获得障碍的改善作用(跳台法)结果如表1所示，模型组与空白对照组相比，错误反应次数数显著增多，表明4毫克/公斤东莨菪碱已造成记忆获得障碍，模型成立；20(R)人参皂苷Rg3组合物颗粒实验组与模型组相比，明显减少了小鼠测验期的错误次数降低，其作用效果明显优于忆恒颗粒阳性对照组。实验结果证明，20(R)人参皂苷Rg3组合物颗粒对小鼠记忆获得障碍有明显改善作用，可增强小鼠的学习记忆。
表1 Rg3组合物颗粒对东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍的改善作用(n＝12 X±S)

2.2对东莨菪碱所致空间辨别障碍的改善作用(水迷路法)结果如表4所示。模型组小鼠正确反应率较正常对照组显著降低，20(R)人参皂苷Rg3组合物颗粒从训练第2天开始，剂量依赖性地提高小鼠正确反应百分率，对东莨菪碱所致小鼠空间辨别障碍具有显著改善作用。
表2 Rg3组合物颗粒对东莨菪碱所致小鼠空间辨别障碍的改善作用(n＝12 X±S)

实施例50 20(R)-人参皂苷Rg3组合物消肿止痛愈合伤口试验1.材料与方法1.1实验动物30只大鼠(吉林大学药学院实验动物中心提供)，体重250-300克，雌雄各半，随机分三组。
1.2方法1.2.1生物学评价动物创伤制模用8％硫酸钡脱掉大鼠后肢的毛，无皮肤破损，24小时后用3％戊巴比妥钠30毫克/公斤腹腔内麻醉，俯卧位固定于造模装置板上，让后将质量为1公斤的打击锤牵拉至10厘米出，突然垂直落下铁锤，打击大鼠后肢股部肌肉最丰满处，即造成急性软组织损伤模型。致伤30分钟后，用手术刀切开皮肤1.5-3.0厘米深至肌层，并取出0.5克肌组织。伤口根据分组作相应的处理。实验组贴20(R)人参皂苷Rg3组合(1克溶于1毫升生理盐水中)，阳性对照组涂云南白药(1克白药溶于1毫升生理盐水中)，阴性对照组涂生理盐水，1次/天。
1.2.2监测指标将受试的大鼠根据分组分笼喂养，创伤后清醒0.5小时，隔10分钟用一次性塑料棒轻碰大鼠的双后肢创面，观察2小时(刺激12次)内大鼠舔创面、缩肢反应，站立时后肢肌肉抖动等疼痛行为反应，拍摄3天、7天伤口愈合大体情况，记录创面感染率。7天后将动物处死评估各组动物的体重变化。
1.2.3统计学分析采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，计数资料采用X2检验，计量资料采用方差分析，p＜0.05为差异具有显著性。
2结果2.1实验后不同组别大鼠清醒后2小时的疼痛行为反应情况见表1。在舔面、缩肢反应站立时后肢肌肉的抖动等疼痛行为反应，三组结果方差分析总体比较有显著差异(p＜0.01)；均数经过两两比较，人参皂苷Rg3组合物组分别与云南白药、生理盐水组在舔面方面有显著差异(p＜0.05)；在缩肢反应、肌肉抖动方面无明显差异(p＞0.05)。上述结果表明，人参皂苷Rg3组合物组具有镇痛作用，且优于云南白药组。
2.2大鼠双后肢创伤后不同组织伤口的感染情况见表2。三组感染率经过X2检验比较有显著差异(p＜0.01)，说明人参皂苷Rg3组合物组具有抗感染作用，其对大鼠伤口的感染率明显低于云南白药及生理盐水对照组。
2.3不同组别大鼠伤口修复的大体情况肉眼观察伤口结果，伤后3天人参皂苷Rg3组合物组伤口干燥、无渗液，创缘皮肤收缩明显；云南白药组伤口有少量分泌物，创缘轻度收缩；生理盐水组伤口大量分泌物，创面面积增大，创缘有脓痂。伤后7天天人参皂苷Rg3组合物，组伤口干燥、无感染，伤口基本被肉芽所充填，明显的新生上皮增长；云南白药组伤口面积缩小，少量渗出，仅见薄层肉芽，未见明显的新生上皮增长；生理盐水组伤口脓8渗出较多，伤口面无明显缩小，且形成溃疡面。上述结果表明，天人参皂苷Rg3组合物组在消肿收敛、抑菌和缩短创面愈合的作用明显优于云南白药及生理盐水对照组。
表1 三组大鼠疼痛行为反应的比较

*与其他两组比较p＜0.01表2 三组大鼠伤口的感染率比较

*p＜0.0权利要求
1.一种20(R)-人参皂苷Rg3药用组合物水溶液，其特征在于该水溶液中20(R)-人参皂苷Rg3的含量为0.5～10毫克/毫升。
2.一种20(R)-人参皂苷Rg3药用组合物水溶液的制备方法，其特征在于(1)将原料20(R)-人参皂苷Rg3溶于混合有机溶剂中，制成0.1～5％的人参皂苷溶液，(2)分别将A、B①②⑤两类辅料溶于水中，制成0.1～30％的辅料水溶液，(3)将上述人参皂苷溶液一次性加入到40～100℃的上述辅料水溶液中，其中原料∶辅料A＝1∶1～300，原料∶辅料B＝1∶100～400，搅拌0.1～3小时即得澄明液，(4)将澄明液在真空度0.01～0.08MPa、温度80～100℃减压回收溶剂至原体积的2/3～近干，加水至原体积，溶解并减压回收溶剂至近干，再重复上述操作一次，最终加入注射用水或纯化水摇匀溶解。
3.一种20(R)-人参皂苷Rg3药用组合物水溶液，其特征在于该水溶液中20(R)-人参皂苷Rg3的含量为0.1～2毫克/毫升。
4.一种20(R)-人参皂苷Rg3药用组合物水溶液的制备方法，其特征在于(1)将原料20(R)-人参皂苷Rg3溶于混合有机溶剂中，制成0.1～5％的人参皂苷溶液，(2)分别将B类③④组的辅料溶于水中，制成20～65％的辅料水溶液，(3)将上述人参皂苷溶液匀速滴加到温度为60～100℃的上述辅料水溶液中，其中原料辅料B＝1∶100～400，并搅拌到滴加人参皂苷溶液完毕后停止，即得澄明液，(4)将澄明液在真空度0.01～0.08MPa、温度80～100℃减压回收溶剂至原体积的2/3～近干，加水至原体积，溶解并减压回收溶剂至近干，再重复上述操作一次，最终加入注射用水或纯化水摇匀溶解。
5.一种20(R)-人参皂苷Rg3水溶性粉末的制备方法，其特征在于制得的20(R)-人参皂苷Rg3药用组合物水溶液干燥后，可制得20(R)-人参皂苷Rg3水溶性粉末。
6.一种20(R)-人参皂苷Rg3药用组合物冻干粉针剂的制备方法，其特征在于用原料与辅料A或辅料B③④制得的20(R)-人参皂苷Rg3药用组合物水溶液经超滤器加入其重量0.1％针剂用活性炭，混合均匀，于80℃保温30分钟后，用0.45μm滤膜过滤除热源，无菌条件下用0.22μm微孔滤膜过滤除菌分装，冷冻干燥。
7.一种20(R)-人参皂苷Rg3药用组合物冻干粉针剂的制备方法，其特征在于用原料与辅料A或辅料B③④制得的20(R)-人参皂苷Rg3药用组合物水溶液经干燥后制得的20(R)-人参皂苷Rg3水溶性粉末，再加入注射用水复溶，加入其重量0.1％针剂用活性炭，混合均匀，于80℃保温30分钟后，用0.45μm滤膜过滤除热源，无菌条件下用0.22μm微孔滤膜过滤除菌分装，冷冻干燥。
8.一种20(R)-人参皂苷Rg3药用组合物，其特征在于它的溶液、水溶性粉末及其药物制剂作为制备抗肿瘤、合并放化疗增效减毒、提高免疫功能、抗疲劳、改善记忆、消肿止痛及愈合伤口药物的应用。
全文摘要
一种20(R)－人参皂苷Rg3药用组合物水溶液，其含原料0.5～10毫克/毫升，其制备方法将0.1～5％的人参皂苷溶液加到温度为40～100℃的0.1～30％辅料A、B①②⑤水溶液中，两者重量比为1∶1～300，减压回收溶剂后加水；另一种含原料0.1～2毫克/毫升的20(R)－人参皂苷Rg3药用组合物水溶液，其制备方法将0.1～5％的人参皂苷溶液加到温度为60～100℃的20～65％辅料B③④的水溶液中，两者重量比为1∶100～400，减压回收溶剂后加水；上述20(R)－人参皂苷Rg3组合物水溶液及干燥后所得水溶性粉末，用其制备注射、口服和外用药物制剂的生物利用度较高，其具有抗肿瘤、合并放化疗增效减毒、提高免疫功能、抗疲劳、改善记忆、消肿止痛及愈合伤口的作用。
文档编号A61K9/08GK1883492SQ20061004661
公开日2006年12月27日 申请日期2006年5月22日 优先权日2006年5月22日
发明者富力, 赫澜铭, 刘红, 鲁明明, 鲁岐 申请人:富力