三七花总皂苷在制备促进血管新生的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属中药制药领域，涉及中草药三七花中提取的活性部位三七花总皂苷在制备促进血管新生药物中的应用。本发明的三七花总皂苷经实验结果表明，对VRI诱导的血管损伤在前期有保护效果，在后期血管发育过程中具有促血管新生起到恢复的效果；对人脐静脉内皮细胞有增殖的作用；且，比三七（根）总皂苷有着更为显著的促血管新生和保护血管的效果。本发明地三七花总皂苷可作为的原料，进一步制备促进血管新生的药物制剂，用于冠心病、心肌缺血、侧支循环代偿建立不足、创伤和骨折愈合缓慢、闭塞性脉管炎等诸多血管新生不足相关疾病的防治。
【专利说明】三七花总皂苷在制备促进血管新生的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药【技术领域】，涉及三七花总皂苷在制药中的新用途，具体涉及三七花总皂苷在制备促进血管新生的药物中的应用。更具体的，本发明涉及三七花总皂苷在制备治疗血管新生不足相关疾病药物中的用途
【背景技术】
[0002]冠心病、心肌缺血、侧支循环代偿建立不足、创伤和骨折愈合缓慢、闭塞性脉管炎等都是临床常见病、多发病，是影响人民群众健康和生活质量的重要因素，而血管新生不足是这些疾病共同的重要病理生理基础，因此开展促血管新生作用的研究对诸多血管新生不足相关疾病的防治有着重要意义。[0003]血管新生(angiogenesis)是指成人在原始血管丛或已存在血管的基础上以发芽方式形成新生血管的过程，具有维持人体正常的生长和平衡的功能，在许多疾病的发生、发展及转归、预后中扮演着重要的角色。近年来，调节血管新生的研究已成为临床治疗中的热点。
[0004]研究显示了血管新生主要涉及基底膜的降解、内皮细胞迁移、增殖和管形成等过程，其中内皮细胞的增殖是血管新生的最主要指标之一。同时，内皮细胞功能障碍和死亡是动脉粥样硬化等多种心血管疾病的重要病理过程，因此，能够调节血管新生，保护内皮细胞功能的药物成为本领域研究人员尤其是临床实践中的关注热点。
[0005]三七(PanaxNotoginseng(Burk)F.H.Chen)是五加科多年生人参属植物，《本草纲目》载“止血，散血，定痛”。《玉揪药解》和营止血，通脉行瘀，行瘀血而敛新血。”近现代中西医汇通大家张锡纯谓三七:“能化腐生新，化瘀血而不伤新血。”1912年版《中国医药大辞典》则记“去瘀生新，消肿定痛”。既往多以根、茎入药，其提取物三七总皂苷具有多种药理活性，广泛用于临床心脑血管等多种缺血性疾病防治。三七花是三七的干燥花蕾，《中华本草》记载“性甘味凉，清热生津、平肝降压。主治津伤口渴，咽痛音哑，高血压病”。民间常用三七花作为高血压及其相关疾病的保健和治疗用药，虽历时悠久，但目前国内外对三七花的研究相对较少，其药用价值尚未未被充分开发利用。本发明拟提供三七花总皂苷新的药用用途。比三七(根)总皂苷有着更为优势的促血管新生和保护血管的效果。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供涉及三七花总皂苷在制药中的新用途，具体涉及三七花总皂苷在制备促进血管新生的药物中的应用。更具体的，本发明涉及三七花总皂苷在制备治疗血管新生不足相关疾病药物中的用途。
[0007]本发明的三七花总皂苷，通过下述方法制得:
[0008]采用三七花的干燥花蕾(产地:云南文山，购自云南文山科创中心有限公司)，选用AB-8大孔吸附树脂(天津南开大学化工厂)，装柱径高比为1:10，按每克生药1.25g干树脂上样，上样浓度为0.2g生药/ml，充分吸附后，水洗至无Molish反应，后以3倍树脂体积的70%乙醇溶液洗脱，吸附及洗脱流速均为2倍树脂柱体积/h，洗脱物蒸干后得到三七花蕾总皂苷的提取物，呈黑褐色。以高效液相色谱分析法测得含量为95%以上。使用前用DMSO配制为100mg/ml储备液，0.22 μ m滤膜过滤，_20°C储存。
[0009]本发明采用制得的三七花总皂苷，以三七(根)总皂苷为对照，进行对斑马鱼模型促血管新生作用的影响试验，结果显示，三七花总皂苷对VRI诱导的血管损伤在前期有保护效果，在后期血管发育过程中具有促血管新生起到恢复的效果；对人脐静脉内皮细胞增殖的作用试验，结果显示，三七花总皂苷对人脐静脉内皮细胞有增殖的作用；且，比三七(根)总皂苷有着更为显著的促血管新生和保护血管的效果。本发明地三七花总皂苷可作为的原料，进一步制备促进血管新生的药物制剂，用于冠心病、心肌缺血、侧支循环代偿建立不足、创伤和骨折愈合缓慢、闭塞性脉管炎等诸多血管新生不足相关疾病的防治。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是三七(根)总皂苷(PNS)和三七花总皂苷(Sanqi F)对Tg(flila_EGFP)yl斑马鱼胚胎SIVs血管的影响结果，
[0011]其中，(A) Controli0.2%DMS0处理的72hpf的斑马鱼肠下静脉血管，其形状类似与平滑的拱形结构；
[0012](B-D)浓度分别为 25、50、100 μ g/ml 的 PNS (E-G) Sanqi F 浓度分别为 25、50、100μ g/ml。箭头代表出芽肠下静脉血管； [0013]加药组与Control 对照，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01***Ρ〈0.001 ；PNS(50 μ g/ml)与 SanqiF(50 μ g/ml)对照，&Ρ〈0.05，$Ρ〈0.01 ；PNS (100μ g/ml)与 Sanqi F (100μ g/ml)对照，#P<0.001。
[0014]图2.是三七(根)总皂苷(PNS)和三七花总皂苷(Sanqi F)对VRI诱导Tg(flila-EGFP) yI斑马鱼ISVs和SIVs血管损伤模型的保护作用试验，
[0015]其中，(A)Control:0.2%DMS0 处理 24 小时的 48hpf 的斑马鱼；(B) VRI500ng/ml 处理三小时，0.2%DMS0处理24小时；(C-E)浓度分别为25，50，100 μ g/ml的PNS加药24小时；(F-H)分别为 25、50、100 μ g/ml 的 Sanqi F 处理 24 小时，效果较 PNS 强；(A，-B，)0.2%DMS0处理48小时的72hpf斑马鱼；(C，-H’)分别为(C-H)再加药处理24小时后的72hpf斑马鱼；(a-h)为(A，-H，)SIVs区域放大2倍；加药组与VRI组对照，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，***Ρ〈0.001 ;PNS (50 μ g/ml)与 Sanqi F (50 μ g/ml)对照，#Ρ〈0.001 ;PNS (100μ g/ml)%Sanqi F (100 μ g/ml)对照，&Ρ〈0.05。
[0016]图3是三七(根)总皂苷(PNS)和三七花总皂苷(Sanqi F)对人脐静脉内皮细胞增殖的影响试验，
[0017]其中，HUVECs种于96孔板中，饥饿处理24小时后加药48小时，用XTT检测细胞活力，实验重复不少于三次，结果显示，加药组与Control对照，*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01和***Ρ〈0.001。Sanqi F与PNS各浓度之间均无显著性差异。
【具体实施方式】
[0018]实施例1三七花总皂苷对斑马鱼模型促血管新生作用的影响试验
[0019]I，材料与方法[0020]动物转基因斑马鱼Tg (f lila-EGFP) yl,由美国 Zebrafish InternationalResource Center (Oregon, PO)公司提供。斑马鱼依据 zebrafish handbook 方法饲养。
[0021]药物、试剂与仪器三七花，云南文山科创中心有限公司提供(产地:云南文山)，选用AB-8大孔吸附树脂(天津南开大学化工厂)，装柱径高比为1:10，按每克生药1.25g干树脂上样，上样浓度为0.2g生药/ml，充分吸附后，水洗至无Molish反应，后以3倍树脂体积的70%乙醇溶液洗脱，吸附及洗脱流速均为2倍树脂柱体积/h，洗脱物蒸干后得到三七花蕾总皂苷的提取物，呈黑褐色。以高效液相色谱分析法测得含量为95%以上。三七(根)总皂苷由澳门大学中华医药研究院张庆文博士提供，以高效液相色谱分析法测得含量为95%以上。临用前均用DMSO配制为100mg/ml储备液，0.22 μ m滤膜过滤，_20°C储存。
[0022]内皮细胞生长因子受体抑制剂(VEGF receptor kinase inhibitorll, VRI),购于美国Calbiochem公司(Cat.N0.676481)，溶解在DMSO中配制为500 μ g/ml储备液，_20°C储存；紫外可见光分光光度计，UV8453Agilent Technologies ;奥林巴斯旋转盘共聚焦显微镜系统，日本Olympus产品。
[0023]正常健康转基因斑马鱼模型实验:选择状态良好，发育至24h的转基因斑马鱼Tg (f l1-la:EGFP) yl胚胎，除去卵壳，将其放入含有饲养液的12孔板中(每孔不少于10个)，加入用DMSO溶解的25、50、100 μ g/ml的三七(根)总皂苷和三七花总皂苷，以0.2%的DMSO为空白对照，放入28.5° C的饲养箱，饲养至约48hpf时，清洗12孔板上的加药孔，重新加入饲养液和不同浓度的药物，操作同第I天，约至72hpf时，在荧光显微镜下观察斑马鱼肠下静脉血管的状态。
[0024]VRI诱导血管损伤转基因斑马鱼模型实验:选择状态良好，发育至21h的斑马鱼胚胎，除去卵壳，将其放入饲养液的12孔板中(每孔不少于10个)，预先加入VRI500ng/ml，在饲养箱里处理3h，然后用饲养液清洗3~4遍，再加入用DMSO溶解的25、50、100 μ g/ml三七花总皂苷和三七(根)总皂苷，以0.2%的DMSO为空白对照，加入VRI后加0.2%DMS0组为阴性对照，放入28.5° C的饲养箱里，饲养至约48hpf时，清洗12孔板上的加药孔，重新加药，操作同前，约至72hpf时，在荧光显微镜下观察PNS和Sanqi F在不同浓度对斑马鱼节间血管以及肠下静脉血管的影响。
[0025]在正常健康斑马鱼模型上，通过统计肠下静脉血管(SIVs)的光滑拱形结构外围出芽平均数(出芽总数除以该组斑马鱼数量)以及出芽斑马鱼在每组中所占的比例(出芽斑马鱼数目除以总斑马鱼数目)来评估PNS和Sanqi F对斑马鱼血管新生的影响；在VRI诱导血管损失模型中，将从背主动脉(DA)或者脊椎主静脉(PCV)发芽延伸并连接到背部脊索血管(DLAVs)的ISVs定义为完整血管(intact )，而一些已经从DA或者PCV延伸出，但是并无与DLAVs相连的ISVs定义为缺陷型血管(defective)，分别对每条斑马鱼的完整型和缺陷型血管进行统计分析，每组至少15条斑马鱼，结果用mean±SD表示，不少于三次重复实验。
[0026]结果显示:
[0027]1，对正常健康斑马鱼肠下静脉血管(SIVs)的影响
[0028]正常健康转基因斑马鱼模型实验中，在三七花总皂苷和三七(根)总皂苷的最高无毒浓度下，正常斑马鱼的ISVs血管无明显变化；相对而言，在72hpf的SIVs区域，加药组与对照组出现了显著的变化，对照组的SIVs区域是一个类似于篮网的光滑拱形结构，内部有4~6根血管(如图LA所示);25、50、100 μ g/ml PNS (如图1.B-D所示)和Sanqi F (如图1.E-G所示)从24hpf处理到72hpf，光滑的拱形血管外围出现了不同程度的尖锐的出芽血管；数据分析得出，在相同浓度下PNS的出芽率以及平均出芽数目均没有Sanqi F高，并且前者不具有浓度依赖关系，而Sanqi F在50和100 μ g/ml浓度下均与相同浓度下的PNS表现出显著性差异。
[0029]2，对VRI诱导血管损伤斑马鱼模型节间血管(ISVs)的保护作用
[0030]VRI诱导血管损伤转基因斑马鱼模型实验中，空白对照组的SIVs区域是一个类似于篮网的光滑拱形结构，内部有4飞根血管，ISVs区域完整，平均数目为28根，完好连接DA和DLAVs(如图2.A-A’ _a所示);而VRI对照组(如图2.B_B’ _b所示)，ISV和SIVs以及DLAVs均出现了明显的缺失；VRI空白对照组平均有2根完整ISVs，平均有3根缺陷型ISVs ;在25 (如图 2.C-C’ -C 所示)，50 (如图 2.D_D’ _d 所示)，100 (如图 2.E-E’ _e 所示)μ g/mlPNS加药组中，在处理48h后显示了明显的保护ISVs血管效果，而且对SIVs区域也显示有保护效果，并呈浓度依赖性;相对而言，25 (如图2.F-F’-f所示)，50 (如图2.6-6’1所示)，100(如图2.H-H’ -h所示)μ g/ml的Sanqi F比前者有着更为明显的保护ISVs和SIVs效果，而且在较高的两个浓度下与PNS均有显著性差异；另外，加药处理48h与24h的血管数目有着明显的增多趋势，说明所述的两种皂苷不仅具备对VRI诱导的血管损伤在前期有保护效果，在后期血管发育过程中也具有促血管新生起到恢复的效果。
[0031]实施例2三七花总皂苷对人脐静脉内皮细胞增殖的作用实验
[0032]人脐静脉内皮细胞培养:HUVECs用含10%灭活新生牛血清，1%青霉素-链霉素，100 μ g/ml肝素，30 μ g/mlECGS的F-12K培养基培养，3-8代对数生长期细胞用于实验，实验用培养瓶，24孔板和96孔板预先使用0.1%明胶涂层；
[0033]人脐静脉内皮细胞增殖实验:将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)按I X 104细胞/每孔的密度种到96孔板中，培养24小时后，用低血清培养液(0.5%FBS)替换原培养液(10%FBS)，继续培养24小时以使细胞处于一种静止状态，然后，用含有25，50，100 μ g/ml三七花总皂苷及三七(根)总皂苷培养液替换低血清培养液(含0.1%DMS0培养液作为空白对照，20ng/ml VEGF低血清培养液作为阳性对照)，48小时后，用XTT来检测三七花总皂苷和三七(根)总皂苷在HUVECs上的增殖作用；结果显示，PNS和Sanqi F在100 μ g/ml浓度下的增殖率分别为36%和33%，并且在三个浓度下表现出浓度依赖性关系，但两者在各个相同浓度下均无统计学差异，VEGF阳性对照组增殖率为71% (如图3所示)，结果表明PNS和Sanqi F均有促进HUVECs增殖的效果,并且无显著性差异。
【权利要求】
1.三七花总皂苷在制备促进血管新生的药物中的用途。
2.三七花总皂苷在制备治疗血管新生不足相关疾病药物中的用途。
3.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的血管新生不足相关疾病是冠心病。
4.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的血管新生不足相关疾病是心肌缺血心脏疾病。
5.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的血管新生不足相关疾病是侧支循环代偿建立不足疾患。
6.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的血管新生不足相关疾病是创伤和骨折愈合缓慢症或闭塞性脉管炎。
7.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的血管新生不足相关疾病是闭塞性脉管炎。
8.按权利要求1-7任一所述的用途，其特征在于，所述的三七花总皂苷提取自三七花蕾。
【文档编号】A61P9/10GK103893230SQ201210581871
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月27日 优先权日:2012年12月27日
【发明者】王佑华, 李铭源, 周端, 许贝文, 魏莉 申请人:上海中医药大学附属龙华医院