逆境下转基因大豆中致敏蛋白基因表达的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种逆境胁迫下转基因大豆中致敏蛋白基因表达的检测方法，根据大豆的每种致敏蛋白基因设计荧光定量PCR引物；分别对每种转基因大豆致敏蛋白基因进行荧光定量PCR检测；分别提取逆境胁迫与正常栽培条件下转基因植株以及野生型大豆的总RNA为模板，反转录成cDNA模板。以大豆CYP2基因作为内参，根据各致敏蛋白基因的退火温度设置PCR检测程序，在荧光定量PCR仪上分别对每种致敏蛋白基因进行荧光定量PCR检测；进行逆境胁迫下转基因大豆中致敏蛋白基因表达量的分析。利用本发明能够分析逆境胁迫下转基因大豆中是否具有非预期的致敏性，有助于转基因大豆的生物安全性监测和推广应用，具有重要的经济价值和社会效益。
【专利说明】逆境下转基因大豆中致敏蛋白基因表达的检测方法
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种逆境胁迫下转基因大豆中致敏蛋白基因表达的检测方法；属于分子生物学和生物【技术领域】。
(二)【背景技术】
[0002]新一代转基因植物中常导入多个外源基因，外源基因之间、外源基因与野生型(受体)植物的内源基因之间可能存在互作。关于这一互作是否改变植物内源致敏蛋白基因的表达量、导致新一代转基因植物中出现非预期的致敏性，已成为人们日益关切的问题。另外，近年来农业生产上经常遇到高温、低温、干旱等逆境胁迫；而且，研究表明逆境胁迫影响植物基因的表达。因此，有必要建立逆境胁迫下转基因植物中致敏蛋白基因表达的分析方法。荧光定量PCR是在1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新定量试验技术，它具有特异性强、自动化程度高等特点，能够有效解决PCR污染问题，已在病毒和食品安全检测等方面得到广泛应用。但是，目前国内外尚未将荧光定量PCR技术用于分析逆境胁迫下转基因植物中致敏蛋白基因的表达量。本发明将荧光定量PCR技术用于研究逆境胁迫下转基因大豆中致敏蛋白基因的表达量，建立了分析转基因大豆中致敏蛋白基因表达量的技术体系，有助于转基因大豆的生物安全性监测和推广应用，具有重要的经济价值和社会效益。
(三)
【发明内容】
[0003]本发明涉及一种逆境胁迫下转基因大豆中致敏蛋白基因表达的检测方法，是荧光定量PCR技术在致敏蛋白基因表达分析中的应用，具体提供了一种分析逆境胁迫下转基因大豆中致敏蛋白基因表达量的方法。
[0004]一种逆境胁迫下转基因大豆中致敏蛋白基因表达的检测方法，包括以下步骤:
[0005]1、根据大豆的每种致敏蛋白基因设计荧光定量PCR引物(表1)
[0006]2、分别对每种转基因大豆致敏蛋白基因进行荧光定量PCR检测
[0007]分别提取逆境胁迫与正常栽培条件下转基因植株以及野生型(受体)大豆的总RNA为模板，反转录成cDNA模板。以大豆CYP2基因作为内参，根据各致敏蛋白基因的退火温度(表2)设置PCR检测程序，在荧光定量PCR仪上分别对每种致敏蛋白基因进行荧光定量PCR检测。
[0008]3、逆境胁迫下转基因大豆中致敏蛋白基因表达量的分析
[0009]比较各种致敏蛋白基因在逆境胁迫与正常栽培条件下转基因植株以及野生型(受体)大豆之间的表达量差异，分析判断逆境胁迫下的转基因植株中是否具有非预期的致敏性。
[0010]与正常栽培条件下的植株相比，若各致敏蛋白基因中的一个或多个基因在逆境胁迫的野生型(受体)大豆中下调表达，但在逆境胁迫的转基因植株中显著地上调表达，则初步判定该转基因植株为具有致敏性的可疑植株；与正常栽培条件下的植株相比，若一个或多个致敏蛋白基因在逆境胁迫的野生型(受体)大豆中上调表达，同时，与逆境胁迫下的野生型(受体)大豆相比，这一个或多个致敏蛋白基因的表达量在逆境胁迫的转基因植株中显著地增加，也初步判定该转基因植株为具有致敏性的可疑植株。
[0011]根据上述技术体系，提取转基因植株以及野生型(受体)大豆的总RNA后，能够分析逆境胁迫下转基因大豆中是否具有非预期的致敏性，有助于转基因大豆的生物安全性监测和推广应用，具有重要的经济价值和社会效益。
[0012](四)具体发明实施方式
[0013]实施例1:大豆致敏蛋白基因荧光定量PCR引物的设计与合成
[0014]根据GenBank数据库中大豆各主要致敏蛋白基因的mRNA序列，设计其荧光定量PCR引物(表1)，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0015]实施例2:转基因大豆致敏蛋白基因的荧光定量PCR检测
[0016]UcDNA模板的反转录
[0017]在大豆结荚期至鼓粒成熟期，以正常栽培条件(25°C，土壤湿度为田间持水量的75%)为对照组；对转⑶S基因大豆和野生型(受体)植株(黑农35品种)分别进行高温(40°C )、低温(10°C )和干旱(土壤湿度为田间持水量的30%)等逆境胁迫为处理组，每隔3天取各组叶片和种子作为试材并进行标注；各试材经液氮冷冻后在_60°C冰箱保存。按照TRIzol (美国Invitrogen公司产品)试剂说明书分别提取各组叶片和种子的总RNA,利用紫外可见分光光度计在260nm波长下测定其RNA的吸光度(OD26tl),按照以下通用公式计算不同试材的总RNA浓度，以备反转录cDNA用:总RNA浓度(y g/ml) =OD260 XRNA溶液的稀释倍数 X 40 u g/ml o
[0018]按照Super RT cDNA第一链合成试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司产品)说明书，将不同试材的总RNA分别反转录成cDNA模板。反转录时，20 Ul反应体系包含
12.5mM 的 dNTP Mix,2 u I Primer Mix,4u 15XRT Buffer,200U SuperRT 以及 5 y g 总RNA0反应程序为42°C 50min,85°C 5min。反转录产物用灭菌双蒸水稀释10倍后置于_20°C冰箱保存备用。
[0019]2、转基因大豆致敏蛋白基因的荧光定量PCR检测
[0020]在美国Bio-Rad公司的CFX96? real-time system进行荧光定量PCR检测。按照ultra SYBR Mixture (北京康为世纪生物科技有限公司产品)说明书，每种致敏蛋白基因的荧光定量PCR反应体系包含IOii 12 X ultra SYBR Mixture (with Rox)、0.4 y I该致敏蛋白基因的正引物(表l)、0.4iU该致敏蛋白基因的反引物(表l)、2iil cDNA模板、7.2iURNase-Free Water。反应程序如下:95°C预变性IOmin,95°C变性15s,各致敏蛋白基因的特异退火温度(表2)下退 火/延伸lmin，40个循环。
[0021]以大豆CYP2基因作为内参，利用美国Bio-Rad公司的CFX软件对荧光定量PCR结果进行分析，获得不同样品中致敏蛋白基因相对于内参基因的表达量。
[0022]实施例3:逆境胁迫下转基因大豆致敏蛋白基因表达量的分析判定
[0023]比较各致敏蛋白基因在逆境胁迫与正常栽培条件下转基因植株以及野生型(受体)大豆之间的表达量差异，分析逆境胁迫下的转基因植株中是否具有非预期的致敏性。与正常栽培条件下的植株相比，只要表1中所列致敏蛋白基因中的一个或多个致敏蛋白基因在逆境胁迫的野生型(受体)大豆中下调表达，但在逆境胁迫的转基因植株中显著地上调表达，则初步判定该转基因植株为具有致敏嫌疑的可疑植株。与正常栽培条件下的植株相比，只要表1中所列致敏蛋白基因中的一个或多个致敏蛋白基因在逆境胁迫的野生型(受体)大豆中上调表达；同时，与逆境胁迫下的野生型(受体)大豆相比，这一个或多个致敏蛋白基因的表达量在逆境胁迫的转基因植株中显著地增加，也初步判定该转基因植株为具有致敏嫌疑的可疑植株。
[0024]判定为可疑植株后可利用常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳或western杂交等实验，从蛋白质水平对转基因植株中致敏蛋白质的表达量进行验证。
[0025]表1大豆中主要致敏蛋白基因的荧光定量PCR引物[0026]
【权利要求】
1.一种逆境胁迫下转基因大豆致敏蛋白基因表达的检测方法，其特征在于包括以下步骤: 1)根据大豆的每种致敏蛋白基因设计荧光定量PCR引物； 2)分别对每种转基因大豆致敏蛋白基因进行荧光定量PCR检测 分别提取逆境胁迫与正常栽培条件下转基因植株以及野生型大豆的总RNA为模板，反转录成cDNA模板；以大豆CYP2基因作为内参，根据各致敏蛋白基因的退火温度设置PCR检测程序，在荧光定量PCR仪上分别对每种致敏蛋白基因进行荧光定量PCR检测； 3)逆境胁迫下转基因大豆中致敏蛋白基因表达量的分析 比较各种致敏蛋白基因在逆境胁迫与正常栽培条件下转基因植株以及野生型大豆之间的表达量差异，分析判断逆境胁迫下的转基因植株中是否具有非预期的致敏性: 与正常栽培条件下的植株相比，若各致敏蛋白基因中的一个或多个基因在逆境胁迫的野生型大豆中下调表达，但在逆境胁迫的转基因植株中显著地上调表达，则初步判定该转基因植株为具有致敏性的可疑植株；与正常栽培条件下的植株相比，若一个或多个致敏蛋白基因在逆境胁迫的野生型大豆中上调表达，同时，与逆境胁迫下的野生型大豆相比，这一个或多个致敏蛋白基因的表达量在逆境胁迫的转基因植株中显著地增加，也初步判定该转基因植株为具有致敏性的可疑植株。
2.如权利要求1所述的逆境胁迫下转基因大豆致敏蛋白基因表达的检测方法，其特征在于所述的致敏蛋白基因、内参基因及其对应的PCR引物及退火温度为:
【文档编号】C12Q1/68GK103642933SQ201310724671
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】白吉刚, 弯燕燕, 周子晴, 王秀娟 申请人:山东农业大学