金柑FcWRKY70基因及其在提高植物耐旱中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了金柑FcWRKY70基因及其在提高植物耐旱中的应用， 申请人:从金柑（Fortunella.crassifolia）中分离、克隆得到一个多重逆境诱导表达的WRKY转录因子FcWRKY70，其序列为SEQIDNO.1所示，编码的蛋白质为SEQIDNO.2所示。 申请人:将该基因分别导入到烟草、柠檬及金柑中，获得的超表达转基因植株对干旱胁迫的耐受性明显提高，干涉转基因植株对干旱胁迫的耐受性明显被削弱。本发明为植物抗非生物逆境分子设计育种提供了新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本，促进农业产业高效发展。
【专利说明】金柑FcWRKY70基因及其在提高植物耐旱中的应用
【技术领域】
[0001]本专利属于植物基因工程领域。具体涉及从金柑(Fortunella.crassifolia)中分离、克隆得到一个多重逆境诱导表达的WRKY转录因子FcWRKY70，然后将该基因分别导入到烟草、柠檬及金柑中，获得的超表达转基因植株对干旱胁迫的耐受性明显提高，干涉转基因植株对干旱胁迫的耐受性明显被削弱。
【背景技术】
[0002]植物在生长过程中，经常会受到各种不同不良环境的胁迫影响，像干旱，盐，冷害，高温，营养贫乏和病虫害，严重影响其生长发育(Gong and Liu2013)。值得注意的是,每年全球因为干旱造成农作物减产约为20% (Wang et al2003)。
[0003]为适应各种环境胁迫，植物在生理及生化过程中形成了一系列的改变(Krasenskyand Jonak, 2012)。例如，改变代谢过程以积累一系列代谢物维持细胞彭压，抵御逆境影响(Nishizawa et al., 2008;Verbruggen and Hermans2008;Livingston et al.，2009;Shi etal.,2010;Fu et al.，2011a，b)。此外，大量基因的转录水平发生改变，被逆境诱导表达抑或被抑制转录(Seki et al.，2003)。一部分逆境响应基因通过编码功能蛋白，促进植物细胞积累有益代谢物，保护细胞免受伤害(Chen and Murata2011;Wang et al.，2011 )。另一分部分基因行使转录调节的功能，修饰靶基因的表达，例如转录因子，蛋白激酶，磷酸化酶(Suet al., 2010;Mao et al., 2011;Seo et al., 2012;Cui et al., 2012)
[0004]转录因子在逆境响应基因的转录重组表达过程中起着不可或缺的作用(Singh etal.，2002)。植物基因组包含有大量的转录因子，这其中WRKY蛋白被认为是植物特有的由数量巨大的成员组成的一个大的基因家族(Eulgem et al.，2000)。生物信息学分析显示，在已公布基因组序列的一些物种中均存在非常丰富的WRKY蛋白，其中拟南芥中74个，水稻中109个,番木瓜中66个,杨树 中104个，高梁中68个(Eulgem and Somssich2007; Rosset al., 2007;Pandey and Somssich2009)。自从在甘薯中发现第一个WRKY蛋白以来,研究者们在植物中鉴定出越来越多的WRKY蛋白。
[0005]至今为止，已有大量的研究表明WRKY蛋白在不同生理生化过程中起着关键作用，像信号传导，代谢，木质化等(Ren et al., 2008;Guillaumie et al., 2010;Mao etal.，2011; Yu et al.，2013)。此外，越来越多的证据表明WRKY转录因子参与了植物对生物及非生物逆境的响应过程(Liu et al.，2013)。例如，拟南芥II族a亚族的三个成员，AtWRYK18、AtffRKY40和AtWRKY60，在结构上与功能上形成冗余、拮抗而又互不相同的复杂作用模式，应对不同的真菌及细菌病害(Xu et al., 2006; Shen et al., 2007; Pandey etal.，2010)。AtffRKY6和AtWRKY42可调节PH0SPHATE1 (PHOl)的表达，提高转基因拟南芥对低磷胁迫的耐受性(Chen et al.，2009)。2个III族WRKY转录因子，WRKY70和WRKY54，在拟南芥中协同负调控气孔开闭，调节渗透胁迫(Li et al.，2013)。水稻中也有关于一对WRKY转录因子的等位基因在白叶枯病、细菌性条斑病以及干旱、盐等逆境下作用截然相反的研究报道(Tao et al., 2009; Tao et al.，2011)。鉴于WRKY转录因子在植物逆境胁迫过程所起的重要作用，该类基因可作为有效的基因资源，通过转基因模式创造出抗性增强的转基因植物。目前为止，已有大量研究表明，过量表达类似基因能够显著增强植物的抗逆性(Fuat al., 2011b;Hao et al., 2011;Su et al.，2010)。
[0006]在之前的研究中，我们发掘到一个多重逆境响应的EST，通过RACE技术扩增得到全长，发现该基因具有一个WRKY结构域，是一个潜在的WRKY转录因子。生物信息学分析表明该基因隶属于III族WRKY转录因子，与拟南芥的WRKY70最相似，因此我们将其命名为FcWRKY70。其是一个未知的新基因，编码一个小分子多肽产物，不含任何已知的保守结构域。研究发现溃疡病菌，外源添加SA及ABA可明显诱导FcWRKY70的表达，此外干旱及盐处理也可明显诱导其表达，是抗性育种中一个非常优良的基因资源。
【发明内容】
[0007]本发 明目的是从金柑(Fortunella.crassifolia)中分离、克隆出一个受多重逆境诱导表达的WRKY转录因子，FcWRKY70，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]本发明的另一个目的在于提供了一种金柑FcWRKY70基因在提高植物抗干旱胁迫中的应用，通过农杆菌介导的遗传转化将其导入烟草、柠檬和金柑中，鉴定其在脱水及干旱胁迫下的功能，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。
[0009]为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施:
[0010]金柑野生型cDNA为模板，以下述引物进行扩增:
[0011]正向引物:5’ -CATGCCATGGATCATAATGAAAATGGAGGCCGGTC-3，；
[0012]反向引物:5’ -GGGTCACCAGTTGCAAAGGACTAGCGGTAGCAG-3，。
[0013]得到一个新金柑基因FcWRKY70，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，FcWRKY70全长1196bp，其中83-1069bp处为该基因的编码区；其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，它包含987bp的开放阅读框，编码328个氨基酸，等电点为5.89，预测的分子量为36.78kD。
[0014]利用农杆菌介导的遗传转化方法转化烟草和柠檬，获得的转基因植株经生物学功能验证，表明本发明所克隆的FcWRKY70基因具有提高耐脱水及干旱胁迫的功能。在本发明的实施例部分，我们阐述了金柑FcWRKY70的分离、功能验证和应用。
[0015]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0016]干旱、低温、盐碱化等逆境均会伴随着严重的植物脱水过程，形成生理干旱，影响植物正常生长发育及作物的地理分布。传统农业对水资源的依赖性较大，特别是高温季节，制约了农业产业的发展。依托本发明能有效改善植物的耐旱能力，使其适应干旱环境。一旦获得有效转基因材料，生产上可有效降低浇灌用水的消耗，节约资源，降低生产成本。另一方面，本发明可根据实际生产需求用于改善砧木材料或是其它，应用广泛，易于被接受认可。
[0017]通过农杆菌介导的遗传转化将该基因导到植株中，鉴定其在不同逆境条件下的功能，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源。【专利附图】
【附图说明】
图1为本发明的技术流程图。
图2为发明的FCWRKY70基因在不在胁迫处理下的表达示意图。
其中:图2中A是取叶片接种溃瘍病菌Xcc (Xanthomonas citri subsp.Citri ),相应时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明基因的相对表达量；
图2中B是金柑新梢在500 μ M水杨酸处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明基因的相对表达量；
图2中C是金柑新梢在100 μ M ABA处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明基因的相对表达量；
图2中D是取金柑新梢在室温脱水不同时间点下本发明基因的表达模式；
图2中E是金柑新梢在200mM氯化钠处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明基因的相对表达量；图2F是金柑新梢在4°C处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明基因的相对表达量。
图3为本发明的FcWRKY70基因亚细胞定位荧光示意图。
其中图3中A-B为GFP基因(对照)在明场、暗场下的成像；图3中C-E为FcWRKY70基因在明场(C ) 、暗场DAPI染色(D )、及暗场GFP (E )下的成像。
图4为本发明的FcWRKY70基因转录激活鉴定示意图。
图中所示分别是空载体(PGBKT7，图中N标识)及融合载体FcWRKY70 (图中70标识)转化的酵母菌株AH109在不同缺失培养基上的生长情况。
图5为本发明的FcWRKY70基因载体构建示意图图。
图5中A是超表达载体构建示意图；图5中B是干涉载体构建示意图。
图6为本发明的FcWRKY70基因转化柠檬及再生过程示意图。
图6中A为共培养的茎段，图6中B为筛选培养60天，图6中C为抗性芽在伸长培养基上伸长及扩繁，图6中D为抗性芽进行生根培养。烟草及金柑转化过程与之类似。
图7为本发明的FcWRKY70基因转基因材料PCR鉴定示意图。
图7中A是FcWRKY70转化烟草后得到的再生植株PCR鉴定图(上为FcWRKY70特异引物PCR扩增图，下为HPTII基因特异引物PCR扩增图)；
图7中B是FcWRKY70转化柠檬后得到的再生植株PCR鉴定图(上为FcWRKY70特异引物PCR扩增图，下为HPTII基因特异引物PCR扩增图)；
图7中C是FcWRKY70转化金柑后得到的再生植株PCR鉴定图(上为35S正向引物和FcWRKY70特异引物PCR扩增图，下为NPTII基因特异引物PCR扩增图)；
图7中D为目的基因在烟草转基因系中表达量分析，图7E为目的基因在柠檬转基因系中表达量分析，7F为目的基因在金柑转基因系中表达量分析；
图8为本发明FcWRKY70转基因烟草苗(1#，4#)与野生型抗旱性比较示意图。
图8中A是转基因烟草离体苗自然脱水60分钟前后各系材料表型比较及trypan blue染色差异比较；
图8中B为各系离体苗自然脱水60分钟过程中相对失水率比较；
图8中C为盆栽材料控水前后表型比较；
图8中D为控水后各系材料土壤相对含水量比较；图8中E为控水后取样各系材料测得的MDA值。 图9为本发明FcWRKY70转基因柠檬苗(28#，43#)与野生型抗脱水能力比较示意图。
图9中A是FcffRKY70转基因材料与野生型自然脱水6个小时过程中的相对失水率的比较；
图9中B为脱水后各系材料NBT染色差异比较；图9C为脱水后各系材料DAB染色差异比较。
图10为FcWRKY70转基因金柑苗(20#，22#)与野生型抗脱水能力比较示意图。
【具体实施方式】
[0018]以下结合具体实施对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
[0019]实施例1:
[0020]FcWRKY70基因分离克隆及表达分析
[0021]在之前的研究中，我们以芯片探针Cit.7937.1.Sl_at序列比对柑橘EST数据库HarvEST (http: //harvest, ucr.edu),得到了一条目标EST序列。为得到其全长序列信息，我们采用了 RACE技术。根据已知的片段信息，分别设计3，Race及5，Race引物，如下:
[0022]3’ Race outer primer_GS:5’ AGTGCCCACATCACCGAAAA3’
[0023]3’ Race inner primer_GS:5’ TGGGGATGTGATTTCTGGAGT3’
[0024]5’Race primer-GS:5’AAATCTTTTTCGGTGATGTGGGCA3’
[0025]首先使用RNAiso Plus试剂盒抽提金柑叶片中的总RNA (试剂盒购自TAKARA公司，操作方法按照说明书)。而后取Iug总RNA样品，加3’Race反应接头，以3’Full RACECore Set Ver.2.0Kit试剂盒，合成第一链cDNA (试剂盒购自TAKARA公司，第一链cDNA合成参见试剂盒说明手册)。所得的第一链cDNA用于巢式PCR反应扩增目的基因的3’末端序列。Outer PCR50 μ I的反应体系中各组分如下:
[0026]
【权利要求】
1.一种分离的基因，其序列为SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述基因编码的蛋白质，其序列为SEQID N0.2所示。
3.扩增权利要求1所述基因的引物:正向引物:5’ - CATGCCATGGATCATAATGAAAATGGAGGCCGGTC -3’ ；反向引物:5’ _ GGGTCACCAGTTGCAAAGGACTAGCGGTAGCAG -3'
4.权利要求1所述基因或权利要求2所述蛋白在提高芸香科植物耐旱性中的应用。
5.权利要求1所述基因或权利要求2所述蛋白在提高茄科植物耐旱性中的应用。
6.根据权利要求4所述的应用，所述的芸香科植物为金柑或柠檬。
7.根据权利要求5所述的 应用，所述的茄科植物为烟草。
【文档编号】C12N15/11GK103695439SQ201310724243
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】刘继红, 龚小庆, 张静燕 申请人:华中农业大学