干细胞在外源性神经营养因子作用下分化及鉴定的方法
【专利摘要】本发明涉及一种干细胞在外源性神经营养因子作用下分化及鉴定的方法，包括有以下步骤：胚胎大鼠脊髓神经干细胞的分离和扩增；依赖EGF和FGF的神经球细胞在不同外源性因子作用下的培养及分化；含HIF-1α、BDNF序列的重组腺相关病毒的构建；大鼠脊髓神经干细胞的体外转染及分析：表达产物的测定和生物活性分析。本发明的干细胞分化及鉴定的方法性能稳定。
【专利说明】干细胞在外源性神经营养因子作用下分化及鉴定的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种干细胞在外源性神经营养因子作用下分化及鉴定的方法，属于医学生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]脊髓损伤是造成人体截瘫的主要原因，一直是神经外科研究的重点和难点。脊髓损伤的病理生理过程包括脊髓原发性损伤、继发性损害和脊髓修复三个阶段。脊髓原发性损伤是受伤当时物理性损伤造成的神经细胞的死亡。脊髓继发性损害的机制包括血液循环障碍、生化活性物质改变及能量代谢障碍等多个方面，其核心问题是组织的缺血缺氧。脊髓损伤后功能的丧失是由于神经细胞的死亡、上行和下行轴突的中断以及缺乏有效的再生。最近的研究表明轴突再生的失败是由于损伤部位存在阻碍轴突再生的疤痕组织及抑制性分子、被切断的轴突缺乏营养支持和轴突被切断后的内在性神经细胞改变包括细胞变性及死亡。脊髓损伤治疗主要包括提供受损轴突生长允许性微环境、增强被切断轴突的神经细胞的再生作用二大方面。过去所采用的方法包括脊髓内移植胚胎组织、外周神经、原代细胞、细胞系；以及应用营养因子、促使生长相关基因过度表达等。但是，单纯应用一种方法并不能得到满意的脊髓功能恢复，而联合应用多种方法已经显示出良好的脊髓功能恢复。
[0003]近来，从胚胎、成体脑和脊髓中分离出的神经干细胞引起了我们极大的兴趣，包括胚胎干细胞、多能干细胞、祖细胞、定向祖细胞。自我更新和多种分化潜能是神经干细胞的二种基本属性。
【发明内容】
[0004]本发明 提供了一种稳定的干细胞在外源性神经营养因子作用下分化及鉴定的方法。
[0005]为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案:干细胞在外源性神经营养因子作用下分化及鉴定的方法，包括有以下步骤:
(1)胚胎大鼠脊髓神经干细胞的分离和扩增
严格无菌条件下，在DMEM细胞培养基中取出胚胎大鼠脊髓，用HBSS冲洗，剪碎，移入含DMEM/F12、EGF、FGF的全生长细胞培养基，用吸管吹打制成单细胞悬液，移入培养瓶；原代细胞克隆形成后再次机械分离制成单细胞悬液，每7-10天传代一次，方法同前；低温保存时，全生长细胞培养基中加入10%DMS0 ;在传代同时并进行克隆形成实验，用免疫细胞化学方法检测NestiruECAM确定细胞类型；
(2)依赖EGF和FGF的神经球细胞在不同外源性因子作用下的培养及分化
依赖EGF和FGF的神经球细胞转移到12孔细胞培养板，在EGF或FGF和以下一种或数种因子联合作用下培养4-8天:H)GF、NT-3, BDNF, NGF, EGF、FCS, FGF、顺式视黄酸；免疫细胞化学方法检测Nestin、ECAM、NeuN确定细胞类型；
(3)含HIF-1α、BDNF序列的重组腺相关病毒的构建1)鼠HIF-1α的克隆:鼠肝癌细胞系IfepalclcTjaffi总RNA? HIF-1 a cDNA (核心序列约2.5Kb) 重组质粒一转化细菌一筛选菌落，
2)质粒pGEM-3zf(+)-GDNF由中科院分子免疫中心提供，转化细菌一筛选菌落，
3)目的基因的阳离子脂质体的包装和测定，
4)表达载体的鉴定:酶切、琼脂糖凝胶电泳及聚丙烯酰胺电泳分析HIF-1α、GDNF基因并验证其表达的正确性；
(4)大鼠脊髓神经干细胞的体外转染及分析:含目的基因的阳离子脂质体与培养的神经干细胞共同孵育I小时，然后置于含G418的细胞培养板培养24小时，收集新霉素抗性克隆；台盘蓝染色，至移植时，在HBSS中分离成单细胞悬液，重新放于全生长细胞培养基，确定细胞活性及密度为IO5细胞/μ 1，移植后，剩余的细胞行组织化学法及免疫细胞化学法检测类型等，并检测β -gal与⑶NF、HIF-1 α表达的相关性；
(5)表达产物的测定和生 物活性分析:采用Westernblot法和Slot blot法验证⑶NF、HIF-1 α的表达，应用Ε8鸡胚DRG检测⑶NF的生物活性；采用Western blot法、免疫组织化学法从蛋白质水平测定HIF-Ια的生物活性。
[0006]本专利设计了通过脊髓神经干细胞的分离、培养、定向分化，并经HIF-1 α、⑶NF基因修饰后可移植入脊髓损伤模型，神经干细胞被移植后，大部分因局部微环境中信号因子的调节而分化成相应的细胞并迁徙、整合入宿主组织。从脑和脊髓中分离与培养的神经干细胞经特异性因子处理后仍可以长期增殖并保持其分化潜能，即分化成成熟的神经元和胶质细胞的能力，产生适合需要的神经元或胶质细胞，代替缺失的神经元、挽救宿主濒死的神经元、重建神经环路、提供宿主再生的轴突及去神经支配神经元之间的中继站。本发明的干细胞分化及鉴定的方法性能稳定。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]附图1是本发明体外实验的步骤图。
[0008]附图2是本发明动物实验的步骤图。
【具体实施方式】
[0009]本发明涉及干细胞在外源性神经营养因子作用下分化及鉴定的方法，具体名词解释如下:
DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。
[0010]HBSS:Hank’s Balanced Salt Solution---Hank’s 平衡盐溶液
Hank 平衡盐溶液(HBSS)的配方为:8 g/L NaCl, 0.4 g/L KCl, I g/L 葡萄糖，60mg/L KH2P04, 47.5 mg/L Na2HP04, NaHC03, 0.35g/L，调 pH 至 7.2.一般用于配制细胞培养过程中的培养基或者清洗细胞。
[0011]DMSO即二甲基亚讽。二甲基亚讽(Dimethyl sulfoxide或DMS0),无色液体，重要的极性非质子溶剂。它可与许多有机溶剂及水互溶。二甲基亚砜具有极易渗透皮肤的特殊性质，造成使用人员感觉类似牡蛎般的味道。[0012]EGF:上皮生长因子，表皮细胞生长因子是人体内的一种活性物质，由53个氨基组成的活细胞，藉由刺激表皮细胞生长因子受体之酪氨酸磷酸化，达到修补增生肌肤表层细胞，据说对受伤、受损之表皮肌肤拥有绝佳之疗效。其最大特点是能够促进细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。EGF还能止血，并具有加速皮肤和粘膜创伤愈合，消炎镇痛，防止溃疡的功效。EGF的稳定性能极好，在常温下不易失散流动，能与人体内各种酶形成良好的协调效应。最初的EGF主要被运用于医学领域，主要用于促进受损表皮的修复与再生，如治疗烧伤、烫伤等。
[0013]FGF:在头发的根部存在一种负责制造“FGF”蛋白质的基因，“人类基因组计划”科学家称之为“FGF基因”，这是影响黑发生长的根源。人类基因组计划(Human GenomeProject, HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、日本和中国等科学家共同参与了这一价值达30亿美元的人类基因组计划。
[0014]Nestin:巢蛋白，是一种中间丝类型的蛋白，能够特异性的表达在神经上皮干细胞上一种分子标记物；可能对神经元的分化有作用。NESTIN仅在胚胎发育早期的神经上皮表达，出生后表达就停止。为神经干细胞的特征性标志物。
[0015]具体包括有以下步骤:
(1)胚胎大鼠脊髓神经干细胞的分离和扩增
严格无菌条件下，在DMEM细胞培养基中取出胚胎大鼠脊髓，用HBSS冲洗，剪碎，移入含DMEM/F12、EGF、FGF的全生长细胞培养基，用吸管吹打制成单细胞悬液，移入培养瓶；原代细胞克隆形成后再次机械分离制成单细胞悬液，每7-10天传代一次，方法同前；低温保存时，全生长细胞培养基中加入10%DMS0 ;在传代同时并进行克隆形成实验，用免疫细胞化学方法检测Nestin、ECAM确定细胞类型；
(2)依赖EGF和FGF的神经球细胞在不同外源性因子作用下的培养及分化 依赖EGF和FGF的神经球细胞转移到12孔细胞培养板，在EGF或FGF和以下一种或数种因子联合作用下培养4-8天:H)GF、NT-3, BDNF, NGF, EGF、FCS, FGF、顺式视黄酸；免疫细胞化学方法检测Nestin、ECAM、NeuN确定细胞类型；
(3)含HIF-1α、BDNF序列的重组腺相关病毒的构建
1)鼠HIF-1α的克隆:鼠肝癌细胞系IfepalclcTjaffi总RNA? HIF-1 a cDNA (核心序列约2.5Kb) 重组质粒一转化细菌一筛选菌落，
2)质粒pGEM-3zf(+)-GDNF由中科院分子免疫中心提供，转化细菌一筛选菌落，
3)目的基因的阳离子脂质体的包装和测定，
4)表达载体的鉴定:酶切、琼脂糖凝胶电泳及聚丙烯酰胺电泳分析HIF-1α、GDNF基因并验证其表达的正确性；
(4)大鼠脊髓神经干细胞的体外转染及分析:含目的基因的阳离子脂质体与培养的神经干细胞共同孵育I小时，然后置于含G418的细胞培养板培养24小时，收集新霉素抗性克隆；台盘蓝染色，至移植时，在HBSS中分离成单细胞悬液，重新放于全生长细胞培养基，确定细胞活性及密度为IO5细胞/μ 1，移植后，剩余的细胞行组织化学法及免疫细胞化学法检测类型等，并检测β -gal与⑶NF、HIF-1 α表达的相关性；
(5)表达产物的测定和生物活性 分析:采用Westernblot法和Slot blot法验证⑶NF、HIF-1 α的表达，应用Ε8鸡胚DRG检测⑶NF的生物活性；采用Western blot法、免疫组织化学法从蛋白质水平测定HIF-1 α的生物活性。
[0016]胶质源性神经生长因子(Glialcellline-derived neurotrophic factor, GDNF)主要由神经元产生，对中枢神经系统细胞的分化、发育、生长等方面具有重要的作用。在脊髓损伤动物模型上应用表明，它能够防止脊髓神经元萎缩、促进轴突生长及促进神经通路的再生。低氧诱导因子I ct (hypoxia-1nducible factor I α，HIF-1 α )作为转录因子，能反式作用于氧调苄基因的顺式调控序列，促进无氧代谢、血管再生、血管扩张、红细胞生成增加等，从而使受损脊髓更好的耐受缺血缺氧，为脊髓损伤的恢复创造时机。
[0017]阳离子脂质体是一种拥有质子氨基群和每个3段区域就有一个高阳离子区的化合物，其可形成微小颗粒通过碰撞等物理行为经过细胞胞吞进入细胞内，另外，脂质体包含类似细胞内的核小体和溶酶体的结构能保护DNA免于胞内核酸酶的降解，稳定高效的转导目的基因进入细胞。
[0018]基于上述考虑，将表达胶质源性神经生长因子(⑶NF)及低氧诱导因子Ia(HIF-Ια )的胚胎大鼠脊髓神经干细胞采用脊髓内细胞移植的方法，通过大鼠脊髓损伤模型，以观察基因修饰神经干细胞对损伤脊髓轴突再生、神经元再生的影响，以及神经干细胞在体内的分化；并观察大鼠脊髓损伤治疗前后行为功能的变化，来评价基因修饰神经干细胞脊髓内细胞移植对大鼠脊髓损伤的作用。
[0019]上述方法的得到的干细胞进行动物实验:
1:所有动物都应用环孢菌素A，以抑制机体的免疫反应。
[0020]2:动物模型的制作:采用显微神经外科手术方法，行大鼠颈髓3-4右侧半部分切除，包括全部脊髓侧索、部分腹侧索及脊髓灰质(正常对照组不行手术)。将含有细胞培养基的Gelfoam填入脊髓损伤创腔，然后用微量注射器(针头直径50 μ m)注入细胞密度为IO5细胞/μ I的细胞培养基10 μ I ;用10号丝线缝合硬脊膜，逐层缝合肌肉和皮肤。
[0021]3:动物分组:体重250克-300克、雌性、SD (Sprague Dawley)大鼠282只，分成五组:
A组(20只):正常对照组，其中3只行FG逆行示踪法显示红核神经元，6只行BDA顺行示踪法显示红核脊髓束纤维，其余行细胞凋亡检查。
[0022]B组(64只):损伤对照组，予Gelform治疗，分I月、2月、6月三个时间组，每个时间组大鼠分别行FG、BDA、TUNEL、流式细胞仪、免疫化学等检查；每周一次观察大鼠行为变化，并取8只大鼠于13周、8只大鼠于24周重新行脊髓损伤并每周一次观察其行为变化，8周后处死，行FG、BDA、免疫化学检查。
[0023]C组(70只):⑶NF、HIF_1 α双基因修饰脊髓神经干细胞治疗组，并分I月、2月、6月三个时间组，每个时间组大鼠分别行FG、BDA、TUNEL、流式细胞仪、免疫化学等检查；每周一次观察大鼠行为变化，并取8只大鼠于13周、8只大鼠于24周重新行脊髓损伤并每周一次观察其行为变化，8周后处死，行FG、BDA、免疫化学检查。另取6只大鼠于I周后处死，以评价转基因表达。
[0024]D组(64只):单纯脊髓神经干细胞治疗组，并分I月、2月、6月三个时间组，每个时间组大鼠分别行FG、BDA、 TUNEL、流式细胞仪、免疫化学等检查；每周一次观察大鼠行为变化，并取8只大鼠于13周、8只大鼠于24周重新行脊髓损伤并每周一次观察其行为变化，8周后处死，行FG、BDA、免疫化学检查。[0025]E组(64只):单纯基因治疗组，并分I月、2月、6月三个时间组，每个时间组大鼠分别行FG、BDA、TUNEL、流式细胞仪、免疫化学等检查；每周一次观察大鼠行为变化；并取8只大鼠于13周、8只大鼠于24周重新行脊髓损伤并每周一次观察其行为变化，8周后处死，并行FG、BDA、免疫化学检查。
然后对标本处理及检测:
接受各种处理的动物，常规饲养，分时处死动物，按不同要求处理标本，进行检测。
[0026]1:采用X-gal组织化学法、Western blot法和Slot blot法、免疫组织化学法检测GDNF、HIF-1的表达、移植细胞的存活及在体内的分化、与创腔的关系、与再生神经纤维的关
系O
[0027]2:免疫组织化学法、组织化学法检测宿主对移植物的反应，创腔组织修复类型。
[0028]3:组织化学法、免疫组织化学法检测体内的红核脊髓束纤维、再生的红核脊髓束纤维，与移植物的关系、与周围组织的关系。
[0029]4:组织化学法、免疫组织化学法检测体内的红核神经元及再生的红核神经元，并计数，观察其形态。
[0030]5 =TUNEL末端标记法检测各组组织切片细胞凋亡，流式细胞仪计数法测定各组细胞凋亡率。
[0031]6:采用大鼠自发垂直探询法检测大鼠前肢的活动，同时监测动物的运动诱发电位(MEP)和脊髓体感诱发电位(SCEP)。13周及24周后重新行大鼠颈髓3_4右侧半部分切除，重新观察动物行为的变化。并检测体内的红核脊髓束纤维、再生的红核脊髓束纤维、红核神经元、神经干细胞的存活及分化。
【权利要求】
1.干细胞在外源性神经营养因子作用下分化及鉴定的方法，包括有以下步骤: (1)胚胎大鼠脊髓神经干细胞的分离和扩增 严格无菌条件下，在DMEM细胞培养基中取出胚胎大鼠脊髓，用HBSS冲洗，剪碎，移入含DMEM/F12、EGF、FGF的全生长细胞培养基，用吸管吹打制成单细胞悬液，移入培养瓶；原代细胞克隆形成后再次机械分离制成单细胞悬液，每7-10天传代一次，方法同前；低温保存时，全生长细胞培养基中加入10%DMS0 ;在传代同时并进行克隆形成实验，用免疫细胞化学方法检测NestiruECAM确定细胞类型； (2)依赖EGF和FGF的神经球细胞在不同外源性因子作用下的培养及分化 依赖EGF和FGF的神经球细胞转移到12孔细胞培养板，在EGF或FGF和以下一种或数种因子联合作用下培养4-8天:H)GF、NT-3, BDNF, NGF, EGF、FCS, FGF、顺式视黄酸；免疫细胞化学方法检测Nestin、ECAM、NeuN确定细胞类型； (3)含HIF-1a、BDNF序列的重组腺相关病毒的构建
1)鼠HIF-1α的克隆:鼠肝癌细胞系IfepalclcTjaffi总RNA? HIF-1 a cDNA (核心序列约2.5Kb) 重组质粒一转化细菌一筛选菌落， 2)质粒pGEM-3zf(+)-GDNF由中科院分子免疫中心提供，转化细菌一筛选菌落， 3)目的基因的阳离子脂质体的包装和测定， 4)表达载体的鉴定:酶切、琼脂糖凝胶电泳及聚丙烯酰胺电泳分析HIF-1a、GDNF基因并验证其表达的正确性； (4)大鼠脊髓神经干细胞的体外转染及分析:含目的基因的阳离子脂质体与培养的神经干细胞共同孵育I小时，然后置于含G418的细胞培养板培养24小时，收集新霉素抗性克隆；台盘蓝染色，至移植时，在HBSS中分离成单细胞悬液，重新放于全生长细胞培养基，确定细胞活性及密度为IO5细胞/μ 1，移植后，剩余的细胞行组织化学法及免疫细胞化学法检测类型等，并检测β -gal与⑶NF、HIF-1 α表达的相关性； (5)表达产物的测定和生物活性分析:采用Westernblot法和Slot blot法验证⑶NF、HIF-1 α的表达，应用Ε8鸡胚DRG检测⑶NF的生物活性；采用Western blot法、免疫组织化学法从蛋白质水平测定HIF-Ια的生物活性。
【文档编号】C12N15/861GK103695374SQ201310724168
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】陈茂华 申请人:温州市中心医院