专利名称：：三七皂苷st-4,其药物组合物和其制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及药物化合物及药物领域，具体地，涉及一种新的达玛垸型三萜皂苷化合物三七皂苷ST-4及其制备方法，以及该化合物用于制备抗单纯疱疹病毒I型(HSV-1)药物的用途。技术背景单纯疱疹病毒是DNA病毒，属于疱疹病毒科a病毒亚科。根据抗原性的差别可分为I型和II型。单纯疱疹病毒I型(HSV-1)主要引起生殖器以外的皮肤、粘膜(口腔粘膜)和器官(脑)的感染。临床表现主要是粘膜或皮肤局部集聚的疱疹，偶尔也可发生严重的全身性疾病，累及内脏。单纯疱疹原发感染愈后病毒基因潜伏于神经节，当机体抵抗力低下时，病毒基因被激活并开始繁殖，病情反复发作。单纯疱疹病毒为典型疱疹病毒形态，球形，有包膜，颗粒直径120-150nm，内有核衣壳，直径100-110nm，包膜和核衣壳之间有无定形纤维组织皮质层，内有核心，核心内有病毒DNA和蛋白质。单纯疱疹病毒在全球广泛分布，人类是唯一的宿主。感染主要通过人群与易感者之间的密切接触，无季节差异。机体感染病毒后可产生抗体，抗体不能清除病毒，但可作为了解HSV感染流行病学的指标。单纯疱疹病毒感染在人群中广泛存在，初次原发感染绝大多数形成隐性感染，无临床症状，感染后产生中和抗体，60%-90%的人群中抗体检测为阳性，但不能清除病毒。少数感染者出现黏膜、皮肤复发性疱疹病灶，新生儿或免疫力低下者感染后可发展为疱疹性脑炎或全身性感染。唇疱疹为单纯疱疹病毒1型常见的皮肤感染，局部出现疱疹病灶，一般自愈，可复发。也可引起皮肤疱疹、湿疹。眼角膜炎为单纯疱疹病毒常见的黏膜感染，单纯疱疹病毒1型感染引起角膜炎，发病率较高。原发性感染多为急性树枝状角膜炎，愈后经常反复发作，病变深入角膜基层组织，发展为角膜溃疡，影响视力，甚至导致失明，发作病程长达数月。新生儿或免疫力低下者感染疱疹病毒，可侵染神经系统，引发脑炎，病情严重、未治疗病人病死率高达70%，治疗后也多发生后遗症。严重者可引起全身性单纯疱疹病毒感染，病死率极高。目前临床治疗主要采用局部皮肤护理治疗，同时结合一些口服抗病毒药物等。临床适用的中成药主要是利用其清热解毒的药效结合治疗。中药三七药理作用广泛，曾有报道以三七为主要原料的"云南白药"可用于治疗带状疱疹等疾病。但三七皂苷类单体化合物对单纯疱疹病毒I型的抑制作用未见有过报道。
发明内容本发明的目的是提供一种新的达玛垸型三萜皂苷化合物三七皂苷ST-4(notoginsenosideST-4)及其制备方法，以及该化合物用于制备抗单纯疱疹病毒I型(HSV-1)药物的用途。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案如结构式(I)所示的达玛烷型三萜皂苷三七皂苷ST-4，药物组合物，含有三七皂苷ST-4和药物学上可接受的载体。制备化合物三七皂苷ST-4的方法，取三七，经粉碎成颗粒状后，置于高温120°C下蒸制12小时得熟三七，然后用工业乙醇对其回流提取四次，回收乙醇后浓縮得浸膏，浸膏用水溶解，经大孔树脂柱层析，甲醇洗脱得总皂苷，再经200—300目硅胶柱层析，85:15:1的氯仿一甲醇一水洗脱，共得9个组分，组分7经硅胶柱、反相柱反复层析，得到三七皂苷ST-4。更具体的方法为三七粉碎成颗粒状后，用双层纱布包裹，置于高温120。C的高压锅，蒸制12小时后得熟三七，用工业乙醇回流提取4次，减压回收溶剂浓縮后得浸膏，将浸膏用水溶解，用D101大孔吸附树脂分两次进行柱层析，先用水洗脱至流出液Molish反应呈阴性，再用工业甲醇洗脱即得粗皂苷；将粗皂苷用硅胶200--300目拌样，经硅胶柱层析，用85:15:1氯仿-甲醇-水洗脱，共得9个组分，组分7经硅胶柱层析，从梯度80:20:2氯仿-甲醇-水逐步增加极性，得到组分7，经硅胶柱层析，再从80:20:2氯仿-甲醇-水逐步增加极性，得到组分3，经硅胶柱层析，从80:20:2氯仿-甲醇-水逐步增加极性洗脱，得到组分1，组分1用反相RP-18分离，流动相为70:30甲醇-水，逐步增加甲醇浓度，得第10号流分，将此流分再行反相RP-18柱层析，流动相为75:25甲醇-水，逐步增加甲醇浓度，得到的1号流分，最后经MCICHP20P反相柱纯化，流动相为80:20甲醇-水，逐步增加甲醇浓度，最终得到达玛烷型四环三砲皂苷化合物三七皂苷ST-4。三七皂苷ST-4在制备抗单纯疱疹病毒1型药物中的应用。三七皂苷ST-4在制备治疗单纯疱疹病毒1型相关疾病的药物中的应用。本发明的新化合物三七皂苷ST-4(notoginsenosideST-4)是一种从五加科人参属药用植物三七的炮制品中分离提取的新的三萜皂苷类有效成分，经试验证明可显著抑制单纯疱疹病毒I型，具体地说是以经炮制的三七为原料提取分离的一种新的达玛烷型三萜皂苷。本发明首先对五加科人参属植物三七的炮制品进行了系统的化学研究，利用多种分离手段，包括大孔树脂柱层析、硅胶柱层析、反相硅胶柱层析等，深入研究了三七炮制品的化学成分，从中分离鉴定了31个化学成分，其中1个新的达玛垸型三萜皂苷的结构鉴定为3-，12万，20(5)-三羟基-达玛-24-烯-3-^》-D-木吡喃糖基-(1—2)-万-D-葡萄吡喃糖基-(1—2)-；-D-葡萄吡喃糖苷[3》，12^，20(5)-trihydroxyd誦ar-24-ene-3-<9~》+xylopyranosyl-(1—2)-》-D-glucopyranosy1-(1—2)-》-D-glucopyranoside]，命名为三七皂昔ST-4(notoginsenosideST-4)。本发明以单纯疱疹病毒1型(HSV-1)毒株和人胚肺成纤维细胞(MRC-5)细胞为实验对象，观察三七皂苷ST-4的抗单纯疱疹病毒1型活性。结果证明，(1)三七皂苷ST-4对HSV-1感染的细胞具有一定的预防作用；(2)三七皂苷ST-4对HSV-1感染的细胞具有治疗作用；(3)三七皂苷ST-4可降低HSV-1对MRC-5细胞的感染性。基于上述研究结果，本发明证实了三七皂苷ST-4具有预防和治疗单纯疱疹病毒1型感染引起的疾病的用途，可用于制备抗单纯疱疹病毒1型的药物。本发明提供了用于治疗单纯疱疹病毒1型相关疾病的药物组合物，包括有效治疗剂量的作为活性成分的三七皂苷ST-4，以及药物学上可接受的载体。本发明所述的治疗单纯疱疹病毒1型相关疾病的药物组合物，由三七皂苷ST-4与药学上可接受的载体制备的药物剂型包括片剂、胶囊、口服液、针剂或粉针剂。由于新达玛烷型三萜皂苷(三七皂苷ST-4)可从三七及相关药材中提取分离，而片剂、胶囊、口服液、针剂或粉针剂等药物剂型的制备也是本领域的常规知识，因此，由三七皂苷ST-4与相应载体制备的各种药物剂型也能够由本领域技术人员容易实现。上文所述的的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂黏土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、以及和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。本发明化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、胶囊和注射剂。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1%~99.5%的活性成分，最优选含有重量比为0.5%~95%的活性成分。本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01~10mg/kg体重，优选0.1~5mg/kg体重。可以一次或多次施用。本发明的有益效果在于新达玛垸型三萜皂苷(三七皂苷ST-4)对HSV-1感染的细胞具有预防和治疗作用。三七皂苷ST-4可降低对MRC-5细胞的感染性。将三七皂苷ST-4用于制备治疗单纯疱疹病毒1型相关疾病的药物，具有重要的开发应用前景。图1为正常细胞对照组的显微镜图(10xl0倍)；图2为病毒感染对照组的显微镜图(10x10倍)；图3为加药治疗组的显微镜图(10xl0倍)。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但不对其有任何限制。实施例1.一种新的达玛浣型三萜皂苷三七皂苷ST-4(notoginse謹ideST-4)的分离提取5kg三七购于云南，将其粉碎成颗粒状后，用双层纱布包裹，置于高压锅中，将温度控制在高温120°C，蒸制12小时后即得熟三七。用工业乙醇回流提取(5Lx4)，减压回收溶剂浓縮后得总浸膏778g。将浸膏用水溶解，用D101大孔吸附树脂(90x8.5cm)分两次进行柱层析，先用水洗脱至流出液Molish反应呈阴性，再用工业甲醇洗脱即得粗皂苷440g。将粗皂苷用硅胶(200—300目)约500g拌样，经硅胶(200_300目)柱层析，用氯仿-甲醇-水(85:15:1)洗脱，共得9个组分。组分7(38g)经硅胶柱层析，从梯度氯仿-甲醇-水(80:20:2)逐步增加极性，得到组分7(7.6g)，再经硅胶柱层析，也是从氯仿-甲醇-水(80:20:2)逐步增加极性，得到组分3(5.2g)，再经硅胶柱层析，从氯仿-甲醇-水(80:20:2)逐步增加极性洗脱，得到组分l(1.4g)。此组分用反相RP-18分离，流动相为甲醇-水.(70:30)，逐步增加甲醇浓度，得第10号流分。将此流分再行反相RP-18柱层析，流动相为甲醇-水(75:25)，逐步增加甲醇浓度，得到的1号流分，最后经MCICHP20P反相柱纯化，流动相为甲醇-水(80:20)，逐步增加甲醇浓度，最终得到新的达玛垸型四环三萜皂苷化合物三七皂苷ST-4(31mg)。达玛垸型三萜皂苷三七皂苷ST-4(notoginsenosideST-4)的结构鉴定三七皂苷ST-4(notoginsenosideST-4)为白色无定形粉末，高分辨质谱匿SIMS显示迈/z915.5323[M-H]-(calcd.for915.5317,C47H79017)，由此推出其分子式为C47H8。017&负离子FAB-MS给出_784[M-132]—，622[M-132-162]—特征碎片峰，表明末端五碳糖基和六碳糖基的存在，并且五碳糖应为末端糖基。同时，NMR谱中，观察至IJ5H4.92(d，/二8.0Hz，H-l')，、5.51(d，/=7.5Hz，H—1，，)，5H5.39(d，/二6.5Hz，H-l，，，)三个端基质子信号；13CNMR谱中，观察到&104.8，&103.2，&106.5三个端基碳信号，以及^62.9，^67.5三个仲碳信号，提示该化合物中可能存在两个葡萄糖基和一个木糖基。在HMBC谱中，观察到、4.92(d，/二8.0Hz，H-l，)与5C88.9(C—3);5.51(d，/二7.5Hz，H—1，，)与&83.0(C—2，)以及"5.39(d，/=6.5Hz，H—1，，，)与&84.6(C-2'')的相关，由此证明了该化合物的糖基连接方式。与三七皂苷Fti的碳谱数据比较.，发现二者结构相近。唯一区别是三七皂苷F仁中C-17，C-21，C-22的化学位移分别为&50.7，22.8，43.2;而该化合物中C-17，C-21，C-22的化学位移则分别为5c54.8，27.1，35.9。由此确证该化合物与三七皂苷Ft的不同在于C-20位构象，三七皂苷F仁的20位为y构象，而该化合物应为S构象。综上所述，该化合物的结构鉴定为3-，12^,20(5)-三羟基-达玛-24-烯-3-^--D-木吡喃糖基-(1—2)-D-葡萄吡喃糖基-(1—2)-》-D-葡萄吡喃糖苷[3》，12》，20(5)-trihydroxydammar-24-ene-3HD-xylopyranosyl-(1—2)-/-D-glucopyranosyl-(1—2)_^-D-glucopyranoside]，命名为三七皂苷ST-4(notoginsenosideST-4)，化学结构式如式(I)所示。式(I)三七皂苷ST-4的化学结构式三七皂苷ST-4(notoginsenosideST-4):分子式为C47H80017，易溶于甲醇、吡啶等有机溶剂，瑢点187-191°C，旋光值[a]矽+3.5°(c0.21,Me0H)，红外光谱数据为3422，2942,2878，1637，1452，1376，1307，1077，1043，896cm—1，FAB-MS(negative)迈/z916[Mr，784[M-132]—，622[M-132-162]、匿SIMS(negative)边/z915.5323[M-H]—(calcd.for915.5317，C47H79017).力-騰(500MHz，^inppm，inC5D5N)和13C-NMR(125MHz，5inppm，inC5D5N)波谱数据见表1。表1新化合物三七皂苷ST-4的^和13C-NMR化学位移值(5inppm，/inHz,inC5D5N)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实施例2、三七皂苷ST-4(notoginsenosideST-4)对单纯疱疹病毒I型(HSV-1)感染Vero细胞的影响试验(一)材料1、器材进口24孔培养板(平底)、倒置显微镜、C02细胞培养箱、微量可调加样器、培养基为MEM(含青链双抗各250U/ml)，除菌过滤前用碳酸氢钠调pH至7.0-7.2、小牛血清经56°C30min灭活补体，除菌分装；消化液为5%胰蛋白酶5ml+0.01mol/L(pH7.2)PBS93ml，除菌分装，低温保存。2、病毒和细胞株单纯疱疹病毒1型毒株是来源于美国ATCC(VR733)，由申请人所在的实验室保存。MRC-5细胞购自中国科学院细胞库，由申请人所在的实验室保存。MRC-5细胞系来自14周龄男性胎儿'的正常肺组织，是正常二倍体细胞系，是疱疹病毒敏感细胞。MRC-5细胞用含10%胎牛血清的MEM培养基连续传代3次保持在对数生长期，供实验用，维持液为含2%小牛血清的MEM培养基。3、药物将10mg药物先加入100WDMSO(二甲基亚砜)溶解后配成储存液，-2CTC保存备用。阳性对照药无环鸟苷(ACV)为湖北科益药业股份有限公司产品，临用前用MEM维持液稀释。(二)三七皂苷ST-4对HSV-1预防作用药物稀释1mg样品溶于10WDMSO配制药物母液，-20°C长期保存，使用时用MEM维持液稀释，倍比稀释为50Pg/ml，25]Lig/ml，12.5Pg/ml，6.25Pg/ml，3.125Pg/ml。阳性对照药ACV稀释药物10mg样品溶于100W去离子水配制药物母液，4'C长期保存，使用时用MEM维持液稀释，稀释为50Pg/ml，25Pg/ml，12.5Pg/ml，6.25Pg/ml，3.125Pg/ml。分别以不同浓度的三七皂苷ST-4维持液和ACV维持液各100Pl/L加到单层MRC-5细胞的孔中，每个浓度设4个复孔，培养2小时后，接种100TCID50HSV-1病毒液100Ml/孔，置于5%C02细胞培养箱继续培养2小时，病毒完全吸附到细胞后，加入完全覆盖液800Ml，培养72小时，观察药物处理后的细胞对HSV-l感染的影响，同时设定病毒对照组、正常细胞对照组，实验重复3次。试验分析方法72小时后，病毒对照组的细胞不再出现空斑时，弃去维持液，以10%甲醛溶液固定30分钟，然后用5%结晶紫溶液染色后作空斑计数，计算空斑抑制率。空斑抑制率(％)二(病毒对照组空斑数-药物处理组空斑数)/病毒对照组空斑数XIOO%计算IC5。(半数抑制浓度)，计算方法为加权直线回归法，从而估测三七皂苷ST-4对HSV-1的感染有无预防作用。结果显示:三七皂苷ST-4药物对预防HSV-1感染的半数有效剂量(IC5。)为200.02Pg/ml。(三)对HSV-1感染治疗作用三七皂苷ST-4药物和阳性对照药物ACV的稀释方法同上。先接种100TCID50的HSV-1于24孔板的单层MRC-5细胞上，在37'C、C02细胞培养箱吸附2小时，再加入相应浓度三七皂苷ST-4稀释液和ACV，100W/孔，每个浓度设定4个复孔，置于5%(:02细胞培养箱继续培养72小时，观察空斑形成的情况。同时设病毒对照组、正常细胞对照组，实验重复3次。试验分析方法统计不同的药物浓度作用下的空斑形成数目，计算IC50。结果显示ICs。为50.12Pg/ml。(四)对HSV-1感染细胞的综合作用药物三七皂苷ST-4和阳性对照药ACV稀释方法如上。不同浓度三七皂苷ST-4维持液和病毒各100W混合后，200Pl/孔加到24孔板单层MRC-5细胞上，每个浓度设定4个复孔，置于5%(:02细胞培养箱培养72小时，观察药物对HSV-1感染细胞的综合作用。同时设病毒对照组、正常细胞对照组，实验重复3次。试验分析方法统计各药物浓度作用下的空斑形成数，计算IC50。结果显示ICs。为50.34Pg/ml。结论(1)三七皂苷ST-4对HSV-1感染的细胞有一定的预防作用。(2)三七皂苷ST-4对HSV-1感染的细胞具有治疗作用。(3)三七皂苷ST-4可降低HSV-1对MRC-5细胞的感染性。实施例3:片剂实施例1所得化合物三七皂苷ST-410mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸镁5mg;制备方法将化合物、乳糖和淀粉混合.，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，化合物含量为10mg。安瓿剂实施例1所得化合物三七皂苷ST-42mg，氯化钠10mg;制备方法:将化合物和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。实施例5:胶囊剂实施例1所得化合物三七皂苷ST-410mg，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg;制备方法将化合物与助剂混合，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。权利要求1、如结构式(I)所示的达玛烷型三萜皂苷三七皂苷ST-4，2、药物组合物，含有三七皂苷ST-4和药物学上可接受的载体。3、制备权利要求1所述化合物三七皂苷ST-4的方法，取三七，经粉碎成颗粒状后，置于高温120。C下蒸制12小时得熟三七，然后用工业乙醇对其回流提取四次，回收乙醇后浓縮得浸膏，浸膏用水溶解，经大孔树脂柱层析，甲醇洗脱得总皂苷，再经200—300目硅胶柱层析，85:15:1的氯仿一甲醇一水洗脱，共得9个组分，组分7经硅胶柱、反相柱反复层析，得到三七皂苷ST-4。4、如权利要求3所述的方法，其特征在于三七粉碎成颗粒状后，用双层纱布包裹，置于高温120°C的高压锅，蒸制12小时后得熟三七，用工业乙醇回流提取4次，减压回收溶剂浓縮后得浸膏，将浸膏用水溶解，用D101大孔吸附树脂分两次进行柱层析，先用水洗脱至流出液Molish反应呈阴性，再用工业甲醇洗脱即得粗皂苷；将粗皂苷用硅胶200—300目拌样，经硅胶柱层析，用85:15:1氯仿-甲醇-水洗脱，共得9个组分，组分7经硅胶柱层析，从梯度80:20:2氯仿-甲醇-水逐步增加极性，得到组分7，经硅胶柱层析，再从80:20:2氯仿-甲醇-水逐步增加极性，得到组分3，经硅胶柱层析，从80:20:2氯仿-甲醇-水逐步增加极性洗脱，得到组分1，组分1用反相RP-18分离，流动相为70:30甲醇-水，逐步增加甲醇浓度，得第10号流分，将此流分再行反相RP-18柱层析，流动相为75:25甲醇-水，逐步增加甲醇浓度，得到的l号流分，最后经MCICHP20P反相柱纯化，流动相为80:20甲醇-水，逐步增加甲醇浓度，最终得到达玛烷型四环三萜皂苷化合物三七皂苷ST-4。5、权利要求1所述的三七皂苷ST-4在制备抗单纯疱疹病毒1型药物中的应用。6、权利要求1所述的三七皂苷ST-4在制备治疗单纯疱疹病毒1型相关疾病的药物中的应用。全文摘要提供结构式(I)所示的一种新的达玛烷型三萜皂苷化合物三七皂苷ST-4(notoginsenosideST-4)，及其制备方法，并提供其在制备抗单纯疱疹病毒I型(HSV-1)药物中的应用。以单纯疱疹病毒1型(HSV-1)毒株和人胚肺成纤维细胞(MRC-5)细胞实验对象，进行本发明新化合物三七皂苷ST-4的抗病毒活性实验，结果证明三七皂苷ST-4对HSV-1感染的细胞具有治疗作用；并可降低HSV-1对MRC-5细胞的感染性，可在制备抗单纯疱疹病毒I型药物中得到应用。文档编号A61P31/12GK101323635SQ20081005872公开日2008年12月17日申请日期2008年7月25日优先权日2008年7月25日发明者廖彭莹,张颖君,杨崇仁,东王,王一飞,赢裴申请人:中国科学院昆明植物研究所