邳半夏鲨烯合酶基因及其编码的蛋白质与应用的制作方法
【专利摘要】一种邳半夏鲨烯合酶基因及其编码的蛋白质与应用，属于基因工程领域。所分离出的 DNA 分子包括：编码具有邳半夏 PtSQS 蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与 SEQIDNO.3 中从核苷酸第 127-1359 位的核苷酸序列有至少 70% 的同源性；或者所述的核苷酸序列能在 40 － 55 ℃条件下与 SEQIDNO.3 中从核苷酸第 127-1359 位的核苷酸序列杂交。本发明是一种鲨烯合酶，有助于提高邳半夏中具有抗癌活性的三萜类化合物的含量，对于保护人民的健康生长有所帮助。
【专利说明】邳半夏鲨烯合酶基因及其编码的蛋白质与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学、基因工程【技术领域】。具体地，本发明涉及一种在邳半夏中 表达的PtSQS蛋白（郑半夏藍烯合酶蛋白，Tkmaia (Thunb.) Breit. squalene synthetase, PtSQS)及其核酸序列，是郑半夏S烯合酶基因及其编码的蛋白质和应用。
【背景技术】
[0002] 郑半夏(/YfleBia Tkmaia (Thunb. ) Breit.)别名三叶半夏，三步跳，老湾眼 等.为天南星科，多年生草本植物，野生于山坡、溪边阴湿的草丛中或林下，叶子有长柄，初 夏开黄绿色花。地下有白色小块茎，可入药。主治痰饮呕吐、湿痰咳嗽、消痞散结、眩晕、气 逆等症。邳半夏中成分复杂，含有挥发性物质，三萜类化合物、及生物碱等多种活性物质，其 中三萜类化合物抗肿瘤等活性已引起人们广泛关注。已有文献报道邳半夏中含有多种三萜 类组分，并且这些组分都具有抗肿瘤活性。近代科学研究发现，药用植物中萜类，生物碱等 次生代谢产物大部分是天然活性物质，是解决目前世界面临的西药毒副作用大，癌症、艾滋 病等疑难疾病无法医治等难题的一条新途径。
[0003] 然而作为次生代谢产物，其绝对含量又是很低的，这也成为次生代谢产物研究开 发的最大障碍。近年来植物基因工程技术的飞速发展和广泛应用，为利用现代生物技术提 高次生代谢产物或其前体的含量开辟了一条崭新的途径。利用现代生物技术将次生代谢产 物生物合成途径中的关键酶基因（或转录因子）导入相应的宿主中，获得转基因的细胞系、 组织或再生植株，并进行大规模的培养，是实现从根本上提高次生代谢产物含量的最佳途 径。
[0004] S烯合酶（Squalene Synthase, SQS)催化两个分子的法尼基焦磷酸（FPP)生成 鲨烯，第一步反应是两分子的FPP通过异戊烯基转移反应缩合成前鲨烯焦磷酸（PSQPP)，并 释放出一分子无机二磷酸，在该过程中，其中一个FPP的C(I)-C(2)的双键作为另一个FPP 的异戊烯基受体；第二步反应是PSQPP在NADPH作为供氢体的情况下，通过正碳离子重排转 化为鲨烯，该反应发生在细胞中的光面内质网上，鲨烯合酶在三萜，留醇的生物合成中起着 关键的作用。由于鲨烯合酶催化的底物FPP处于异类戊二烯代谢途径中的分支点，因此，调 控鲨烯合酶的活性能够直接影响留醇、三萜类以及FPP为前提物的其他类异戊二烯化合物 的生物合成。因此，利用现代生物技术将SQS基因导入邳半夏中，获得转基因的植物，并且 进行大规模的栽培，是实现从根本上提高邳半夏三萜类活性化合物含量的最佳途径。
[0005] 在对现有文献的分析中，"Plant and cell physiology (植物和细胞生理),2004, 45 (8) :976-984"和"Planta.(植物科学），2011，233:343-355"等报道了从人参和阿尔泰 柴胡中克隆了鲨烯合酶基因，NCBI网站上公布了银杏，红豆杉等的鲨烯合酶基因的序列。但 至今尚未有邳半夏SQS蛋白序列及其核酸序列的报道。
[0006] 在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的邳半夏 PtSQS蛋白序列及其核酸序列。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种邳半夏PtSQS蛋白编码序 列。使其包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，被所说的表 达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物 种子及植物组织，所获得的转基因植物将具有显著提高的次生代谢产物含量。
[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的，本发明所分离出的DNA分子包括：编码具有 邳半夏PtSQS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO. 3中从核 苷酸第127-1359位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40 - 55°C条件下与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第127-1359位的核苷酸序列杂交。
[0009] 较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列的多肽。更佳地， 所述的序列具有SEQ ID NO. 3中从核苷酸第127-1359位的核苷酸序列。
[0010] 本发明分离出的邳半夏PtSQS蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID NO. 3氨基酸序列 的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ IDN0. 3序列的多肽。
[0011] 本发明所提供的载体DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。它包含所述的DNA 分子中8-100个连续核苷酸。
[0012] 本发明用上述载体。在实例中该宿主细胞是烟草。
[0013] 在本发明中，"分离的"、"纯化的" DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其 两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且 已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
[0014] 在本发明中，术语"邳半夏PtSQS蛋白（或多肽）编码序列"指编码具有邳半夏 PtSQS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 3中第127-1359位核苷酸序列及其简 并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO. 3序列的编码框第127-1359位核苷酸中，有一 个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简 并性，所以与SEQ ID NO. 3中第127-1359位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也 能编码出SEQ ID NO. 3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严 紧条件下与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第127-1359位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该 术语还包括与SEQ ID NO. 3中从核苷酸第127-1359位的核苷酸序列的同源性至少70%，较 佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。
[0015] 该术语还包括能编码具有与天然的邳半夏PtSQS蛋白相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：若干个（通常为 1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个）核苷酸的缺失、插入和/或取代， 以及在5'和/或3'端添加数个（通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个 以内，最佳地为5个以内）核苷酸。
[0016] 在本发明中，术语"邳半夏PtSQS蛋白或多肽"指具有邳半夏PtSQS蛋白活性的 SEQ ID NO. 3序列的多肽。该术语还包括具有与天然邳半夏PtSQS蛋白相同功能的SEQ ID NO. 4序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：若干个（通常为1-50个，较佳 地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末 端和/或N末端添加一个或数个（通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以 内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋 白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白 质的功能。该术语还包括邳半夏PtSQS蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0017] 本发明的邳半夏PtSQS蛋白多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位 变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与邳半夏PtSQS蛋白DNA杂交 的DNA所编码的蛋白、以及利用邳半夏PtSQS蛋白多肽的血清获得的多肽或蛋白。
[0018] 在本发明中，"邳半夏PtSQS蛋白保守性变异多肽"指与SEQ ID NO. 3的氨基酸序 列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所 替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
[0019] 表 1
【权利要求】
1. 一种邳半夏鲨烯合酶基因，其特征在于：所述基因由SEQ ID NO. 1中第127-1359位 的核苷酸序列所构成。
2. -种邳半夏鲨烯合酶，其特征在于：所述酶由SEQ ID NO. 2中第1-410位的氨基酸 序列所构成。
3. -种含有权利要求1所述的邳半夏鲨烯合酶基因的完整编码阅读框序列的质粒。
4. 一种含有权利要求1所述的邳半夏鲨烯合酶基因的完整编码阅读框序列的植物表 达载体。
5. -种用权利要求1所述的邳半夏鲨烯合酶基因转化获得的转基因植物。
【文档编号】A01H5/00GK104388446SQ201410566830
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月23日 优先权日:2014年10月23日
【发明者】曹小迎, 蒋继宏, 张文娟, 张盼盼, 陈集双 申请人:江苏师范大学