专利名称：ephrin-B2促周围神经损伤修复支架的制备方法
技术领域：
本发明涉及医疗器械技术领域，特别是涉及一种含印hrin-B2蛋白的促周围神经 损伤修复支架的制备方法。
背景技术：
Eph是一类受体，属于受体酪氨酸激酶(RTKs)家族的一个亚家族，是一种膜结 合蛋白，以跨膜形式存在于细胞膜表面。Ephrin ( Eph family receptor interacting proteins )是与Eph相结合的配体，二者相结合后介导细胞间信号转导。Ephrin分为 ephrin-A和印hrin-B两个亚家族，其中ephrin_B包括三种蛋白质，即印hrin_Bl,、 ephrin-B2 禾口 ephrin_B3 。最新研究(ParrinelloS 等，Cell. 2010 Oct 1; 143(1) :145-55.)表明， ephrin-B2可以在周围神经损伤部位引导雪旺氏细胞定向生长，进而引导轴突向靶点的再 生，从而促进周围神经损伤修复。创伤或手术等造成的周围神经缺损是修复重建外科的常见疾病，患者通常会面 临不同程度的肢体感觉和运动机能障碍所导致的劳动能力丧失或生活不能自理。为此，临 床上需要大量移植物作为修补材料。目前，自体神经移植能够达到的最佳修复效果，但来源 有限并会导致供区功能障碍；异体神经移植除了这些问题外还面临排斥反应等问题；这就 使自体、异体神经移植的应用受到限制，不能满足临床需要。所以，采用组织工程方法修复 周围神经缺损是解决这一难题的出路。采用组织工程方法修复周围神经缺损是以研制植入型神经损伤修复器械，即“人 工神经”为主要内容。一般来讲，人工神经包括神经导管和神经支架，主要用于周围神经缺 损部位的桥接，以促进受损轴突向靶点的再生，从而实现肢体感觉和运动机能障碍的全部 或部分恢复。目前，在国内外的人工神经研究中，取得了许多进展，但是，取得临床应用许可的 并不多，而且全集中在国外，如获得美国FDA批准的有NeuraGen、SaluBridge, Neurolac、 Neuro Matrix、 Neuroflex 禾口 Neurotube 等品牌。从国家食品药品监督管理局相关数据库检索结果显示，在“进口器械”和“国产器 械”栏目中，均未检索到人工神经类产品。仅在“医疗器械检测中心受检目录”中检索到“神 经修复导管” 一项。从我国知识产权局相关数据库检索结果来看，目前获得授权的人工神经移植物专 利近100项。其中，国内机构的相关专利主要集中在材料和种子细胞的选择方面，国外机构 的相关专利主要侧重在生物活性物质在神经损伤修复中的作用。细胞外基质是指动物组织经去细胞处理后余下的水不溶解性物质，主要为胶原蛋 白。哺乳动物(包括人类)组织来源细胞外基质已经被大量应用于生物组织工程领域。在神 经支架的制备中，以动物去细胞神经作为主要材料的研究最具代表性，并取得了良好的实 验结果。但是，来自异体的细胞外基质，仍不可避免地存在一定程度的免疫原性。采用患者自体皮肤来源的细胞外基质制备神经支架的研究尚未见报道。人工合成材料也被普遍应用于神经支架的研制中。如聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸 聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、羧基乙酸内酯、氨基甲酸乙酯、环氧乙烷、聚B-羟 基丁酸(PHB)、聚乙二醇、生物可降解玻璃等。在这些合成材料中，PLGA由于具有良好的生 物相容性而倍受关注。但是，单独由PLGA制备的材料太硬，不易制备成非常规范的形状，所 以，PLGA最好是与其他材料混合使用。雪旺氏细胞是周围神经系统的主要胶质细胞，由khwarm于1939年首先发现并 命名。在周围神经系统中，雪旺氏细胞在轴突外形成鞘膜，对轴突起营养和保护作用。在神 经损伤的修复中，雪旺氏细胞去分化成祖细胞，引导轴突向靶点生长。轴突的生长方向是由 雪旺氏细胞的的聚结方式所决定的。
发明内容
本发明的目的是提供一种ephrin-B2促周围神经损伤修复支架的制备方法，该方 法采用患者自体皮肤来源的细胞外基质与人工合成材料聚乳酸聚羟基乙酸共聚物(PLGA) 等主要材料制备，依次通过如下步骤实现
(1)取一定量的患者皮肤，去除表皮及皮下组织，加工成膜状，经去细胞处理、冷冻干燥 后作为材料I备用；
(2)在患者周围神经受损部位取一定量的神经，常规体外培养获得雪旺氏细胞备用；
(3)将材料I沿长边加工成纤维状，在浓度为0.001 0.1微克/L的印hrin-B2蛋白 水溶液中浸泡lOmin，冷冻干燥，再在浓度为10 50g/L的PLGA的三氯甲烷溶液中浸泡， 抽干三氯甲烷后作为材料II备用；
(4)将材料II与雪旺氏细胞悬浮液共培养3d后作为材料III备用；
(5)将聚乳酸聚羟基乙酸共聚物PLGA制备成内径与患者周围神经受损部位神经外径 大致相等的管状物作为材料IV备用；
(6)将材料III植入材料IV的管腔中，至管腔容积饱和，即为印hrin-B2促周围神经损伤 修复支架。上述方法步骤(1)所述的一定量的皮肤是指10 mm(寛)X 30 60 mm (长)面积的 皮肤；步骤(2)所述的一定量的神经是指1 10 mm长的神经；步骤(3)所述的纤维状材料 的粗度为0. 1 0. 5 mm XO. 1 0. 5 mm。上述支架在细胞培养基(含10%胎牛血清的DMEM)中低温密封保存备用。本发明的优点是
1、本发明支架对轴突再生具有有效引导作用，与现有技术相比，可以修复更长距离的 神经缺损。由于具有对印hrin-B2进行可控释放的功能，可以持续地发挥印hrin-B2对轴 突再生的引导作用，故可以实现更好的神经缺损修复效果。2、Parrinello S等对印hrin_B2的研究是基于周围神经断裂后，将断端直接缝 合，断裂神经可以自行修复，但是将断端直接缝合不能解决缺失神经的神经修复。本发明是 基于周围神经断裂后断端间神经缺失，将本发明连接在断端间，以促进周围神经缺失部位 的修复，具有更高的难度和临床应用价值。3、利用患者自体皮肤作为神经支架的材料，并利用患者自体周围神经受损部位的神经，获得雪旺氏细胞作为制备神经支架的材料，可以有效地避免神经支架的免疫原性。这 种取材方式，可以将由于取材操作对患者造成的机能损害控制在最低水平。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明方法进行详细描述，下面的描述是为了进一步说明本发 明，而不构成对本发明的限定。实施例1
1)在患者创部取10mm (寛)X 50 mm (长)面积的皮肤，去除表皮及皮下组织，切割成10 mm(寛)Xl mm (厚)χ 50 mm(长)的膜状，经常规去细胞处理、冷冻干燥后作为材料I备用；
2)在患者周围神经受损部位沿断端取10mm长的神经，常规体外培养获得雪旺氏细胞
3)将材料I加工成0.5mm(寛)χ0.5 mm(厚)X50 mm(长)的纤维状，在浓度为0. 1微 克/L的印hrin-B2蛋白水溶液中浸泡lOmin，冷冻干燥，再在浓度为10g/L的PLGA的三 氯甲烷溶液中浸泡，抽干三氯甲烷后作为材料II备用；
4)将材料II与雪旺氏细胞悬浮液(细胞浓度为IXIO5个/ml)共培养3d后作为材料 III备用；
5)将PLGA制备成内径与患者周围神经受损部位神经外径大致相等(士0.5mm)的管状 物作为材料IV备用；
6)将材料III植入材料IV的管腔中，至管腔容积饱和，即为印hrin-B2促周围神经损伤 修复支架，在细胞培养基(含10%胎牛血清的DMEM)中低温密封保存备用。 实施例2
1)在患者创部取10mm (寛)X 60 mm (长)面积的皮肤，去除表皮及皮下组织，切割成10 mm(寛)X0. 5 mm (厚)X60 mm(长)的膜状，经常规去细胞处理、冷冻干燥后作为材料I备用；
2)在患者周围神经受损部位沿断端取5mm长的神经，常规体外培养获得雪旺氏细胞
3)将材料I加工成0.1 mm(寛)χο· 1 mm(厚)χ60 mm(长)的纤维状，在浓度为0. 01微 克/L的印hrin-B2蛋白水溶液中浸泡lOmin，冷冻干燥，再在浓度为50g/L的PLGA的三 氯甲烷溶液中浸泡，抽干三氯甲烷后作为材料II备用；
4)将材料II与雪旺氏细胞悬浮液(细胞浓度为IXIO7个/ml)共培养3d后作为材料 III备用；
(其他步骤如实施例1) 实施例3
1)在患者创部取10mm (寛)X 30 mm (长)面积的皮肤，去除表皮及皮下组织，切割成10 mm(寛)XO. 5 mm (厚)χ 30 mm(长)的膜状，经常规去细胞处理、冷冻干燥后作为材料I备用；
2)在患者周围神经受损部位沿断端取1mm长的神经，常规体外培养获得雪旺氏细胞
3)将材料I加工成0. 2 mm (寛)XO. 2 mm (厚)χ 30 mm (长)的纤维状，在浓度为0. 001微 克/L的印hrin-B2蛋白水溶液中浸泡lOmin，冷冻干燥，再在浓度为30g/L的PLGA的三 氯甲烷溶液中浸泡，抽干三氯甲烷后作为材料II备用；4)将材料II与雪旺氏细胞悬浮液(细胞浓度为IX IO6个/ml)共培养3d后作为材料 III备用；
(其他步骤如实施例1)
权利要求
1.一种印hrin-B2促周围神经损伤修复支架的制备方法，其特征在于，依次通过如下 步骤实现(1)取一定量的患者皮肤，去除表皮及皮下组织，加工成膜状，经去细胞处理、冷冻干燥 后作为材料I备用；(2)在患者周围神经受损部位取一定量的神经，常规体外培养获得雪旺氏细胞备用；(3)将材料I沿长边加工成纤维状，在浓度为0.001 0. 1微克/L的印hrin-B2蛋白 水溶液中浸泡lOmin，冷冻干燥，再在浓度为10 50g/L的PLGA的三氯甲烷溶液中浸泡， 抽干三氯甲烷后作为材料II备用；(4)将材料II与雪旺氏细胞悬浮液共培养3d后作为材料III备用；(5)将聚乳酸聚羟基乙酸共聚物PLGA制备成内径与患者周围神经受损部位神经外径 大致相等的管状物作为材料IV备用；(6)将材料III植入材料IV的管腔中，至管腔容积饱和，即为印hrin-B2促周围神经损伤 修复支架。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的一定量的皮肤是指10 mm X30 60 mm面积的皮肤；步骤(2)所述的一定量的神经是指1 10 mm长的神经；步骤 (3)所述的纤维状材料的粗度为0. 1 0. 5 mm X0. 1 0. 5 mm。
全文摘要
一种含ephrin-B2蛋白的促周围神经损伤修复支架的制备方法，利用患者自体皮肤作为神经支架的材料，并利用患者自体周围神经受损部位的神经，获得雪旺氏细胞作为制备神经支架的材料，这种取材方式，可以将由于取材操作对患者造成的机能损害控制在最低水平。本发明支架对轴突再生具有有效引导作用，与现有技术相比，可以修复更长距离的神经缺损。与断裂神经修复相比，本发明是基于周围神经断裂后断端间神经缺失，将本发明连接在断端间，以促进周围神经缺失部位的修复，具有更高的难度和临床应用价值。
文档编号A61F2/02GK102068326SQ20111004137
公开日2011年5月25日 申请日期2011年2月21日 优先权日2011年2月21日
发明者刘彬, 张耀光, 戴丽, 王志坚, 蒲德永 申请人:西南大学