一种神经损伤治疗药物及其制备方法

专利名称：：一种神经损伤治疗药物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种神经损伤治疗药物及其制备方法，属于生物医药
技术领域：
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背景技术：
：目前国内外在治疗神经损伤方面，都有采用单一的神经生长因子NGF或神经营养因子NTF类药物的报道，有釆用口服的(熊郁良等治疗外周神经系统疾病和男性生殖缺陷的药品的制备方法，专利申请号00116192.X,2001年7月25日公开)，也有釆用肌肉注射的，虽然具有一定效果，但疗效差。其原因是这些常规给药方式所对应的药物，神经生长因子NGF在体内的衰亡速度较快，在神经损伤部位的剂量已经很少，所以疗效也就有限，特别是口服药物的疗效就更差。为了使损伤部位有较高的NGF，国内外有釆用单一植入NGF研究及试验，由于损伤部位缺少生存环境，缺乏促进神经细胞生长分化以及促进神经纤维生长的NGF、NTF等因子，从而导致植入细胞过早凋亡，难以使受损部位的神经细胞自身恢复生长分化。另外有试验证明，过量注射NGF可能导致神经纤维生长过密，排列紊乱，影响郎氏结等形成，相反会导致神经传导阻滞，产生瘫痪，所以大多采用较为安全的肌肉注射。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种神经损伤治疗药物及其制备方法，所述的植入式药物利于使培养细胞和损伤部位神经细胞既获得新的营养和促生长所需NGF，植入细胞又能尽快分离、增值到损伤神经部位修复原被损伤、坏死或衰亡细胞，治疗效果更安全、更显著。解决本发明的技术问题所釆用的技术方案是本发明的药物为被治疗动物的神经干细胞与神经生长因子NGF或神经营养因子NTF共同培养而成，其中活细胞含量不低于85%,NGF或NTF不少于2500单位5000单位，细胞含量不少于400x1()4个/ml600x104+/ml。所述的神经生长因子NGF或神经营养因子NTF是从眼镜蛇蛇毒中分离提取的物质，也可以采用从人、鼠或其他动物物种获取的神经生长因子或神经营养因子。而所述药物的有效成分中的神经干细胞可以包括从脐带血和嗅神经细胞提取的。本发明的制备工艺方法是将从人胚胎或组织获取的神经干细胞的神经节放在培养液中清洗，恒温37。C培养48小时后，加入神经生长因子NGF或神经营养因子NTF和培养液共同培养8天后，使细胞含量不少于400x10"个/ml600x1(^个/ml，活细胞含量不低于85%，NGF或NTF不少于2500单位~5000单位，制备成植入受损部位或脊髓软脊膜的专用药物。制备方法还包括神经生长因子NGF或神经营养因子NTF是从眼镜蛇蛇毒中分离提取；首先对神经节清洗所用的培养液釆用1640或199，然后对NGF或NTF共同培养所用的混合培养液为，占重量85%的1640或199基础培养液和15%的新生小牛血清，并还另外加入了青霉素100单位/ml、链霉素100jig/ml，培养液保持在pH7.0;神经干细胞釆用不能继续怀孕胎儿的脊髓，且新鲜脊髓取下在30分钟内，经反复清洗后，剪碎成lmm的神经节。本项目从国产眼镜蛇蛇毒中分离纯化神经生长因子NGF,结构测定结果表明与人P链、小鼠颌下腺NGF同源性达83%以上，但稳定，含量为2/10000,高于其他动物及组织含量。实验首先利用棉酚造成雄性大鼠生殖缺陷模型，证明其能显著增加损伤后导致的精子数下降，提高精子活力，激素FSH、LH显著降低，合笼后生植数、怀孕率显著增加并接近正常对照组，与生理盐水治疗组相比P〈0.1,这表明该药对男性生殖缺陷有较好的治疗作用。病理检查证明间质细胞、支持细胞明显恢复，精囊充盈，证明被损伤的生殖系统有明显恢复。实验还证明对鸡胚背根神经节、PC12细胞神经生长有显著促进作用，活性高于人(3链神经生长因子。首次在国内外证明对金丝猴和人施旺氏细胞生长有显著促进分裂、细胞增殖和延缓衰老的作用。正常培养8天后减少，加该因子培养16天后生长良好。研究还证明对大鼠、猫坐骨神经损伤致瘫痪动物有明显恢复作用，诱发电位证明感觉和运动神经电位与对照相比明显恢复快P〈0.01，病理切片证明神经纤维明显增长，受体增加，并呈量效关系。我们首先证明在损伤部位过量应用神经生长因子将导致神经纤维过量生长，传导浪氏结紊乱，相反影响疗效，为药物应用提供重要依据，可能是解决国内外该类药物临床疗效差的关键。我们还证明该药对去部分背根猫脊髓背角内GAP-43阳性颗粒明显增加，且呈量效关系。同时证明对脊髓半切断、全切断大鼠瘫痪模型有显著量效作用，肢体瘫痪经3月治疗基本能爬行，游泳与对照相比有显著疗效，同时完成3只猴瘫痪模型研究，配合复尔康、施旺氏细胞移植治疗3月后基本能爬行或行走、跳跃，病理切片证明损伤部位神经纤维生长、增生，损伤的神经细胞有显著恢复。在国内外首先将神经生长因子NGF、NTF、神经干细胞等联合用于治疗50多例瘫痪病人，患者均显著恢复活动功能并站立，部分患者已能行走。本发明的有益效果还包括将NGF与神经干细胞共同培养，做有利于使培养细胞和损伤部位神经细胞既获得新的营养和促生长所需NGF,同时植入细胞能尽快分离、增值到损伤神经部位修复原被损伤、坏死或衰亡细胞。为损伤部位神经细胞增生提供大量正在增殖新生神经干细胞，使受损部位得到修复。本方法除在培养期加入NGF外，移植时也加入大量NGF,这样可使培养液中正在增值神经干细胞有充足营养成分，同时也弥补了受损后NGF分泌量减少导致受损细胞停止长出神经节、坏死、衰亡等现象。因此，将NGF与神经干细胞二者混合使用优于现有技术单独植入NGF或神经干细胞。国内外现有研究仅限于动物试验，本项目已完成大鼠、猴、动物试验，并同时进行50多例人临床研究，总有效率80%以上。部分患者能站立或借助工具行走。图1为本发明培养30小时后的鸡胚背根神经节图；图2为本发明培养10天后的PC12细胞；图3为本发明的人施旺氏细胞与神经生长因子共同培养实验结果；图4为金丝猴施旺氏细胞与NGF共同培养8天后实验结果；图5为施旺氏细胞与NGF治疗瘫痪猴子的实验结果；图6为施旺氏细胞与NGF治疗瘫痪猴子的实验结果；图7为施旺氏细胞与NGF治疗瘫痪患者的治疗结果；图8为施旺氏细胞与NGF治疗瘫痪患者的治疗结果；图9为施旺氏细胞与NGF治疗瘫痪患者的治疗结果。具体实施例方式实施例l:将从人胚胎取下30分钟内的新鲜脊髓用1640或199培养液反复清洗，剪碎成lmm左右的神经节，在37。C的恒温箱中培养48小时，加入眼镜蛇蛇毒神经生长因子NGF和培养液共同培养8天后，该培养液为占重量85%的1640或199与15%的新生小牛血清混合培养液，并且另外加入了青霉素100单位/ml、链霉素100pg/ml，培养液保持在pH7.0。最终使共同培养成组合药物中的细胞含量不少于400x1(/个/m卜600x1(^个/ml，活细胞含量不低于85%,NGF不少于2500单位~5000单位。冻存、传代。手术前复苏冻存细胞，植入损伤部位脊髓软脊膜内。实施例2:从金丝猴体上取下新鲜脊髓，在30分钟内用1640或199培养液反复清洗，剪碎成lmm左右的神经节，在37'C的恒温箱中培养48小时，加入小鼠颌下腺神经生长因子NGF和培养液共同培养8天后，该培养液为占重量85°/。的1640或199与15°/。的新生小牛血清混合培养液，并且另外加入了青霉素100单位/ml、链霉素100jag/ml，培养液保持在pH7.0。最终使共同培养成组合药物中的细胞含量不少于400x1(/个/ml600xl04+/ml,活细胞含量不低于85%,NGF不少于2500单位~5000单位。冻存、传代。手术前复苏冻存细胞，植入金丝猴损伤部位脊髓软脊膜内，对金丝猴前角运动N细胞生长速度的测定结果详见表1。实施例3:从小鼠体上取下新鲜脊髓，在30分钟内用1640或199培养液反复清洗，剪碎成lmm左右的神经节，在37。C的恒温箱中培养48小时，加入眼镜蛇蛇毒神经生长因子NGF和培养液共同培养8天后，该培养液为占重量85%的1640或199与15%的新生小牛血清混合培养液，并且另外加入了青霉素100单位/ml、链霉素100|ag/ml,培养液保持在pH7.0。最终使共同培养成组合药物中的细胞含量不少于400x1(^个/m卜600x1(^个/ml，活细胞含量不低于85%，NGF不少于2500单位~5000单位。冻存、传代。手术前复苏冻存细胞，植入小鼠被钳夹伤的坐骨神经周围，对小鼠的痛觉恢复测定结果详见表2。以下为实验案例体外实验案例l:釆用滇金丝猴施旺氏细胞(SC)和蛇毒NGF共同培养，并在等同条件下，加等量甘露醇为对照，结果证明，细胞培养增殖期在第4天，高峰期在第8天，加神经生长因子实验组在培养期分裂增长显著高于对照组，对照组在培养8天后开始凋亡，实验组凋亡显著延缓，见表l。表l:前角运动N细胞生长速度测定<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>案例2:将神经生长因子或NTF(10-100单位/ml)加入鸡胚背根神经节共同培养能促进神经纤维显著增长，对照组不加NGF(见图1)培养30小时后的鸡胚背根神经节A:对照组，少量短粗的神经纤维从神经节长出(x40);B:NGF组(30ng/mlNGF),大量神经纤维从神经节放射状长出(x40)。案例3:PC12细胞实验加入NGF或NTF(5~30ng/ml)能显著生长神经纤维，对照组不加NGF则几乎保持原状，极少长出神经节(见图2)。C:对照组，细胞呈圆球形(x400);D:NGF组(20ng/mlNGF),大量PC12细胞分化成神经元样细胞(x400)。体内研究案例4:NGF、NGF+神经干细胞培养在用钳夹伤小鼠坐骨神经后，进行痛觉恢复实验，结果表明，NGF+施旺氏细胞组恢复较好，痛觉恢复平均时间明显提前，优于NGF高剂量组。见表2表2:NGF对坐骨神经钳夹伤的小鼠痛觉恢复影响(n=2)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实验组与对照组相比P<0.01案例5:采用猫钳夹损伤坐骨神经致瘫痪模型测定NGF对瘫痪动物治疗作用结果表明，两组均有显著差异。病理切片检查结果表明，神经纤维生长明显恢复，并出现郎氏节，免疫组化表明，神经细胞受体明显增加，主要分布在核周围，受体一定增加，但无显著性，是否与NGF在动物、人体内分布较广有关，尚待进一步探讨。见表3表4。表3:NGF对猫坐骨神经损伤行为学观察<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>案例6:大鼠试验大鼠脊髓全切断动物模型测定结果表明，每组10只成年鼠体重200±22克，注入培养后大鼠神经干细胞400x104个/111卜600><104个/ml，NGF2500~5000单位/ml。移植一个月后动物游泳实验证明，显著优于单独移植神经干细胞组和单独每周注射2500~5000单位/ml组和生理盐水组(见表4)。表4:实验组对照组不同治疗时间游泳时间统计(n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结果显示治疗组与对照组相比，有显著差异P〈0.01,其中"NTF+施旺氏细胞组"和"NGF+施旺氏细胞组"恢复很好，单用NGF与施旺氏细胞亦有一定疗效，但瘫痪恢复没有合用好。病理切片检查神经纤维生长，尼氏体、神经突触、神经髓鞘均有明显恢复，与对照组相比有显著差异，而对照出现坏死、空泡、出血、脱髓鞘等明显病变，切片和免疫组化正进行中。我们与国内相关研究结果还证明，NGF对大鼠坐骨神经钳夹伤和四氧嘧嗖造成糖尿病神经末梢损伤模型感觉诱发电位有显著恢复，达60%左右，而运动神经损伤有一定恢复，但不显著。案例7:猴子试验三只猴子脊髓半切断30天后，植入400x104+/ml~600xl(^个/ml神经干细胞(与NGF共同培养)，经2个月饲养后，猴子能站立行走。其中两只经半年治疗后基本恢复正常。见图5、6。对照组手术恢复不能站立。动物病理切片证明，神经损伤显著恢复案例8:人治疗结果经有关部门批准，与医院合作进行30余例患者治疗试验。结果证明，患者瘫痪显著改善，其中20余例能借助机械帮助站立行走。见附图7~9。权利要求1、一种神经损伤治疗药物，其特征是药物为被治疗动物的神经干细胞与神经生长因子NGF或神经营养因子NTF共同培养而成，其中活细胞含量不低于85％，NGF或NTF不少于2500单位～5000单位，细胞含量不少于400×104个/ml～600×104个/ml。2、按权利要求1所述的神经损伤治疗药物，其特征是神经生长因子NGF或神经营养因子NTF是从眼镜蛇蛇毒中分离提取的物质。3、按权利要求1所述的神经损伤治疗药物，其特征是神经生长因子NGF或神经营养因子NTF是从人、鼠或其他动物物种获取的物质。4、按权利要求2或3所述的神经损伤治疗药物，其特征是药物有效成分中神经干细胞包括脐带血和嗅神经细胞提取。5、一种神经损伤治疗药物的制备方法，其特征在于将从人胚胎或组织获取的神经干细胞的神经节放在培养液中清洗，恒温37。C培养48小时后，加入神经生长因子NGF或神经营养因子NTF和培养液共同培养8天后，使细胞含量不少于400x1()4个/ml600x1()4个/ml，活细胞含量不低于85%,NGF或NTF不少于2500单位~5000单位，制备成植入受损部位或脊髓软脊膜的专用药物。6、根据权利要求5所述的神经损伤治疗药物的制备方法，其特征在于神经生长因子NGF或神经营养因子NTF是从眼镜蛇蛇毒中分离提取；首先对神经节清洗所用的培养液釆用1640或199，然后对NGF或NTF共同培养所用的混合培养液为，占重量85%的1640或199基础培养液和15%的新生小牛血清，并还另外加入了青霉素100单位/ml、链霉素100|ag/ml,培养液保持在pH7.0;神经干细胞釆用不能继续怀孕胎儿的脊髓，且新鲜脊髓取下在30分钟内，经反复清洗后，剪碎成lmm的神经节。全文摘要一种神经损伤治疗药物及其制备方法，本发明属于生物医药
技术领域：
。本发明利用蛇毒神经生长因子NGF、神经营养因子NTF与神经干细胞、施旺氏细胞按以下方法实施取动物刚出生的幼崽或因天灾、人祸导致不能继续怀孕胎儿的整条脊髓，植入无菌PBS液或培养液中反复清洗剪碎所需神经节，在37℃恒温箱培养48hr后，加少量培养液，再培养8天后，冻存、传代。手术前复苏冻存细胞，植入损伤部位脊髓软脊膜内。本发明有利于使培养细胞和损伤部位神经细胞既获得新的营养和促生长所需NGF，植入细胞又能尽快分离、增值到损伤神经部位修复原被损伤、坏死或衰亡细胞，治疗效果更安全、更显著。文档编号A61K31/7028GK101306194SQ200810058569公开日2008年11月19日申请日期2008年6月20日优先权日2008年6月20日发明者吕秋敏,吴健波,朱绍文,瑞李,熊郁良,王婉瑜申请人:奔驰生物科技(云南)有限公司