专利名称：一种同时测定植物油中植物甾醇和角鲨烯的方法
技术领域：
本发明涉及一种同时測定植物油中植物留醇和角鲨烯的方法。
背景技术：
植物留醇是一种广泛存在于植物中的天然活性物质，天然植物留醇种类繁多，主要有谷留醇、豆留醇、菜油留醇等。植物留醇广泛存在于各种植物油、坚果和植物种子中，也存在于其他植物性食物如蔬菜、水果中，不同植物种类留醇含量不同，以小麦胚芽油、 玉米胚芽油、米糠油、芝麻油和红花油中含量较高，日常摄入量中，来自谷类、蔬菜、水果的植物留醇可占到总摄入量20%以上。人体不能自由合成植物留醇，只能从食物中摄取。植物甾醇具有很高的安全性，可作为新型食品添加剤。植物留醇的化学结构与胆留醇类似，具有降低血液中胆固醇和低密度脂蛋白的作用，还具有抗癌、抗炎、抗氧化等功能，已广泛用于食品、制药、保健品。角鲨烯(C3tlH5tl，ニ十二碳六烯酸)也是生物体内ー种活性物质，广泛存在于植物油中，在血液中具有输送活性氧、活化机体細胞、抗氧化、消炎杀菌的等功能。由于各种植物甾醇组分结构十分相似，如谷甾醇和豆甾醇、菜油甾醇的差別仅在于支链上相差一个双键和ー个CH2基团，所以一般的化学方法很难对多种组分进行分离測定，尤其是豆留醇和菜油留醇，在一般的文献报道中均难以用高效液相法将二者完全分离。传统的測定方法主要有红外光谱法定性鉴定、毛地黄皂甙法、比色法、薄层色谱法、高速逆流色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法等。由于高效液相色谱法不需要衍生化，并且測定条件较温和，样品性质不会被破坏，因此广泛用于植物留醇的測定，但是由于植物甾醇各组分结构及其相似，且不皂化物中同时存在Ve和角鲨烯等组分，选择适宜的色谱分离条件使各植物留醇各组分达到完全分离是高效液相色谱法测定留醇的难点和关键。角鲨烯含量測定的方法有薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法及红外光谱分析法。建立ー种同时测定植物油中植物留醇和角鲨烯的方法，既保证了植物留醇各组分的有效分离，排除角鲨烯等对测定的干扰，还可将其ー并检测出且不破坏组分的性质，因此高效液相色谱法是ー个优选的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时測定植物油中豆甾醇、菜油甾醇和β -谷甾醇3种植物留醇组分和一种角鲨烯组分的高效液相色谱方法。本发明所提供的方法包括下述步骤1)将植物油进行皂化处理，并用有机溶剂提取皂化液中的不皂化物；2)将所述不皂化物溶于有机溶剂中，用高效液相色谱法进行測定，实现对植物油中豆甾醇、菜油甾醇、谷甾醇和角鲨烯的同时测定；其中，所述高效液相色谱法中的色谱条件如下色谱柱C18柱；流动相乙腈与水体积比为90 10 100 0 ；紫外检测波长205nm 210nm;进样量IOyL 20yL;流速1. 0 1. 5mL/min ；柱温25°C 30°C。
更具体的色谱条件为色谱柱Waters Sunfire C18，规格4. 6 X 250mm，填料 5ym;流动相乙腈与水体积比为90 10的混合溶剤；紫外检测波长210nm ；进样量 20 μ L ；流速:1. 5mL/min ；柱温:30°C。其中，步骤1)中对植物油进行皂化处理的具体方法如下将植物油与碱溶液、醇及抗坏血酸溶液混合，在煮沸回流条件下反应45-60min，得到皂化液。所述碱溶液可为浓度lmol/L的氢氧化钾溶液，所述抗坏血酸溶液的浓度可为 100g/L ；所述植物油、碱溶液、醇、抗坏血酸溶液的配比为1 IOg IOmL 30mL 5mL。在步骤1)中对皂化液进行提取吋，所用的有机溶剂具体为乙醚或正己烷。步骤幻中溶解不皂化物所用的有机溶剂具体可为乙醇。本发明中所述植物油具体可为花生油。采用本发明的方法可同时实现植物油中菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇和角鲨烯的有效分离。分离耗时约40min，色谱图中出峰順序分别为菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、角鲨烯。
图1为植物甾醇和角鲨烯高效液相法測定的样品的色谱图，其中，A指示为菜油甾醇峰，B指示为豆甾醇、C指示为谷甾醇、D指示为角鲨烯。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实施例中所用的高效液相色谱仪为美国Waters公司生产，配M87紫外检测器和Breeze色谱工作站、色谱柱为Waters Sunfire C185 μ m(4. 6 X 250mm)，离心机为美国 sigma公司;3K15高速冷冻离心机；UV2550紫外分光光度计为日本岛津公司；RE-52AA旋转蒸发器为上海亚荣生化仪器厂；FW100高速万能粉碎机为天津泰斯特仪器有限公司。实施例1、同时测定花生油中β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和角鲨烯的高效液相色谱方法一、样品制备1、花生油的萃取花生取自2010年山东地区种植的花生，经剥壳、粉碎，然后采用料液比1 6(g/ mL)的正己烷进行震荡(速度为155r/min)浸提他；浸提完成后采用高速离心法将有机相与沉淀进行分离，转速4000r/min;将收集的有机相经“上海亚荣生化仪器厂”生产的 RE-52AA旋转蒸发器旋转蒸发(温度35°C-40°C)回收正己烷，得到呈淡黄色的澄清透亮的花生原油。2、皂化称取约5g试样，置于250mL烧瓶中，加入30mL无水乙醇，IOmL浓度为lmol/L的氢氧化钾溶液、5mL质量浓度为10%的抗坏血酸溶液，充分混勻后煮沸回流60min，提取其中的不皂化物，停止加热，加入IOOmL水并旋转摇动。
3、不皂化物的提取冷却后转移皂化液到500mL分液漏斗中，用IOOmL乙醚分几次洗涤烧瓶，并将洗液倒入分液漏斗，将下层皂化液完全放入第二只分液漏斗中。如果形成乳化液，则加入少量乙醇或浓氢氧化钾或氯化钠溶液进行破乳。采用相同方法，毎次用IOOmL乙醚，再提取皂化液两次，收集三次乙醚提取液放入装有40mL水的分液漏斗中。4、乙醚提取液的洗涤轻轻转动装有提取液和40mL水的分液漏斗(注剧烈摇动可能形成乳浊液)，待完全分层后弃去下面水层，用40mL水再洗涤乙醚溶液两次，每次剧烈震摇，静置分层后弃去下面水层。用40mL浓度为0. 5mol/L的氢氧化钾水溶液、40mL水相继洗涤乙醚溶液后，然后用40mL水至少洗涤两次以上。继续用水洗涤，用pH试纸检验直至水层不显碱性。5、浓缩将乙醚提取液经无水硫酸钠(约5g)滤入与旋转蒸发器配套的250mL球形蒸发瓶中，用30mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，并入蒸发瓶内，将其接至旋转蒸发器上， 于55°C水中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2mL乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚。吹干后立即加入2mL乙醇，充分混合，溶解提取物，将其过0. 45 μ m滤膜，滤液密封保存用于HPLC測定。ニ、高效液相色谱分析1、高效液相色谱条件植物甾醇测定色谱条件色谱柱Waters Sunfire C18 (4. 6 X 250mm，5 μ m)；流动相乙腈水=90 10 (ν/ν)；紫外检测波长210nm;进样量20yL;流速1.5mL/min;柱温:30°Co2、标准曲线的绘制植物留醇标准曲线的绘制准确称取一定量谷留醇、菜油留醇和豆留醇的标准品，用无水乙醇溶解、混勻，使其质量浓度分别为菜油甾醇0. 20,0. 60,0. 80,1. 0,1. 2mg/ mL,豆甾醇 0. 05,0. 15,0. 25,0. 40,0. 50mg/mL, β _ 谷甾醇 0. 50、1. 0、1· 5、2· 0、3· Omg/mL, 在1所述的色谱条件下分別进样，以峰面积X为横坐标，浓度C(mg/mL)为纵坐标作图， Microsoft的Excel软件进行回归拟合，得到β _谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇线性回归方程， 结果见表1。角鲨烯标准曲线的绘制准确称取一定量角鲨烯的标准品，用无水乙醇溶解、混勻，使其质量浓度分别为0. 10,0. 20,0. 30,0. 40,0. 50mg/mL，在1所述的色谱条件下分别进样，以峰面积X为横坐标，浓度C(mg/mL)为纵坐标作图，Microsoft的Excel软件进行回归拟合，得到角鲨烯线性回归方程，结果见表1。表1植物甾醇和角鲨烯的线性回归方程
标准品线性回归方程线性范围R7
菜油甾醇 C=4xl0-\-0.412 0.20 1.2mg/mL 0.996
豆甾醇 C=3 χ IO-7X-0.138 0.05 0.50mg/mL 0.991 β-谷甾醇 C=3 χ IO-7X-0.119 0.50 3.0mg/mL 0.993 角鲨烯 _C=10"8x+0.0033 _ 0.10 0.50mg/mL _ 0.999
上述各标准曲线的R2均大于0. 99，表明在上述线性范围内，各物质回归方程线性关系良好。3、精密度实验取步骤一中试样制备所制得的供试品溶液，按照步骤ニ项下1所述的高效液相色谱分析条件，记录色谱图及各物质峰面积，共測定5次，进行精密度实验，结果见表2。由表 2可知各组分測定的RSD均小于2. 0%，表明本測定方法精密度良好。表2精密度实验结果
权利要求
1.一种同时測定植物油中豆留醇、菜油留醇、β-谷留醇和角鲨烯的方法，包括下述步骤1)将植物油进行皂化处理，并用有机溶剂提取皂化液中的不皂化物；2)将所述不皂化物溶于有机溶剂中，用高效液相色谱法进行測定，实现对植物油中豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和角鲨烯的同时測定；其中，所述高效液相色谱法中的色谱条件如下色谱柱C18柱；流动相乙腈与水体积比为90 10 100 0的溶剤；紫外检测波长205nm 210nm ；进样量10μ L 20μ L ； 流速1. 0 1. 5mL/min ；柱温25°C 30°C。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述高效液相色谱法中的色谱条件如下 色谱柱Waters Sunfire C18，规格4. 6 X 250mm，填料5 μ m ；流动相乙腈与水体积比为 90 10的混合溶剂；紫外检测波长2IOnm ；进样量20 μ L ；流速1. 5mL/min ；柱温:30°C。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤幻中所述有机溶剂为乙醇。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在干步骤1)中对植物油进行皂化处理的具体方法如下将植物油与碱溶液、乙醇及抗坏血酸溶液混合，在煮沸回流条件下反应45 60min，得到皂化液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述碱溶液为浓度为lmol/L的氢氧化钾溶液，所述抗坏血酸溶液的浓度为100g/L ；所述植物油、碱溶液、乙醇、抗坏血酸溶液的配比为 1 IOg IOmL 30mL 5mL。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在干步骤1)中所述有机溶剂为乙醚。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于所述植物油为花生油。
全文摘要
本发明公开了一种同时测定植物油中豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和角鲨烯的方法。该方法包括下述步骤1)将植物油进行皂化处理，并用有机溶剂提取皂化液中的不皂化物；2)将所述不皂化物溶于有机溶剂中，用高效液相色谱法进行测定；其中，所述高效液相色谱法中的色谱条件如下色谱柱C18柱；流动相乙腈与水体积比为90∶10～100∶0的溶剂；紫外检测波长205nm～210nm；进样量10～20μL；流速1.0～1.5mL/min；柱温25～30℃。采用本发明的方法可同时实现植物油中菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇和角鲨烯的有效分离。分离耗时约40min，色谱图中出峰顺序分别为菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、角鲨烯。
文档编号G01N30/06GK102565217SQ20111042490
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者刘丽, 刘红芝, 张建书, 王强 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所